黃愛華 張萍萍 張 斌 馬步青 關(guān)云謙 周逸丹*

(1.浙江省杭州市第三人民醫(yī)院急診科，杭州310000;2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞生物室，北京100053)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是在機體內(nèi)廣泛存在的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。MSC免疫源性很低，只表達主要組織相容性抗原(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子，不表達MHCⅡ類分子，同種異體移植后不會引起顯著的免疫排斥反應(yīng)。MSC具有高效的免疫調(diào)節(jié)作用，能減弱體內(nèi)非特異的炎性反應(yīng)，近些年來在疾病動物模型和臨床研究上MSCs被嘗試應(yīng)用于治療慢性炎性反應(yīng)和免疫紊亂相關(guān)的疾?。?］。

具體到神經(jīng)系統(tǒng)，MSC能夠減少腦內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤，減弱小膠質(zhì)細(xì)胞激活等，另外，MSC還能產(chǎn)生或者促使宿主產(chǎn)生多種營養(yǎng)性細(xì)胞因子，促進缺血區(qū)組織的修復(fù)。已經(jīng)有研究［2］發(fā)現(xiàn)MSC經(jīng)過靜脈移植治療動物腦梗死模型會產(chǎn)生一定的治療效果，表現(xiàn)為梗死體積減小、動物行為學(xué)改善，治療的機制和MSC減輕腦內(nèi)以小膠質(zhì)細(xì)胞激活為核心的炎性反應(yīng)以及產(chǎn)生多種細(xì)胞因子有關(guān)。

MSC是一種成體干細(xì)胞，體外培養(yǎng)經(jīng)過多次傳代后，也會發(fā)生衰老的現(xiàn)象。衰老往往意味著功能的下降，對治療效果造成不利影響［3］。具體到用人類MSC治療大鼠腦梗死的實驗研究，還缺乏同時觀測不同衰老程度的MSC細(xì)胞植入腦內(nèi)后的營養(yǎng)作用和腦內(nèi)炎性反應(yīng)的實驗研究，對比不同衰老程度的MSC治療腦梗死的療效有利于今后研究提高細(xì)胞治療療效的方法［4］。

本實驗中筆者采用不同代次人類骨髓MSC移植給大鼠腦梗死模型的方法，觀察移植后療效以療效產(chǎn)生機制。采用連續(xù)傳代的復(fù)制性衰老法可制作MSC體外衰老模型。β-半乳糖苷酶(β-gal)的活性是最廣泛使用的檢測衰老的標(biāo)記。原理是隨著傳代次數(shù)的增加衰老不斷進行，衰老細(xì)胞的溶酶體內(nèi)β-半乳糖苷酶水平增高，β-gal染色的細(xì)胞比例會增加，染色會逐漸增強［5］。

療效產(chǎn)生機制方面主要觀察腦內(nèi)以小膠質(zhì)細(xì)胞增生為代表的炎性反應(yīng)，還有以腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、胰島素樣生長因子(insulin like growth factor-1，IGF-1)等為代表的營養(yǎng)因子產(chǎn)生兩方面的情況。

腦梗死發(fā)生后，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活程度在一定程度上代表了腦內(nèi)炎性反應(yīng)的強弱程度。小膠質(zhì)細(xì)胞可認(rèn)為是腦中潛在的巨噬細(xì)胞和腦缺血后腦內(nèi)炎性反應(yīng)密切相關(guān)。小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血后幾分鐘激活，同時產(chǎn)生多種促炎性反應(yīng)因子，如白介素-1β(interleukin，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα，TNF-α)等又可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的進一步活化［6］。在腦缺血發(fā)生后抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性，可減少腦梗死體積，對腦組織起保護作用［7］。

根據(jù)文獻［8］報道，眾多營養(yǎng)性的細(xì)胞因子可能是腦梗死后發(fā)揮修復(fù)作用的重要因素。這些因子中作用比較重要的兩個因子可能是BDNF和IGF-1。腦室內(nèi)或經(jīng)靜脈注射BDNF，都可以有效地減小梗死體積。如果將數(shù)種營養(yǎng)性細(xì)胞因子的基因分別轉(zhuǎn)入MSC然后移植到腦實質(zhì)內(nèi)，轉(zhuǎn)入BDNF、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNF)的MSC移植也有明顯的治療效果，而神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin 3，NT3)，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)則療效不明顯［9］。無論是腦內(nèi)的還是血液循環(huán)中的IGF-1都有神經(jīng)保護作用，而且IGF-1可以通過血-腦脊液屏障。腦梗死后梗死灶的核心區(qū)可以發(fā)現(xiàn)IGF-1的升高，如果梗死后立體定向給予動物IGF-1，可以明顯觀察到治療效果;即使靜脈輸注IGF-1也可以改善動物的行為缺損，并且減小梗死體積［10］。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本和實驗動物

人骨髓來自產(chǎn)科自然流產(chǎn)的胎兒，周齡為18～20周。獲得產(chǎn)婦知情同意和醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。SPF級SD雄性大鼠120只(體質(zhì)量280g左右)，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證編號:SYXK(京)2015-0016。大鼠自由進水進食。動物實驗分3部分，每部分40只大鼠，分為4組，分別是假手術(shù)組(Sham)，缺血對照組〔在缺血后尾靜脈給予0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯化鈉注射液〕、缺血后尾靜脈給予第4代MSC組和第10代MSC組。第一部分實驗對比移植后2 d的梗死體積，第二部分實驗用免疫組化染色鑒定移植后4 d小膠質(zhì)細(xì)胞激活;第三部分實驗檢測移植后4d各組動物腦內(nèi)營養(yǎng)性細(xì)胞因子的量。動物行為學(xué)評價在第二、三部分實驗進行。

1.1.2 試劑

低糖DMEM、DMEMα、胎牛血清、青鏈霉素、谷氨酰胺、0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶、DPBS等購自美國Life Technology公司。人MSC流式鑒定抗體試劑盒購自R＆D公司。大鼠BDNF、IGF-1的ELISA檢測試劑盒購自B＆D公司。抗小膠質(zhì)細(xì)胞CD 68抗體購自美國Cell signaling公司。TTC(2，3，5一氯化三苯基四氮唑)購自美國Sigma公司。腦組織勻漿液購自美國Invitrogen公司。

1.1.3 主要儀器

美國Thermo超凈工作臺、培養(yǎng)箱，美國BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀。日本Nikon相差顯微鏡。白洋離心機。美國Bio-Rad 3500全波長酶標(biāo)儀。美國Surgivet小動物麻醉機。德國Zeiss手術(shù)顯微鏡，Leica SPⅡ共聚焦顯微鏡和照相系統(tǒng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 胎兒骨髓MSC的提取和流式細(xì)胞儀鑒定

在無菌條件下，分離自然流產(chǎn)胎兒的肱骨、股骨和脛骨。用DMEM低糖沖洗骨髓到培養(yǎng)皿中，完全培養(yǎng)基〔DMEM低糖+10%(體積分?jǐn)?shù))FBS〕重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度大約為1×106/mL培養(yǎng)基。37℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)48 h后，輕輕晃動培養(yǎng)皿，去掉未貼壁細(xì)胞，DPBS清洗2次，加入完全培養(yǎng)基。以后每2.5 d換液，待細(xì)胞長到80%融合度時，用0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶消化后1∶3傳代。

取第4和10代生長狀態(tài)良好的MSC。用胰酶消化成單細(xì)胞并計數(shù)，按照MSC表面標(biāo)志抗體檢測試劑盒的說明進行鑒定。

1.2.2 MSC衰老染色

待細(xì)胞長至50%～70%滿時棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞2次，每次3 min，小心去除PBS。加入1×Fixation Buffer，室溫下固定細(xì)胞6～7 min。在固定細(xì)胞的同時配制衰老染液，并用0.22 μm的濾器過濾待用。棄去固定液，3 min×3次洗滌細(xì)胞。每孔中加入過濾后的衰老染液，密封，37℃孵育12 h，棄去染液，洗滌細(xì)胞3 min×3次。顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 動物模型和細(xì)胞移植

采用遠(yuǎn)端大腦中動脈梗阻(distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO)模型［11］。模型組開顱電凝大腦中動脈遠(yuǎn)端使其閉合，并夾閉雙側(cè)頸總動脈30 min;假手術(shù)組開顱并頸部切開，但不對大腦中動脈、雙側(cè)頸總動脈進行操作。其余步驟與模型組相同。

MSC細(xì)胞經(jīng)0.05%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶消化后，0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液洗去殘留培養(yǎng)基，然后取106細(xì)胞重懸在0.1 mL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液中置于冰上備用。缺血對照組在梗死后1 h經(jīng)尾靜脈輸注0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，細(xì)胞治療組于頸缺血后1 h經(jīng)尾靜脈注入106人類骨髓MSC或者MNC。

1.2.4 梗死體積測定

于腦梗死后48h，將大鼠麻醉后直接取腦，去除小腦和嗅球。將大腦放在冰預(yù)冷的平皿上從前向后每隔2 mm切一片，通常切成6～7片。將切片置于2%TTC中染色，37℃，20 min后拍照。TTC染色完成后使用Image J計算機圖像分析系統(tǒng)計算大鼠腦梗死體積。首先計算出每個層面腦片的梗死面積，為避免因腦水腫產(chǎn)生數(shù)據(jù)誤差，筆者使用梗死體積=(對側(cè)半球面積-患側(cè)正常腦組織面積)×腦片厚度。然后計算相對梗死體積，相對梗死體積=梗死總體積/對側(cè)半球總體積。

1.2.5 大鼠腦梗死區(qū)BDNF、IGF-1的ELISA檢測

大鼠腦梗死模型細(xì)胞移植后7 d，取梗死區(qū)腦組織，4℃預(yù)冷的PBS洗掉血漬，用濾紙吸掉PBS，加入組織勻漿液充分勻漿，4℃，15 000 r/min離心1 h，取上清。按照ELISA試劑盒的要求檢測腦組織中BDNF、IGF-1的量。

1.2.6 行為學(xué)測試

1)圓柱容器實驗(cylinder test)

用于對比缺血后前肢使用的差異，大鼠放入玻璃燒杯，直徑15 cm，高22 cm，這樣的空間促使大鼠經(jīng)常用后肢站立(rearing behavior)，然后用前肢接觸玻璃容器壁。在10 min內(nèi)連續(xù)觀察，發(fā)生小于20次觸壁事件的大鼠去除。統(tǒng)計依據(jù)為:按照公式(健側(cè)前肢運動-患側(cè)前肢運動)/(健側(cè)前肢運動+患側(cè)前肢運動+雙側(cè)運動)計算出的數(shù)值。

2)爬格實驗 (grid walking test)

將大鼠放置在金屬網(wǎng)格上行走，網(wǎng)眼大小為3.3 cm×3.3 cm，計數(shù)大鼠爬行1.5 m的距離其左側(cè)前肢掉下網(wǎng)格的次數(shù)。計算公式為:(腦病變對側(cè)前爪的錯步數(shù)-病變同側(cè)前爪的錯步數(shù))。其分值如為正數(shù)表明腦病變對側(cè)功能缺損，如為負(fù)數(shù)表明腦病變同側(cè)功能缺損。

1.2.7 大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞CD68染色和定量分析

大鼠腦梗死模型細(xì)胞移植后4 d，深麻醉后4%多聚甲醛灌注固定。本實驗采用的dMCAO模型梗死灶在頂、顳葉皮質(zhì)，檢測范圍是前囟向后4 mm內(nèi)的腦組織，此范圍的腦組織皮質(zhì)都含有梗死灶。經(jīng)連續(xù)40 μm厚度冠狀切片之后，可得100張切片，每隔10張取一張進行分析。

切片用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗2次，使用含有0.3%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100的 PBS孵育30 min，使用封閉液〔含有1.5%(體積分?jǐn)?shù))的山羊血清和1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA的0.01 mol/L PBS緩沖液〕室溫孵育1 h，使用含有Anti-CD68抗體的封閉液4℃孵育過夜。次日，用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗3次，使用含有Cy3熒光標(biāo)記的二抗(1∶200)的封閉液室溫孵育1 h，用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗3次。使用濃度為100 ng/mL的 DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole)PBS溶液做細(xì)胞核染色15 min，用0.01 mol/L PBS緩沖液清洗3次，用含有10%(體積分?jǐn)?shù))甘油的0.01 mol/L PBS溶液封片。

用100×熒光顯微鏡對選取的切片的梗死區(qū)皮質(zhì)照相，Image J軟件標(biāo)記梗死區(qū)皮質(zhì)1 mm×1 mm范圍，并計算檢測范圍內(nèi)CD68染色的豐度(abundance)。梗死后輸注0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氯化鈉注射液的對照組、梗死后移植組分別和假手術(shù)組的豐度值比較所得的比值為相對豐度(relative abundance)［12-13］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 10.0處理數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人骨髓MSC采集、培養(yǎng)和流式細(xì)胞鑒定

分離的原代人骨髓MSC培養(yǎng)3～5 d，可見有梭形、多角形細(xì)胞貼壁。原代培養(yǎng)第10～12天，培養(yǎng)細(xì)胞達到80%融合，此時即可進行1∶3傳代，之后每3～5 d傳代一次。傳代到第10代的MSC發(fā)生一些細(xì)胞形態(tài)的特征性改變，包括細(xì)胞大而扁平、核質(zhì)比下降，胞內(nèi)顆粒增加(圖1A)。

流式細(xì)胞儀檢測第4和10代的人骨髓MSC的特異性表面抗原類似。以第10代為例，不同代次的BM-MSC 細(xì)胞表面都表達 CD90、CD73、CD44、CD105(圖1B-E)，其中第4代細(xì)胞的陽性率都高于96%，第10代細(xì)胞的檢測陽性率為93% ～96%，第4和10代差異無統(tǒng)計學(xué)意義。第4、10代細(xì)胞都不表達CD34、CD19、CD45、CD11b;而且也不表達 MHC-Ⅱ類分子—HLA-DR(圖1F)。

2.2 MSC衰老的鑒定

除進行形態(tài)觀察外，體外復(fù)制性衰老的MSC經(jīng)過β-gal染色后，著色細(xì)胞的比例從第4代(圖2A)的(4.21±1.35)% 增加到第10代(圖2B)的(52.43±6.47)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而且第10代細(xì)胞的著色程度明顯深于第4代。

2.3 梗死體積測定

術(shù)后48 h，深麻醉并立即處死大鼠取腦進行TTC染色，觀察梗死體積。各實驗組大鼠的代表性TTC染色如圖3。缺血對照組的梗死體積百分比為(35.62±5.40)%(圖3A);植入第4代人骨髓MSC的相對梗死體積達到(31.26±4.32)%(圖3B);而植入第10代MSC細(xì)胞的相對梗死體積為(34.14±3.89)%(圖3C);經(jīng)過統(tǒng)計檢驗，第4代MSC細(xì)胞治療組比缺血對照組的梗死體積顯著縮小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。第10代人MSC細(xì)胞移植后對動物梗死體積沒有顯著影響(P＞0.05)(圖3D)。

2.4 腦梗死區(qū)中BDNF、IGF-1的測定

經(jīng)過靜脈植入的人類細(xì)胞可能促使大鼠腦內(nèi)的細(xì)胞因子濃度升高。其中BDNF、IGF-1是已知腦梗死后動物腦內(nèi)產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子。可見細(xì)胞移植組和給予0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液的缺血對照組相比，第4代MSC治療組顯著提高了這2種細(xì)胞因子的濃度(P＜0.05)(圖4A-B);第10代MSC沒有增高BDNF、IGF-1的濃度。

2.5 行為學(xué)檢測

本實驗中細(xì)胞移植對行為學(xué)的改善只在移植后2 d較為明顯，而第4天則沒有觀察到(圖5)。

圖1 人骨髓MSC培養(yǎng)及特征性表面抗原流式細(xì)胞儀檢測Fig.1 Human bone marrow MSC culture and specific surface marker identification by cytometry

腦梗死發(fā)生后，梗死對側(cè)運動功能受損，在圓柱容器實驗中梗死側(cè)肢體的使用頻率比對側(cè)顯著升高，根據(jù)公式計算可得梗死后第2天為(20.44±7.09)%，給予第4代人骨髓MSC可以在移植后第2天達到(14.78±6.83)%，和對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);給予第10代MSC達到(16.78±4.76)%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。移植后第4天，缺血對照組測試得分(15.56±1.94)%，給予人MSC組達到(14.22±2.63)%，而給予第10代組(15.0±7.22)%，移植組和缺血對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5A)。

爬格實驗顯示出類似的治療效果。腦梗死后第2天，腦病變對側(cè)前爪的錯步數(shù)明顯增加，梗死后給予0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液的對照組兩側(cè)前肢錯步數(shù)為6.50±1.26，MSC移植則只能夠在梗死后第1天顯著改善大鼠的行為缺損，評分為5.13±0.96(P＜0.05);此時的第10代細(xì)胞移植后動物錯步數(shù)為5.53±1.14，和缺血對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 體外培養(yǎng)MSC的衰老鑒定Fig.2 Identification of in vitro cultured hMSC senescence

圖3 人MSC經(jīng)尾靜脈移植減小大鼠急性腦梗死模型的梗死體積Fig.3 Intravenous transplantation of hMSCs through caudal vein decreased the infarct volume of acute rat cerebral ischemia

圖4 hMSC細(xì)胞移植對大鼠腦梗死皮質(zhì)區(qū)BDNF、IGF-1量的影響Fig.4 Transplantation of hMSC increased the BDNF、IGF-1 in the core area of ischemia rats

移植后第4天，缺血對照組錯步數(shù)為5.53±1.26，第4、10代細(xì)胞移植組分別為4.9±1.18和5.18±1.26，移植組大鼠行為都沒有明顯改善(圖5B)。

圖5 不同代次人骨髓MSC移植對腦梗死大鼠行為的影響Fig.5 The effect of transplantation hMSC at passage 4 and 10 on the behavioral outcome of cerebral ischemia rats

2.6 腦梗死區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)的樞紐，其激活狀態(tài)通?？梢源砟X內(nèi)炎性反應(yīng)的強弱。圖6示皮質(zhì)梗死區(qū)CD68抗體識別的小膠質(zhì)細(xì)胞，CD68染色陽性細(xì)胞通常被認(rèn)為處于激活狀態(tài)。腦梗死發(fā)生后，缺血對照組的皮質(zhì)梗死核心區(qū)CD68的豐度顯著升高，可達到假手術(shù)對照組的(2.75±0.51)倍(圖6A，D)。給予細(xì)胞治療后，第4代人MSC細(xì)胞可使CD68的豐度降低到假手術(shù)組的(1.97±0.32)倍(圖6B，D)，給予第10代MSC細(xì)胞的治療組能夠降低CD68的豐度到假手術(shù)組的(2.35±0.43)倍(圖6C，D)。只有第4代MSC顯著減低了小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。

3 討論

腦梗死后的治療還沒有特別有效的手段，特別是腦梗死發(fā)生早期的腦保護和發(fā)生后期的損傷修復(fù)目前仍是個難題［14-15］。腦梗死修復(fù)時需要重建血管系統(tǒng)，提供營養(yǎng)因子，改善腦內(nèi)慢性炎性反應(yīng)環(huán)境等，能夠同時滿足這些需要的只有細(xì)胞移植途徑。

MSC細(xì)胞體外共培養(yǎng)可以有效地抑制淋巴細(xì)胞增生和促炎性因子的釋放，已經(jīng)有應(yīng)用于移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)和風(fēng)濕病的治療。另外，MSC具有很強的旁分泌能力，可為損傷或新生的組織細(xì)胞提供多種重要的營養(yǎng)物質(zhì)和保護因子，這些特性使MSC具有參與臨床治療腦梗死的可能。

作為一種成體干細(xì)胞，MSC不具有無限增生能力。體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞在分裂到一定次數(shù)時即逐漸喪失增生能力并最終出現(xiàn)永久性生長停滯，但細(xì)胞并沒有死亡的現(xiàn)象，就是體外復(fù)制性衰老。不難推斷，隨著MSC的衰老，其各種功能都可能下降，進行腦梗死治療的療效會相應(yīng)下降，但這一推斷還沒有經(jīng)過詳細(xì)的檢驗。

圖6 不同代次MSC移植對大鼠腦皮質(zhì)梗死區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞CD 68染色的影響Fig.6 CD 68 staining of the infarct cortex core area after the transplantation of hMSC at passage 4 and 10

本實驗發(fā)現(xiàn)，MSC培養(yǎng)擴增后通過流式細(xì)胞儀鑒定特征性的表面抗原，第4和10代的人骨髓MSC的免疫表型差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這就可以確定植入的是人MSC。通過連續(xù)體外傳代，第10代MSC相對第4代發(fā)生了明確的衰老現(xiàn)象，表現(xiàn)為β-gal染色比例增加。

從治療效果上看，只有第4代細(xì)胞減小了梗死體積，且在移植后第2天改善了動物的行為學(xué)缺損。第10代細(xì)胞沒有顯著減小梗死體積，第2、4天對動物行為有改善作用，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？梢悦鞔_，第10代細(xì)胞顯示出一些治療效果的傾向，但第4代細(xì)胞的治療效果明顯好于第10代細(xì)胞。

目前認(rèn)為細(xì)胞移植治療腦梗死產(chǎn)生療效的效果主要有3點:1)植入細(xì)胞分化成為神經(jīng)細(xì)胞;現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)為這不是主要因素。以MSC為例，植入的MSC大多數(shù)會在肺部滯留，而且植入細(xì)胞的信號迅速減弱，通常在移植后1周消失，這說明靜脈輸入的細(xì)胞最終入腦的非常少，即使植入的細(xì)胞分化成為神經(jīng)元，其總量對于治療而言也太少［16］;2)植入細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)微環(huán)境的作用。現(xiàn)在研究的熱點主要是MSC細(xì)胞的減弱炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)周圍微環(huán)境的作用［4］。3)植入細(xì)胞產(chǎn)生多種營養(yǎng)性的細(xì)胞因子，可以保護神經(jīng)細(xì)胞，促進血管新生等。

腦內(nèi)炎性反應(yīng)是腦梗死后腦內(nèi)組織損傷的重要機制之一，腦內(nèi)炎性反應(yīng)的標(biāo)志是淋巴細(xì)胞浸潤和小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活［17-18］，其中激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會通過細(xì)胞間相互作用及分泌細(xì)胞因子參與逐漸增強的炎性反應(yīng)［19-21］。

小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性染色可以用Iba-1和CD68(ED-1)，通常情況下認(rèn)為Iba-1代表靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞［22-23］，這些細(xì)胞可能在損傷早期起到了一定的保護作用［24］，但最近也有研究［13］成果把 Iba-1 當(dāng)做激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。CD68通常被認(rèn)為是激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，是腦內(nèi)炎性反應(yīng)損傷的重要參與者［25］。所以在本實驗中，筆者主要檢測了CD68陽性的小膠質(zhì)細(xì)胞。

本實驗中發(fā)現(xiàn)第4代MSC細(xì)胞都具有減弱梗死區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用，而且第4代細(xì)胞的作用強于第10代細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)原理近年來得到了廣泛深入的研究，直接腦內(nèi)注射的MSC可以減輕腦梗死大鼠腦內(nèi)的炎性反應(yīng)［2］;靜脈輸注的MSC亦可以減弱腦內(nèi)炎性反應(yīng)，Wang等［26］在腦梗死后24 h用人MSC細(xì)胞系B10經(jīng)靜脈輸注后，發(fā)現(xiàn)在腦梗死核心區(qū)，ED-1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞被顯著下調(diào)，參與炎性反應(yīng)的重要的中間分子(Nuclear factor-κB，NF-κB)被下調(diào)，受 NF-κB 調(diào)節(jié)的 IL-1β、MCP-1，誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)等的表達都顯著下降。這些研究和本實驗的差別在于細(xì)胞植入時間和觀察時間等等。根據(jù)筆者的實驗結(jié)果并綜合這些研究成果，可以肯定，MSC移植治療腦梗死的確具有一定的治療效果，而且治療效果和MSC抑制腦內(nèi)炎性反應(yīng)有關(guān)。

另一個產(chǎn)生療效的機制是植入細(xì)胞產(chǎn)生或者誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生營養(yǎng)性的細(xì)胞因子。靜脈輸注hMSC會導(dǎo)致心肌梗死模型大鼠心臟內(nèi)多種細(xì)胞因子升高，例如BDNF、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子(glial cell-line derived neurotrophic factor，GDNF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等［27］。

植入的細(xì)胞可以產(chǎn)生人類來源的細(xì)胞因子，也可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生大鼠源性的細(xì)胞因子。具體到移植治療腦梗死，目前的研究結(jié)果更多地傾向于認(rèn)為是大鼠源性的營養(yǎng)性細(xì)胞因子在發(fā)揮減輕梗死后腦組織損傷的作用，例如有實驗［28］發(fā)現(xiàn)，靜脈輸注人類MSC，在腦內(nèi)梗死區(qū)周邊只有IGF-1略有升高，其他的因子升高不明顯，而植入的MSC卻促進了多種大鼠源性的細(xì)胞因子的顯著升高。Steinberg等［13］將5×106人類臍帶來源的MSC細(xì)胞或者單個核細(xì)胞經(jīng)動脈植入大鼠，沒有檢測到明顯的人類來源的細(xì)胞因子，筆者的實驗中移植的人類細(xì)胞數(shù)量更少，只有1×106，所以直接檢測了大鼠源性細(xì)胞因子。

總之，第10代細(xì)胞并沒有顯著治療效果，造成這一現(xiàn)象的原因首先可能是，靜脈植入的MSC細(xì)胞對大鼠腦梗死區(qū)的作用包括營養(yǎng)和減少小膠質(zhì)細(xì)胞兩個方面，第10代細(xì)胞不能有效地抑制小膠質(zhì)細(xì)胞，也沒有明顯地促使動物腦內(nèi)營養(yǎng)性細(xì)胞因子增加。這一結(jié)果對臨床實驗中選擇MSC的傳代次數(shù)有重要的參考意義。本實驗還提示了今后的一些研究方向，例如，除了BDNF和IGF-1，還有哪些營養(yǎng)性細(xì)胞因子參與了MSC對腦梗死腦組織的修復(fù);小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)炎性反應(yīng)的中樞，其具體通過哪些因素來對腦組織造成損傷;除了小膠質(zhì)細(xì)胞之外，MSC是否有效抑制了炎性反應(yīng)的其他方面，例如中性粒細(xì)胞浸潤等。

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