程 呈 吳 謙 盧 晶 仇海燕 李 倩 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100730;2.糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京100730;3.北京大學生命科學院，北京100871)

RFX轉(zhuǎn)錄因子(regulatory factor X-box binding)，是一類翼形螺旋轉(zhuǎn)錄因子。近年來的研究［1-3］顯示，RFX轉(zhuǎn)錄因子與某些人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在哺乳動物中，RFX基因與保守的順式調(diào)節(jié)元件X-box的結(jié)合在27年前被首次發(fā)現(xiàn)［1］。隨后，RFX家族的成員(RFX1～7)在哺乳動物中被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，其中RFX6可以通過RT-PCR技術(shù)在人類和小鼠的胰腺中檢測到，而其他的RFX家族成員則在體內(nèi)廣泛表達［2］。研究［3］發(fā)現(xiàn)，RFX6 純合突變的患者呈現(xiàn)出新生兒糖尿病合并消化系統(tǒng)缺陷的臨床癥狀，包括胰腺發(fā)育不全或呈環(huán)狀，腸閉鎖或狹窄，腸旋轉(zhuǎn)不良，膽囊發(fā)育不全或缺如等，這些表型被稱之為Mitchell-Riley綜合征。通過對小鼠的RFX6基因進行敲除，研究人員發(fā)現(xiàn)RFX6純合小鼠大部分不能正常喂養(yǎng)，由于小腸梗阻而出現(xiàn)腹脹腸鳴，并且在出生2 d后死亡。進一步的研究［2］表明，RFX6純合小鼠除了胰多肽(pancreatic polypeptide，PPY)外，幾乎不能產(chǎn)生所有的胰腺激素。以上研究說明RFX6在胰腺的發(fā)育中占據(jù)重要地位。

與大鼠、小鼠等哺乳類模式動物相比，斑馬魚體型較小、易于飼養(yǎng)、繁殖周期短(7 d左右)、產(chǎn)卵量大(300～1 000枚)、胚胎透明，使得研究者可以借助先進的成像技術(shù)，直接在活體胚胎上觀察器官的發(fā)育［4］。為了進一步研究RFX6基因在胰腺中的功能，本研究擬通過基因敲除技術(shù)構(gòu)建RFX6基因敲除的斑馬魚，用于斑馬魚RFX6基因功能的研究。

目前，隨著基因打靶技術(shù)的不斷革新，研究者［5-10］已經(jīng)建立了多個高效并且精確的基因打靶新技術(shù)，包括Cre/LoxP〔cyclization recombinztion protein/locus of crossing-over(X)inP1〕系統(tǒng)，鋅指核酸酶(zincfinger nucleases，ZFN)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技術(shù)等，并且已經(jīng)在酵母［5］、線蟲［6］、斑馬魚［7-8］、小鼠［9-10］等物種中成功實現(xiàn)了定點突變。但是，這些新技術(shù)也不盡完美，各有優(yōu)缺點。因此，需要一種成本低、效率高、更為簡便的基因打靶技術(shù)。2013年2月，美國加州大學舊金山分校的研究人員在《Cell》［11］上報道了一種高效并且精確的基因打靶新技術(shù)——CRISPR/Cas9打靶系統(tǒng)。

本研究運用CRISPR/Cas9打靶技術(shù)，設(shè)計了針對RFX6的單導向RNA(single guide RNA，sgRNA)，成功誘導了RFX6的靶向突變，并且該突變可以遺傳給下一代。初步篩選后獲得了RFX6基因敲除的斑馬魚，可用于斑馬魚RFX6基因功能的研究，為闡釋斑馬魚胰腺發(fā)育機制提供了動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本實驗用AB品系的斑馬魚作為研究材料，在北京大學生命科學院張博教授實驗室培育和繁殖。斑馬魚的養(yǎng)殖條件是28.5℃恒溫魚房，14 h光照/10 h黑暗交替循環(huán)，養(yǎng)魚系統(tǒng)保持日夜循環(huán)水，每天另補充10%(體積分數(shù))新鮮去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 RFX6基因敲除位點的設(shè)計

從斑馬魚基因組網(wǎng)站(http://www.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)得到RFX6基因的序列和結(jié)構(gòu)信息。遵從CRISPR/Cas9介導的斑馬魚基因組定點突變靶點設(shè)計原則，對RFX6基因進行靶向設(shè)計。

Cas9靶點要求包含20個堿基的主位點，以及緊鄰主位點3’端的PAM區(qū)(在20個堿基的主位點之外，由3個堿基構(gòu)成)。PAM區(qū)的序列要求為NGG(N為任意堿基)［12］(圖 1)。

RFX6的主位點序列為:5'-GGAATAATCCAGATGGCCCAGG-3'，用限制性核酸內(nèi)切酶對擴增后的PCR產(chǎn)物進行酶切，酶切完全，電泳后能明顯與原條帶區(qū)分開，證明該Cas9靶點是正確的。篩選出靶點正確的成魚，后續(xù)實驗全部選用這批成魚進行。

1.2.2 gRNA的制備

圖1 CRISPR/Cas9作用原理Fig.1 Mechanism of CPISPR/Cas9

1)制備gRNA體外轉(zhuǎn)錄模板:根據(jù)靶點設(shè)計合成含有T7啟動子序列的引物序列，即5'-TAATACGACT CACTATA GGAATAATCCAGATGGCCC GTTTTAGA GCTAGAAATAGC-3'(5'下劃線部分為T7啟動子序列，中間加粗部分為Cas9主位點序列，3'下劃線部分為gRNA scaffold序列)。

Tracrrev引物序列，即5'-AAAAAAAGCACCGAC TCGGTGCCAC-3'，用這對引物，以pMD19-gata5_gRNA scaffold(XJW)質(zhì)粒為模板做PCR，純化PCR產(chǎn)物，即可得到體外轉(zhuǎn)錄gRNA的模板。

2)體外轉(zhuǎn)錄gRNA:轉(zhuǎn)錄體系如表1所示。

表1 轉(zhuǎn)錄體系Tab.1 Transcription system

按照表1轉(zhuǎn)錄體系配好20 μL的體系后，放入37 ℃，1 h;然后加入 1 μL TURBO DNase，再次放入37℃，15 min(除去DNA模板);取3μL電泳查看轉(zhuǎn)錄效果，然后回收gRNA。

3)回收gRNA(用 ambion的 mirVanaTMmiRNA I-solation Kit):用Rnase-free-H2O將gRNA體系稀釋到300 μL，加入330 μL無水乙醇;將上述獲得的混合液加入到回收柱中，1 000 g離心15 s，然后加入700 μL miRNA Wash Solution Ⅰ，離心5 ～10 s，再加入500 μL Wash Solution Ⅱ，離心5 ～10 s，2 次;棄去廢液，1 000 g離心1 min去除殘余的液體，然后加入適量95℃預(yù)熱的Rnase-free-H2O，離心30 s即可得到gRNA溶液。

1.2.3 顯微注射

將Cas9mRNA和gRNA混合注射到一細胞期的斑馬魚魚卵中，注射量為Cas9 mRNA 300 pg，gRNA 150 pg;取注射后2～4 dpf的胚胎，提取基因組DNA，PCR，酶切檢測靶點突變效率。

1.2.4 篩選F0

將突變成功的F0胚胎飼養(yǎng)直至性成熟(90 dpf)，與野生型(wild type，WT)成魚交配，收集1 dpf胚胎，4個為1組，針對每一條F0分8組提取基因組DNA，做PCR，反應(yīng)體系為10 μL體系，正向引物為5'-AAATTCTCAATCTGCCGCCG-3'，反向引物為5'-GGCAGCACAAGCAGGATCTA-3'。PCR反應(yīng)條件為:95℃ 5 min;95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，33 個循環(huán);72℃ 5 min，自然冷卻至室溫，PCR產(chǎn)物酶切，回收未切開的條帶，連接、轉(zhuǎn)化，TA克隆測序，確定突變類型為3種，分別為:WT:5'-GAAGAAGACCTGGGCCATCTGG-3';+13 bp:5'-GAAGACCTGGG ATTATTAAATAGACCATCTGG-3';+14 bp:5'-GAAGACCTGGG TTATTCCAAGAAGACCATCTGG-3';+22 bp:5'-AAGAAGACCTGGG TTATTCCAAGCCATTAATCCAATAATCTGG-3'。

測序結(jié)果如表2所示。將產(chǎn)生上述3種突變的F0斑馬魚與 WT外交，產(chǎn)生大量 F1，篩選 F1(雜合子)。

表2 測序結(jié)果Tab.2 Sequencing results

1.2.5 篩選F1

將F1飼養(yǎng)至可以剪尾鰭(大約2個月)，剪尾，提基因組，PCR，酶切(HaeⅢ)，篩選出F1雜合子。帶有同一突變的雜合子可以混合飼養(yǎng)。以篩選出的F1作為親本，建立突變?nèi)后w。

2 結(jié)果

2.1 RFX6基因在斑馬魚胰腺的表達譜

為了研究RFX6基因在斑馬魚胰腺發(fā)育過程中的表達情況，采用RT-PCR的方法對多個時間點的斑馬魚胚胎進行分析。結(jié)果顯示RFX6基因在斑馬魚發(fā)育早期(從5hpf到6 d)持續(xù)表達(圖2)，說明RFX6在斑馬魚胚胎胰腺發(fā)育中起重要作用。

2.2 RFX6基因缺失對斑馬魚生長發(fā)育的影響

通過F1內(nèi)交可得到F2，在F2的飼養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)10～14 d時，有部分幼魚死亡，收集死亡幼魚尸體，提取基因組，經(jīng)酶切鑒定大部分為RFX6純合突變體。為了明確這一現(xiàn)象，集中100條幼魚進行常規(guī)飼養(yǎng)，在10～14 d時陸續(xù)收集到16條死亡幼魚的尸體，經(jīng)基因鑒定16條中有12條為RFX6純合突變體。這一數(shù)據(jù)表明，缺失RFX6基因的幼魚在發(fā)育早期大部分會死亡。

圖2 RT-PCR擴增RFX6在斑馬魚發(fā)育早期的表達Fig.2 Expression of zebrafish in early development after RT-PCR amplification on RFX6RFX:regulatory factor X-box.

繼續(xù)飼養(yǎng)F2至可以剪尾鰭，做基因鑒定后發(fā)現(xiàn)只有很少的純合突變體可以長至成魚，但身體增長明顯受阻，體型瘦小，呈現(xiàn)糖尿病消瘦體型，其個體尺寸與野生型對照魚的差距明顯(圖3)。其體質(zhì)量、體長與野生對照組也有明顯差異。RFX6純合突變體發(fā)育至性成熟(90dpf)后與WT交配，沒有后代產(chǎn)生。

3 討論

胰腺的發(fā)生是一個復雜的過程，需要多種基因參與調(diào)控。找到與胰腺發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵基因并利用基因敲除手段研究這些基因的表達與功能，有助于更深入的了解胰腺的發(fā)育過程及其中的分子調(diào)控機制，這對于研究臨床醫(yī)學中內(nèi)分泌疾病的病理機制，以及制定有效的治療方案乃至開發(fā)新藥都有著重大意義。

圖3 斑馬魚體型對比Fig.3 Contrast of zebrafish

隨著大量物種基因組測序的完成，探究關(guān)鍵基因的作用和功能變得愈為重要。目前的研究方法主要依賴于基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，隨著基因敲除技術(shù)的日益成熟，一些高效、精確的技術(shù)隨之出現(xiàn)，包括Cre/LoxP、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9 等。本研究利用CRISPR/Cas9基因打靶新技術(shù)，成功構(gòu)建了斑馬魚模型，為進一步研究RFX6基因在斑馬魚胰腺發(fā)育中的作用提供了有效的研究模型。從本研究結(jié)果來看，RFX6基因在斑馬魚發(fā)育早期從5 hpf到6 d持續(xù)表達，說明RFX6在斑馬魚胚胎胰腺發(fā)育中起重要作用。更為重要的是，完全缺失RFX6的斑馬魚在發(fā)育早期大量死亡，僅有極個別個體能存活到成年，但是身體增長明顯受阻，體型瘦小，呈現(xiàn)糖尿病消瘦體型。

基于上述研究，本研究還有尚待深入之處。為了研究RFX6在胰腺胚胎發(fā)育中的作用，以及解釋純合突變體在發(fā)育早期大量死亡和長至成魚的純合突變體呈現(xiàn)消瘦糖尿病體型的原因，下一步工作包括兩個方面:首先，利用原位雜交技術(shù)探究胰腺主要表達基因［13-15］，如標記內(nèi)分泌腺的胰島素(insulin)、胰高血糖素(glucagon)、生長抑素(somatostatin)以及標記外分泌腺的Trypsin等，在RFX6純合突變體中的表達情況;其次，利用RT-PCR技術(shù)對這些胰腺表達基因進行半定量分析，利用實時熒光定量PCR技術(shù)對這些胰腺表達基因進行定量分析。這兩個方面是后續(xù)研究的主要方向。

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