盧 晶 吳 謙 謝榮榮 仇海燕 程 呈 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科 糖尿病防治研究北京市重點實驗室，北京100730;2.北京大學(xué)生命科學(xué)院，北京100871)

β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(β-site APP-cleaving enzyme 1，BACE1)在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)腦組織中的β-淀粉樣蛋白沉淀中起重要作用［1］。BACE2是BACE1的密切同源物，在阿爾茨海默病的發(fā)病中同樣起重要作用。已有研究［2］表明，糖尿病與阿爾茨海默病的發(fā)病密切相關(guān)。BACE1和BACE2均在人類胰腺組織中高表達，BACE1在胰腺的內(nèi)分泌和外分泌腺中均有表達，而BACE2僅在胰島β細胞中特異性表達［3］。BACE2在維持胰島β細胞的形態(tài)方面具有重要作用。將小鼠BACE2基因敲除后，小鼠的胰島β細胞團增大，空腹血糖下降。葡萄糖刺激后，敲除鼠的胰島素分泌增加，血糖降低明顯［4］。BACE2特異性阻滯劑在小鼠中可刺激新的胰島β細胞生成。BACE2已經(jīng)成為2型糖尿病的藥物治療新靶點［5］。BACE2在胰島β細胞生成和胰腺發(fā)育中的具體作用機制尚不清楚，此外，為尋找糖尿病藥物治療新靶點，針對BACE2基因的大規(guī)模藥物篩選亟須建立。

糖尿病動物模型是研究糖尿病發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)和藥物靶點篩選的基礎(chǔ)。糖尿病動物模型可分為自發(fā)性和實驗性糖尿病動物模型兩類。前者與人類的單基因及多基因遺傳的2型糖尿病仍相差甚遠。新近的實驗性糖尿病動物模型包括采用基因敲除技術(shù)構(gòu)建基因修飾動物模型。傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)包括胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)細胞打靶技術(shù)、鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)技術(shù)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技術(shù)［6］。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)-Cas9是細菌用來抵御病毒侵襲/躲避哺乳動物免疫反應(yīng)的基因系統(tǒng)。2013年1月，科學(xué)家們利用RNA引導(dǎo)Cas9核酸酶技術(shù)可以在多種細胞中特定的基因組位點進行切割、修飾，這一技術(shù)隨即被運用到構(gòu)建基因敲除動物模型中［7-9］。目前這一技術(shù)已廣泛用于斑馬魚的敲除動物模型。

斑馬魚的內(nèi)臟器官、血液與視覺系統(tǒng)，在基因水平上87%與人類同源。斑馬魚具有胚胎透明、體外發(fā)育、發(fā)育快、后代數(shù)量大等優(yōu)勢，逐漸使其成為遺傳發(fā)育研究領(lǐng)域中的一種重要的模式生物［10］。斑馬魚在藥物篩選方面尤其具有極強應(yīng)用價值。斑馬魚胚胎可以同時提供大量互不干擾的形態(tài)學(xué)信息，在藥物篩選初期就可評估藥物的毒性，并盡早排除那些能引起毒性的化合物，因此構(gòu)建疾病基因相關(guān)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚可以篩選治療相關(guān)疾病的潛在藥物［11］。此外，盡管人和斑馬魚的胰腺形態(tài)上存在一定的差別，但是與胰腺發(fā)育和疾病相關(guān)的分子機制相似。因此，構(gòu)建斑馬魚動物模型可以觀察特定基因?qū)σ认侔l(fā)育的影響。

本研究擬應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建BACE2大片段刪除的斑馬魚模式動物模型。該動物模型將被用于斑馬魚BACE2基因?qū)σ认侔l(fā)育的功能研究，為闡釋斑馬魚胰腺發(fā)育機制提供了動物模型。本課題組將在后續(xù)研究中進一步運用BACE2斑馬魚模式動物模型進行大規(guī)模藥物篩選，篩選出針對糖尿病的新型藥物。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究在北京大學(xué)生命科學(xué)院張博教授斑馬魚飼養(yǎng)中心培育斑馬魚。選用AB品系的斑馬魚作為研究對象。斑馬魚的養(yǎng)殖條件是28.5℃的恒溫魚房，14 h光照/10 h黑暗交替循環(huán)，飼養(yǎng)環(huán)境保持日夜循環(huán)水，每天另補充10%新鮮去離子水。

pMD 19-gRNA scaffold質(zhì)粒由北京大學(xué)熊敬維教授饋贈。MirVanaTMmiRNA isolation kit(Ambion公司，美國);動物組織總RNA提取試劑盒(貨號DP431)，F(xiàn)ast Quant cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑(貨號KR108)均購自天根生化科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 設(shè)計BACE2基因敲除靶點

本實驗從斑馬魚基因組網(wǎng)站(http://www.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)得到斑馬魚BACE2基因的序列和結(jié)構(gòu)信息。根據(jù)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的斑馬魚基因組定點突變靶點設(shè)計原則，對BACE2基因進行靶向設(shè)計。Cas9基因打靶系統(tǒng)由Cas9核酸酶和guide RNA(gRNA)構(gòu)成，其中g(shù)RNA中含有主位點序列，負責(zé)識別靶基因;Cas9核酸酶負責(zé)切割靶點，造成DNA雙鏈斷裂(double strand break，DSB)。Cas9靶點要求包含20個堿基的主位點和緊鄰主位點3’端的PAM區(qū)。PAM區(qū)的序列要求為NGG，N為任意堿基。

本研究采用大片段刪除的突變(deletion)的方法，因此需要同時設(shè)計兩個位點。刪除長度應(yīng)控制在0.5～3 Kb之間，兩個靶點的效率應(yīng)分別在30%和50%以上。根據(jù)這一原則，最終選擇BACE2的兩個靶點序列分別為:上游靶位點序列5'-GGTTGAGTAGCATGTGATGCAGG-3';下游靶位點序列為5'-GGTGTGCTATGTTGGAGATGGG-3'。

1.2.2 gRNA的制備

1)制備gRNA體外轉(zhuǎn)錄模板

根據(jù)BACE2靶點設(shè)計、合成含有SP6啟動子序列的引物序列。上游的引物序列為:5'-ATTTAGGTGACACTATA GGTTGAGTAGCATGTGATGC GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'。下游的引物序列為5'-ATTTAGGTGACACTATA GGTGTGCTATGTTGGAGAT GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'(5'下劃線加粗部分為SP6啟動子序列，中間畫框為Cas9主位點序列，3'下劃線部分為gRNA scaffold固定序列)。

合成Tracr rev引物，序列為5'-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3'。使用 SP6引物和 Tracr rev引物對，以pMD19-gRNA scaffold質(zhì)粒(質(zhì)粒圖譜詳見圖1)為模板，采用PCR擴增得到體外轉(zhuǎn)錄gRNA模板。PCR產(chǎn)物采用DNA產(chǎn)物超薄純化試劑盒(天根生化科技有限公司，貨號DP203)回收。

2)體外轉(zhuǎn)錄和回收gRNA

按照gRNA體外轉(zhuǎn)錄體系配置方法，體外轉(zhuǎn)錄gRNA。體外轉(zhuǎn)錄體系(20 μL)如下:SP6 Enzyme 2 μL，5×TransBuffer 2 μL，100 mmol/L DTT 2 μL，RNasin 0.5 μL，NTP(10 mmol/L)2 μL，DNA 模板1 μg，補足DEPC H2O至20 μL。37℃ 體外轉(zhuǎn)錄1 h，加入1 μL TURBO DNase，再次放入37 ℃，15 min;取3 μL 電泳查看轉(zhuǎn)錄效果，采用mirVanaTMmiRNA isolation kit回收gRNA。

圖1 pMD19-gRNA scaffold質(zhì)粒載體示意圖Fig.1 pMD19-gRNA scaffold plasmid vectors

1.2.3 制備F0斑馬魚和靶點突變效率篩選

將Cas9 mRNA和gRNA混合注射到一細胞期的斑馬魚魚卵中，注射量為:Cas9 mRNA 300 pg，gRNA 150 pg;取注射后受精后2～4 d(2～4 days post fertilization，2～4 dpf)的斑馬魚胚胎，提取基因組DNA，進行PCR。PCR上游引物為5'-TGTTCCGCGGATGCATTAAG-3';下游引物為5'-TACCACACGACACCCAATGC-3'。反應(yīng)條件為:95℃ 5 min;95℃ 30 s，59℃ 30 s，72 ℃ 60 s，33 cycles;72 ℃ 5 min，自然冷卻至室溫。將Deletion的條帶回收、連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建到pGEM-T-easy載體后測序。

將突變成功的F0胚胎飼養(yǎng)直至性成熟(90 dpf)，與野生型(wild type，WT)成魚交配，收集1 dpf胚胎，4個為一組，針對每一條F0分組提取基因組DNA，進行PCR。

1.2.4 篩選BACE2基因刪除的F1成魚

將含有BACE2基因大片段刪除的F0斑馬魚與WT交配，產(chǎn)生大量F1，至少需要60條成魚，篩選F1(雜合子)。將F1飼養(yǎng)至兩個月左右剪尾鰭，提基因組，進行PCR，PCR反應(yīng)條件同1.2.3。將Deletion的條帶回收、連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建到pGEM-T-easy載體后測序確定基因型。帶有同一突變的雜合子的魚可以混合飼養(yǎng)。以篩選出的F1作為親本，建立突變?nèi)后w。

1.2.5 RT-PCR檢測不同時間BACE2表達

為了研究BACE2基因在斑馬魚胰腺發(fā)育過程中的表達情況，本研究采用RT-PCR的方法對不同時間點的斑馬魚胚胎進行分析。采用動物組織總RNA提取試劑盒提取成魚的RNA，采用FastQuant cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑合成cDNA。β-actin基因作為內(nèi)參。采用DragonPCR儀器檢測BACE2基因在不同時間的斑馬魚胚胎中的表達情況。β-actin基因上游引物:5'-TGTTTTCCCCTCCATTGTTGG-3';下游引物:5'-TTCTCCTTGATGTCACGGAC-3'。BACE2基因上游引物:5'-TATTTGCGGGGAAATTCAAC-3';下游引物:5'-TGATGTAGGGATGTGCTGCT-3'。PCR反應(yīng)體系為20 μL，2×Enzyme mix 10 μL;正向引物 0.4 μL;反向引物0.4 μL;cDNA 1.5 μL，DEPC H2O 7.7 μL。擴增條件為94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35 cycles;72℃ 5 min，自然冷卻至室溫。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建BACE2大片段刪除的F0斑馬魚

將Cas9 mRNA和gRNA混合注射到一細胞期的斑馬魚魚卵中，取注射后2～4 dpf的斑馬魚胚胎，提取基因組DNA，進行PCR。PCR結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，WT為一條帶，大小為1 025 bp，含有BACE2基因刪除的斑馬魚除了WT條帶，還有一條477 bp的條帶。將477 bp條帶切膠回收構(gòu)建到pGEM-T-easy載體，測序結(jié)果顯示該條帶為BACE2基因刪除548 bp后的序列(圖3，測序圖為反向互補序列)。

圖2 PCR擴增BACE2刪除序列附近PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification of BACE2，delete PCR product near the sequence

圖3 BACE2基因刪除548bp測序圖及序列示意圖Fig.3 Sequencing graph of BACE2 gene after deleting 548 bp using reversed complementary sequence

2.2 BACE2基因缺失對斑馬魚生長發(fā)育的影響

本研究將篩選后得到的BACE2基因大片段刪除F1經(jīng)內(nèi)交后得到F2代斑馬魚。F2代斑馬魚繼續(xù)飼養(yǎng)至12～16 d時，有部分幼魚死亡。收集死亡幼魚尸體，提取基因組，經(jīng) PCR檢測鑒定死魚大部分為BACE2純合突變體。為深入研究這一現(xiàn)象，本研究收集100條幼魚進行常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至12～16 d時共收集到24條死亡幼魚的尸體，經(jīng)PCR擴增后鑒定結(jié)果顯示，24條死魚中有14條為BACE2純合突變體。這一數(shù)據(jù)表明，缺失BACE2基因的幼魚在發(fā)育早期部分無法存活。

本研究繼續(xù)飼養(yǎng)F2斑馬魚至其成熟后剪尾鰭，做PCR檢測鑒定其基因型發(fā)現(xiàn)只有極少的純合突變體可以長至成魚。BACE2純合突變斑馬魚的體質(zhì)量、體長與野生對照組無明顯差異。

2.3 BACE2基因在斑馬魚胰腺的表達譜

為研究BACE2基因在斑馬魚胰腺發(fā)育過程中的表達情況，本實驗采用RT-PCR對不同時間點的斑馬魚胚胎的BACE2基因表達進行檢測。選用β-actin作為內(nèi)參。結(jié)果顯示BACE2基因在斑馬魚發(fā)育早期(從受精后18 h到3 d)持續(xù)表達，這說明BACE2基因在斑馬魚胚胎胰腺發(fā)育中起重要作用。詳見圖4。

圖4 RT-PCR擴增BACE2在斑馬魚發(fā)育早期的表達Fig.4 Expression of RT-PCR amplification of BACE2 in the early development of zebrafish

3 討論

本研究利用CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)，成功構(gòu)建了BACE2基因大片段刪除的斑馬魚動物模型。篩選F1代成魚后結(jié)果顯示，BACE2純合突變體在發(fā)育早期部分死亡，僅有部分能存活至成魚。通過RTPCR檢測發(fā)現(xiàn)，BACE2基因在斑馬魚發(fā)育早期從5 hpf到6 d持續(xù)表達，這說明說明BACE2在斑馬魚胚胎的胰腺發(fā)育中起重要作用。

本研究采用新型的基因敲除技術(shù)，即CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)。這一技術(shù)具有以下幾點優(yōu)勢。首先，CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)無物種限制，可以用于小鼠［12-13］、大鼠、酵母［14］、線蟲、斑馬魚［15］等多種生物。其次，與其他基因敲除技術(shù)，如傳統(tǒng)的ES細胞打靶技術(shù)、鋅指核酸酶技術(shù)和TALEN相比，CRISPR/Cas9敲除技術(shù)具有時間周期短的優(yōu)點。傳統(tǒng)的ES細胞打靶技術(shù)周期約為12個月，采用TALEN技術(shù)構(gòu)建基因敲除動物模型周期約為9個月，而CRISPR/Cas9敲除技術(shù)僅需要6個月即可得到F1代基因敲除斑馬魚。第三，與鋅指核酸酶技術(shù)和TALEN技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)具有敲除效率更高，脫靶率更低的優(yōu)點。第四，CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)操作簡單，需要的儀器較少。根據(jù)靶點選擇原則設(shè)計合適的CRISPR/Cas9靶點，構(gòu)建gRNA后與Cas9共同注射斑馬魚卵，檢測敲除效率即可。本研究利用最新的CRISPR/Cas9基因打靶技術(shù)，3個月內(nèi)即成功構(gòu)建了BACE2基因大片段刪除的斑馬魚動物模型。

本研究的后續(xù)工作將圍繞胰島發(fā)育機制和藥物篩選兩方面進行。首先，本課題組將檢測BACE2雜合或純合突變體和WT斑馬魚的血糖和胰島素分泌情況。為進一步研究BACE2基因在斑馬魚胰腺發(fā)育中的作用機制，本課題組將利用原位雜交技術(shù)和實時熒光定量PCR技術(shù)探究胰腺主要表達基因，如標記內(nèi)分泌腺的胰島素、胰高血糖素、生長抑素以及標記外分泌腺的胰蛋白酶等，在BACE2雜合或純合突變體中的表達情況。此外，運用斑馬魚作為整體動物模型進行高通量的篩選并跟蹤考察藥物在斑馬魚模型體內(nèi)的吸收、代謝及分布等情況，將為糖尿病研究提供更多的具有臨床應(yīng)用價值的有效信息。本課題組將運用本研究構(gòu)建的BACE2敲除斑馬魚動物模型進行糖尿病的藥物篩選，尋找糖尿病的藥物治療新靶點。

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