許瑞霞，高磊，趙偉利，張偉，宋廣超，甘尚權，石國慶

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基因在阿勒泰羊尾脂沉積與代謝模型中的表達變化規(guī)律

許瑞霞1,2，高磊2，趙偉利1,2，張偉1,2，宋廣超1,2，甘尚權2，石國慶1,2

1. 石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2. 新疆農(nóng)墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所，石河子 832000

()參與細胞內脂肪酸的轉運和脂肪酸代謝，是當前研究動物脂肪沉積與代謝的熱門候選基因。為了研究基因在綿羊尾脂沉積與代謝中的作用，文章采用生物信息學方法分析了FABP4氨基酸序列在各物種中的保守性；利用半定量RT-PCR方法檢測了該基因在阿勒泰羊主要組織中的表達；采用饑餓法成功建立了模擬阿勒泰羊尾脂沉積與代謝的動物模型，利用qPCR和iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術同時驗證基因mRNA和蛋白在阿勒泰羊非饑餓組與饑餓組尾脂中的表達變化。序列分析結果表明，綿羊FABP4氨基酸序列在物種間高度保守，提示基因可能由于其重要的生物功能而在進化中表現(xiàn)出其物種的保守性。組織表達譜結果顯示，mRNA在阿勒泰羊腸脂與尾脂中均高豐度表達，暗示基因可能在脂肪中行駛著重要的生理生化功能。qPCR與iTRAQ結果顯示，mRNA與蛋白在兩種極端條件下尾脂中的表達差異均不顯著(>0.05)，表明基因可能不是綿羊尾脂沉積與代謝兩種極端差異表型的決定基因。以上研究結果為進一步研究基因在綿羊尾脂中的生物功能奠定了基礎。

FABP4；阿勒泰羊；尾脂沉積與代謝；表達變化

阿勒泰羊臀尾合一，充斥著大量脂肪組織，其肥大的脂臀性狀是在新疆生態(tài)惡劣的地理環(huán)境下長期進化與選擇的結果。夏秋牧草豐茂時期，脂肪組織能夠在阿勒泰羊尾臀部大量沉積，臀尾表現(xiàn)出極度充盈的表型。冬春牧草匱乏時，充盈的尾脂大量分解以維持機體新陳代謝能量之所需，其臀尾表現(xiàn)出“癟瘦”表型。阿勒泰羊屬于典型的脂肉型綿羊品種，其尾脂約占胴體重的1/4，這種高產(chǎn)脂能力不僅降低了其經(jīng)濟價值，其肉質也不利于健康飲食的需要。鑒于此，新疆農(nóng)牧民大量引進外來低脂品種對其進行雜交改良，這種無組織性的雜交與串配使得阿勒泰羊基因庫受到嚴峻挑戰(zhàn)，其品種面臨滅絕的險境。因此，發(fā)掘影響阿勒泰羊尾脂沉積與代謝的關鍵基因，繼而培育出低脂阿勒泰羊新品系，無論對于阿勒泰羊保種還是提高其經(jīng)濟價值均具有重要的研究意義。

脂肪酸結合蛋白4(Fatty acid binding protein 4, FABP4)亦稱aP2或A-FABP，屬于脂肪酸結合蛋白超家族，編碼132個氨基酸，相對分子質量約14.6 kDa。它在脂肪組織中高表達，是成熟脂肪細胞中主要的胞質蛋白，約占細胞總蛋白的6%[1~3]。研究表明FABP4能夠可逆性地結合飽和及不飽和長鏈脂肪酸，促進脂肪酸的代謝和轉運，調控脂類生成及降解，在介導胞內脂肪酸轉運和能量代謝過程中起重要作用[4, 5]。豬和雞的基因已被證實是肌內脂肪含量(IMF)的候選基因[6]。迄今為止，仍未見有關基因在綿羊尾脂沉積與代謝中的作用的文獻報道?；诖耍疚臄M以阿勒泰羊為研究對象，采用饑餓法建立模擬阿勒泰羊在自然生理狀態(tài)下尾脂沉積與代謝兩種極端狀態(tài)的動物模型，研究基因mRNA與蛋白在尾脂沉積與代謝兩種狀態(tài)中的表達變化規(guī)律，為進一步驗證基因對阿勒泰羊尾脂沉積與代謝的影響積累基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

挑選年齡相近(約2~3歲)、體重接近、臀型一致、膘情良好的阿勒泰羊7只(購于阿勒泰羊種群核心區(qū)阿勒泰富蘊縣)。隔離半月后飼養(yǎng)于新疆農(nóng)墾科學院轉基因羊場。非饑餓組：選取3只成年阿勒泰母羊，每天分早、中、晚3次飼喂草料，飲水自由，每日傍晚補飼玉米200 g，連續(xù)飼喂四周后手術取3只母羊左臀脂肪組織置于液氮中保存；饑餓組：上述3只阿勒泰羊尾脂組織樣品采集完畢后縫合左側創(chuàng)口，抗生素治療1周，后連續(xù)恢復3周，期間自由采食與飲水。待其體況恢復至正常生理狀態(tài)后，開始以周為單位進行限飼(每周飼喂量減半，自由飲水)，3周后完全停止飼草料，停喂期間飲水照常，停喂4周后迅速采集阿勒泰羊右臀脂肪組織并置于液氮中保存?zhèn)溆?。同時宰殺剩余4只處于正常飼喂條件下阿勒泰羊，迅速采集其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、腸系膜脂肪和尾脂等組織樣品，置于液氮中保存，用于基因組織表達譜研究試驗。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

以GenBank中公布的綿羊()基因(登錄號：NM_001114667.1)與綿羊持家基因(登錄號：NM_001190390)mRNA序列為參考序列，采用Oligo6.0軟件設計相應的PCR擴增引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及擬擴增片段大小見表1。

1.2.2 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成

參照TRIzol?Reagent(Invitrogen)說明書提取阿勒泰羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、腸系膜脂肪、尾脂及饑餓與非饑餓試驗組阿勒泰羊尾脂等組織總RNA。0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，利用核酸蛋白分析儀測定RNA的純度和濃度。cDNA第一鏈采用能夠除去基因組DNA污染的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Per-fect Real Time)(TaKaRa)反轉錄試劑盒進行合成。

1.2.3 序列生物信息學分析

在NCBI Nucleotide數(shù)據(jù)庫中分別檢索綿羊、牛、牦牛、小家鼠、猴、人等物種基因的核酸序列及蛋白序列，利用DNAMAN5.0軟件進行物種間同源性分析；利用Clustalx和MEGA軟件構建FABP4蛋白序列系統(tǒng)進化樹。

1.2.4基因組織表達譜分析

為使RT-PCR結果可以反映基因在各組織中的真實表達量，本文首先確定了高豐度表達的內參基因的最佳擴增循環(huán)數(shù)。PCR反應體系為10×Reaction Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，上下游引物(10 mmol/L)各0.5 μL，DNA 聚合酶0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 18 μL。分別設定循環(huán)數(shù)20、22、24、26、27、28、29和30，根據(jù)PCR擴增瓊脂糖檢測結果選擇合適的循環(huán)數(shù)。

以正常飼喂條件下阿勒泰羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、腸系膜脂肪和尾脂cDNA為擴增模板進行PCR擴增，反應體系同上。PCR程序如下：94℃預變性 1 min；94℃變性 30 s；60℃復性30 s；72℃延伸30 s，共29個循環(huán)；72℃延伸10 min。半定量RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色后，在紫外光下用GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)成像。持家基因的RT-PCR步驟與程序同基因。

表1 引物序列和PCR產(chǎn)物長度

1.2.5 熒光實時定量PCR

標準曲線的制備：以阿勒泰羊饑餓與非饑餓試驗組阿勒泰羊尾脂cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收后，與pMD18-T載體連接、轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α)，提取經(jīng)PCR和測序鑒定的陽性克隆質粒，將質粒稀釋成20 ng/μL，并以此濃度為始濃度依次稀釋10倍，共稀釋9個梯度，以最后6個梯度繪制定量標準曲線。

熒光實時定量PCR檢測：利用熒光定量PCR儀Lightcycler480(Roche)，采用SYBR GreenⅠ染料法分別檢測和基因在饑餓和非饑餓阿勒泰羊尾脂中的mRNA表達水平，饑餓組與非饑餓組各3個生物學重復，并設置相應的陰性對照(擴增模板為雙蒸水)。熒光定量PCR為25 μL反應體系：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix(QIAGEN) 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，Rnase-free water 10.5 μL，cDNA模板1 μL。PCR反應程序：95℃熱激活 5 min，95℃變性 1 s，60℃復性/延伸 30 s，45個循環(huán)。同時記錄PCR產(chǎn)物的熔解曲線，檢驗產(chǎn)物的特異性。

1.2.6 饑餓與非饑餓組尾脂蛋白組絕對定量分析

iTRAQ標記：非饑餓組和饑餓組尾脂蛋白樣品各3份，然后取等量各樣品肽段進行混合并以此作為內參對照。每份樣品各取約60 μg，通過iTRAQ試劑標記后混合進行定量測試。本研究共采用7種同量異位素編碼的標簽對以上樣本進行iTRAQ標記，標記后進行串聯(lián)質譜分析，同時比較7種不同樣品中蛋白質的絕對含量。在質譜圖中，任何一種iTRAQ標簽標記的不同樣本中的同一蛋白質表現(xiàn)為相同的質荷比。而在串聯(lián)質譜中，信號離子表現(xiàn)為不同質荷比的峰，根據(jù)波峰的高度和面積，可以得到較為準確的蛋白質定量信息。

毛細管高效液相色譜分離與質譜分析：每份樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進行分離。樣品經(jīng)SCX分級并脫鹽后用Q-Exactive質譜儀(Thermo Finnigan)進行質譜分析。分析時長：120 min，檢測方式：正離子，母離子掃描范圍：300~1800 m/z，一級質譜分辨率：70 000 at m/z 200，AGC target：3e6，一級Maximum IT：10 ms，Number of scan ranges：1，Dynamic exclusion：40.0 s。多肽和多肽碎片的質量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集10個碎片圖譜(MS2 scan)，MS2 Activation Type: HCD，Isolation window：2 m/z，二級質譜分辨率：17 500 at m/z200，Microscans：1，二級Maximum IT：60 ms，Nor-malized collision energy：30eV，Underfill ratio：0.1 %。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

熒光定量數(shù)據(jù)分析：以持家基因為參照，將阿勒泰羊基因在非饑餓試驗尾脂中的表達量定義為 1，熒光實時定量PCR結果利用2-ΔΔCt法[7]計算基因在饑餓與非饑餓試驗阿勒泰羊尾脂中的相對表達量，并利用SPSS(18.0)數(shù)據(jù)分析軟件對定量數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。阿勒泰羊組織表達譜相對灰度值定量：采用quantity one軟件分別檢測凝膠上與帶型的灰度值，以灰度值/灰度值為相對灰度值，將所有組織相對灰度值除以心臟組織的相對灰度值所得到的數(shù)據(jù)為相對灰度值定量數(shù)據(jù)，定量數(shù)據(jù)以心臟組織的相對灰度值基調(心臟relative gray value=1)進行比較。iTRAQ數(shù)據(jù)分析：采用Mascot2.2軟件進行查庫鑒定分析蛋白質譜；采用Proteome Discoverer1.4(thermo)軟件對肽段報告離子峰強度值進行定量分析。定量時以各樣品等量肽段混合物Mix標記標簽的為內參，根據(jù)不同iTRAQ標簽的豐度對來源于不同組的各肽段進行定量，表現(xiàn)為各組蛋白質與內參的比值。

2 結果與分析

2.1 總RNA提取及基因的克隆測序

0.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，所提取不同組織完整性(28S、18S和5S)較好，無DNA和蛋白質污染，所有樣品經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測260/280均在1.8~2.0之間，說明提取的總RNA純度較高，可以用于后續(xù)試驗。

以阿勒泰羊尾脂組織cDNA為模板，利用和基因特異性引物進行PCR擴增，獲得了一條與預期大小相符的片段，經(jīng)回收測序，并與GenBank中公布的綿羊基因序列進行比對，確定為綿羊基因。

2.2 綿羊FABP4同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用DNAMAN軟件對綿羊、山羊、牛、牦牛、小家鼠、獼猴、原雞、人、野豬、馬鹿等物種的核苷酸序列及蛋白質序列進行同源性比較。結果表明，綿羊的核苷酸序列與山羊、牛、牦牛、小家鼠、原雞、獼猴、人、野豬、馬鹿的同源性分別為：99.25%、95.99%、96.24%、82.71%、72.93%、88.47%、89.47%、90.23%、96.49%。蛋白質序列的同源性與mRNA序列同源性大致相同，分別為：99.24%、93.18%、95.45%、86.36%、72.73%、86.36%、84.09%、96.21%。運用Mega5.0軟件，利用N-J法建立綿羊與其他物種FABP4蛋白系統(tǒng)進化樹，結果顯示，綿羊FABP4與山羊、牛等反芻動物FABP4的遺傳距離最近，與禽類(原雞)的遺傳距離最遠(圖1)。

圖1 各物種FABP4蛋白序列系統(tǒng)進化樹

2.3 FABP4基因組織表達譜研究

RT-PCR結果顯示，mRNA在腸系膜脂肪和尾部脂肪組織中的表達豐度最高，兩者表達均高于持家基因的表達，且尾部脂肪組織中的表達量高于腸系膜脂肪(圖2)。此外，除了腸系膜脂肪與尾脂，肺臟和肌肉中也有微量mRNA表達(圖3)，這可能是由于肺臟與肌肉組織含有少量脂肪所致，但其表達量相對于腸系膜脂肪與尾脂可以忽略不計。

圖2 FABP4在阿勒泰羊組織中的表達譜

圖3 阿勒泰羊組織表達譜相對灰度值定量

2.4 FABP4基因的熒光實時定量檢測

阿勒泰羊基因在饑餓與非饑餓試驗尾脂中的表達規(guī)律顯示，3個非饑餓組生物學重復尾脂基因值均略低于饑餓組。以為持家基因，以2-ΔΔCt法計算基因相對表達量，從圖4可以看出，阿勒泰羊基因在非饑餓組尾脂中的表達量略高于饑餓組尾脂，但二者差異不顯著(>0.05)。

圖4 FABP4基因在阿勒泰羊饑餓組與非饑餓組尾脂中的表達水平比較

2.5 iTRAQ質譜數(shù)據(jù)分析

iTRAQ技術結合液相色譜質譜技術構建阿勒泰羊饑餓組與非饑餓組尾脂中的蛋白差異表達譜系。經(jīng)質譜分析及Mascot查庫，結果合并以后以肽段FDR≤0.01篩選過濾，最終共鑒定到2094個唯一肽段和1100個蛋白質，圖5A為質譜鑒定總離子流圖。將其中一高豐度表達的肽段進行二級質譜鑒定，二級質譜圖如圖5B所示，經(jīng)比對蛋白質二級質譜數(shù)據(jù)庫，鑒定該高豐度表達的蛋白肽段為綿羊FABP4蛋白。

圖5 質譜鑒定總離子流圖(A)與FABP4的二級質譜圖(B)

對FABP4蛋白肽段標記數(shù)據(jù)進行顯著性分析并計算其顯著性指數(shù)(-Value)，結果顯示FABP4蛋白在阿勒泰羊非饑餓組尾脂中的表達量略高于饑餓組，但二者差異不顯著(>0.05)此結果與mRNA定量結果類似，說明基因mRNA與蛋白質表達趨勢相統(tǒng)一(圖6)。

圖6 阿勒泰羊非饑餓組與饑餓組尾脂中的FABP4蛋白水平比較

3 討 論

FABP4是低分子量、可溶性胞內脂質轉運載體，在脂肪細胞中高度表達，可受PPARγ激動劑(如羅格列酮)、胰島素和脂肪酸調節(jié)[5, 8~10]。研究表明在脂肪細胞分化過程中，F(xiàn)ABP4的表達及活性顯著增強[11]；在甘油三酯形成及脂解過程中，F(xiàn)ABP4能夠儲存或釋放大量脂肪酸，參與調控甘油三酯的形成和脂解的生化循環(huán)[12]。因此，已成為調控動物脂肪代謝的重要候選基因。

本文采用饑餓法模擬了阿勒泰羊在自然生理狀態(tài)下尾脂沉積與代謝兩種極端狀態(tài)，成功建立了阿勒泰羊饑餓與非饑餓狀態(tài)下尾脂沉積與代謝的動物模型，并在此基礎上分析了基因在阿勒泰羊饑餓組與非饑餓組尾脂中的表達變化。mRNA與蛋白質在非饑餓組尾脂中的表達量雖略高于饑餓組，但二組間差異并不顯著(>0.05)，提示基因可能不是造成阿勒泰羊尾脂沉積與代謝兩種尾脂表型的關鍵基因。我們推測，基因參與脂肪沉積與代謝過程，但不是綿羊尾脂沉積與代謝過程中脂肪代謝的關鍵限速酶。Hotamisligil等[13]、Coe等[14]和Shaughnessy等[15]發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠正是由于受基因表達的補償效應，脂肪發(fā)育和新陳代謝才得以正常。Hertzel等[12]發(fā)現(xiàn)過表達轉基因小鼠基因表達上升10倍，其體內基因表達卻下降了2倍，轉基因小鼠脂解相關蛋白的表達(和)及脂解水平均呈顯著的上升趨勢，但其體重、血清FFA和脂肪墊質量與野生型相比均無顯著性差異。這一研究結果暗示基因可能在脂解發(fā)揮作用，但并不是脂解所必需的蛋白因子。與Hertzel等[12]的發(fā)現(xiàn)相反，Coe等[14]、Uysal等[16]與Scheja等[17]等研究發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠的基礎脂解和異丙腎上腺素誘導的脂解作用均顯著降低?；蛉笔∈蟮闹庾饔蔑@著降低，從側面提示基因可能參與脂解這一生化過程。從以上數(shù)據(jù)我們分析，基因的缺失或表達下降可造成脂解水平的上升或下降，關鍵看其他的家族成員(如)是否能夠補償這一由于缺失或表達下降帶來的影響。

圖7 FABP4基因在脂質代謝中的調控圖

Baar等[18]發(fā)現(xiàn)基因缺失還可顯著降低脂肪組織中非酯化脂肪酸的釋放。與此相反，Smith等[19]發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠脂肪組織中游離的非酯化脂肪酸增多，這主要是由于FABP4結合一個脂肪酸后又與脂滴表面磷酸化活化的激素敏感脂肪酶(Hormone sensitive lipase, HSL)相互作用并形成復合物，最后共同將脂肪酸從脂滴轉運到質膜，進而有利于脂肪酸的釋放，但同時釋放的脂肪酸又反饋抑制脂肪組織脂解水平。這一發(fā)現(xiàn)與Baar等研究結果有效統(tǒng)一，提示基因在酯化中扮演重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)mRNA與蛋白在非饑餓組阿勒泰羊尾脂中表達均要高于饑餓組，與FABP4在酯化過程中的作用的推理相契合。

除了在脂解與酯化等方面影響脂質代謝作用外，基因還可以通過PPARγ途徑促進脂肪細胞的分化[20]。Fu等[21]還發(fā)現(xiàn)基因的啟動子區(qū)存在(PPAR應答元件)PPREs，PPARγ激動劑在激活PPARγ的同時，還可以促進基因的表達[22]，形成FABP4與PPARγ之間的正反饋環(huán)[23]。CCAAT增強子結合蛋白也能夠與基因的啟動子相互作用并提高基因的表達[24]。

此外，基因還是全身性胰島素敏感和糖代謝的重要調控因子[1]。當將膳食肥胖[13]和遺傳性肥胖[16]鼠基因敲除，肥胖鼠不表現(xiàn)高胰島素血癥、高血糖和胰島素抵抗。大量研究已證實血清FABP4水平與肥胖癥、高胰島素血癥、胰島素抵抗和代謝綜合征呈正相關[2, 25, 26]，Tuncman等[27]發(fā)現(xiàn)人類基因的啟動子處一處突變會導致脂肪組織基因mRNA表達減少，從而降低患Ⅱ型糖尿病和心血管疾病的風險。在巨噬細胞[28, 29]和內皮細胞[30]中也有一定的生理功能，巨噬細胞中的可以被氧化性低密度脂蛋白[31]和toll樣受體激動劑[32]所誘導，也能被降膽固醇抑制素藥物抑制[33]，從而調節(jié)炎癥細胞因子的產(chǎn)生和膽固醇酯的積累[34]。

基于基因以上4個方面的主要功能，我們繪制一幅較為全面的基因生理生化作用的調控圖(圖7)，從這張圖中我們可以看出在哺乳動物的脂肪細胞分化、脂質代謝、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、胰島素敏感以及炎癥反應等諸多生理過程中發(fā)揮著重要作用。目前，基因在阿勒泰羊尾脂沉積與代謝中的作用機制仍不明晰，本研究成功建立了阿勒泰羊饑餓與非饑餓狀態(tài)下尾脂沉積與代謝的模型，分析了基因mRNA和蛋白在阿勒泰羊饑餓與非饑餓組尾脂中的表達變化，研究結果為進一步研究基因在綿羊尾脂沉積與代謝中的作用機制提供依據(jù)。

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(責任編委: 趙要風)

Analysis ofexpression pattern in rump fat deposition and metabolism of Altay sheep

Ruixia Xu1,2, Lei Gao2, Weili Zhao1,2, Wei Zhang1,2, Guangchao Song1,2, Shangquan Gan2, Guoqing Shi1,2

() is a hot candidate gene in fat deposition and lipid metabolism and participates in the transport and metabolism of intracellular free fatty acids. We aim to study the role ofin fat deposition and metabolism of the rump fat in Altay sheep. In this study, bioinformatics method was used to analyze the protein sequence homology among 10 species, and RT-PCR was employed to detecttissue profiling of Altay sheep. An animal model simulating the rump fat deposition and metabolism of Altay sheep was established by continuous starvation, and qPCR and iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation) were used to detectemRNA and protein expression changes in the control and continuous starvation groups, respectively. Sequence analysis showed that FABP4 protein sequence is highly conserved among species, suggesting an important biological function during evolution for. The RT-PCR result confirmed thatmRNA was highly expressed in intestinal and rump fat, suggesting thatplays an important physiological role in fat tissues. We did not find significant differences inmRNA and protein between control and continuous starvation groups (>0.05), which indicates thatmay not be the key gene in fat deposition and metabolism in Altay sheep.The results above lay a foundation for further studies ofin rump or tail fat.

FABP4; Altay sheep; rump(tail) fat deposition and metabolism; expression change

2014-10-28;

2014-11-24

國家自然科學基金新疆聯(lián)合基金重點項目(編號：U1130302)和“973”前期專項項目(編號：2011CB111501)資助

許瑞霞，碩士研究生，專業(yè)方向：綿羊分子育種設計。Tel: 0993-6683739；E-mail: ruixiaxu2013@163.com

甘尚權，副研究員，研究方向：分子遺傳學。E-mail: shangquangan@163.com石國慶，研究員，研究方向：動物繁殖與綿羊育種。E-mail: nkkxyxms@163.com

10.16288/j.yczz.14-369

網(wǎng)絡出版時間: 2014-12-23 10:11:59

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141223.1011.001.html