宋曉麗 駱夏丹 李 凌 朱愛萍

(1揚(yáng)州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，揚(yáng)州225002)

(2金華市環(huán)境科學(xué)研究院，金華321000)

Fe3O4/殼聚糖季銨鹽磁共振造影劑的制備及肝造影性能

宋曉麗＊,1駱夏丹2李 凌1朱愛萍＊,1

(1揚(yáng)州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，揚(yáng)州225002)

(2金華市環(huán)境科學(xué)研究院，金華321000)

采用季銨鹽化殼聚糖(HTCC)對(duì)Fe3O4進(jìn)行表面改性，成功制備在模擬生理環(huán)境中懸浮穩(wěn)定的超順磁性Fe3O4/HTCC復(fù)合納米粒。通過動(dòng)態(tài)光散射、透射電鏡、振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)、磁共振等手段對(duì)材料的性能進(jìn)行表征，并考察了其細(xì)胞相容性及磁共振造影性能。結(jié)果表明：該方法所制備的超順磁性復(fù)合納米粒粒徑均一，模擬生理環(huán)境中具有良好的分散穩(wěn)定性；體外實(shí)驗(yàn)表明該磁性納米粒具有良好的細(xì)胞相容性；大鼠體內(nèi)肝臟磁共振造影實(shí)驗(yàn)表明Fe3O4/HTCC納米粒注入后，大鼠肝實(shí)質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度明顯下降，因此Fe3O4/HTCC納米粒有望作為潛在的陰性造影劑應(yīng)用于肝磁共振造影檢測(cè)。

季銨鹽化殼聚糖；超順磁性四氧化三鐵；分散穩(wěn)定性；磁共振造影

腫瘤的早期診斷對(duì)其治療至關(guān)重要。核磁共振成像(MRI)是繼CT后醫(yī)學(xué)影像學(xué)的又一重大進(jìn)步。MRI利用生物體不同組織在外磁場(chǎng)影響下產(chǎn)生不同的共振信號(hào)成像，顯示小病灶或病變區(qū)，以期使疑難病變得以確診，實(shí)現(xiàn)診斷[1-4]。為了提高對(duì)軟組織的分辨率，該過程往往需要造影劑以提高磁共振影像的對(duì)比度[5-7]。目前，在我國(guó)用于臨床的造影劑一般是釓系列造影劑，該類造影劑在生物體內(nèi)呈非特異性分布。主要適用于腦、腎和血液系統(tǒng)的成像[8-9]，但該類造影劑體內(nèi)停留時(shí)間短，易解離，弛豫率低且對(duì)肝腎有較大的副作用[10]。

超順磁性材料作為MRI造影劑，弛豫速率相對(duì)較高，引起了廣泛的關(guān)注[11-12]。超順磁性造影劑(SPION)是一種以Fe3O4為主要成分的超順磁性納米微粒。SPION可經(jīng)靜脈注射后進(jìn)入肝臟及脾臟的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞，被肝臟內(nèi)的枯否細(xì)胞攝取，從而呈現(xiàn)低信號(hào)。由于正常肝臟存在枯否細(xì)胞，而腫瘤內(nèi)一般沒有或含極少量的枯否細(xì)胞，因此SPION可增加腫瘤與肝實(shí)質(zhì)間的對(duì)比度，應(yīng)用于肝臟腫瘤的檢出[13-14]。但表面未被改性的納米Fe3O4易集聚、血液循環(huán)時(shí)間不夠長(zhǎng)、在生理環(huán)境下分散不穩(wěn)定，且較高濃度Fe3O4納米粒易引起鐵毒性，給其臨床應(yīng)用帶來了困難[15-17]。因此，對(duì)Fe3O4納米粒進(jìn)行表面改性，研發(fā)分散穩(wěn)定的生物相容性SPION，降低其毒性和毒副作用，提高在肝脾部位的造影效果，對(duì)于肝臟腫瘤的診斷具有重要意義。

殼聚糖是一種可生物降解的生物相容性天然材料，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[18-19]。然而殼聚糖不溶于水，使其應(yīng)用受到了極大的限制。殼聚糖分子中含有氨基和羥基，可進(jìn)行化學(xué)改性修飾制備多性能殼聚糖衍生物[20-22]，極大地?cái)U(kuò)大了殼聚糖在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用范圍。殼聚糖經(jīng)季銨鹽化后生成一類殼聚糖衍生物稱為季銨鹽化殼聚糖(N-(2-hydroxyl) propyl-3-trimethyl ammonium chitosan(HTCC))。季銨基團(tuán)的引入有望使殼聚糖的水溶性及與Fe3O4納米粒的結(jié)合能力大大提高，更易形成穩(wěn)定的Fe3O4/ HTCC復(fù)合納米粒。

本文首先制備季銨鹽化殼聚糖衍生物，由于季銨基團(tuán)帶正電荷，可能對(duì)Fe3O4納米粒形成良好的靜電吸附作用，通過簡(jiǎn)單攪拌一步法表面改性Fe3O4納米粒，通過透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)，動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)，磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)及振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(vibration sample magnetometer，VSM)對(duì)其進(jìn)行表征，并對(duì)其生物相容性，肝磁共振造影性能進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

殼聚糖(CS，5.0×105，脫乙酰度85%)，浙江玉環(huán)海洋生物有限公司；2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨(GTA)，上海西域集團(tuán)；異丙醇、氯化鐵、硫酸亞鐵、氨水，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 季銨鹽化殼聚糖(HTCC)的合成

0.5 g CS溶于2wt%的醋酸溶液中，逐滴加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液使CS析出，浸泡8 h，抽濾，洗滌至中性，得到白色絮狀殼聚糖。將白色絮狀殼聚糖分散在15 mL異丙醇中，將0.75 g GTA溶解在5 mL異丙醇中。80℃下，緩慢滴加至CS的異丙醇溶液，控制2 h滴完，反應(yīng)6 h。用無水乙醇將產(chǎn)物沉淀出來，抽濾，干燥，得到季銨鹽化殼聚糖(HTCC)

1.3 Fe3O4納米顆粒的制備

共沉淀方法制備Fe3O4納米粒：準(zhǔn)確稱取硫酸亞鐵和氯化鐵，物質(zhì)的量之比為1:2，移入圓底燒瓶中，溶解于無氧水中并通入氮?dú)?，然后向其中滴? mol·L-1氨水，體系中不斷有黑色沉淀物生成。反應(yīng)結(jié)束后體系pH值為13，用無氧水洗滌沉淀物3次，直至pH值為7～8，冷凍干燥得Fe3O4納米粒。

1.4 季銨鹽化殼聚糖表面改性Fe3O4

250 mg冷凍干燥后的Fe3O4加入25 mL HTCC (0.4 mg·mL-1)水溶液中，室溫下500 r·min-1機(jī)械攪拌12 h使HTCC充分包覆在Fe3O4表面，高速離心、洗滌3次，冷凍干燥制得Fe3O4/HTCC納米粒，備用。

1.5 表征

采用紅外光譜對(duì)HTCC結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征；采用電位滴定法測(cè)HTCC的取代度。準(zhǔn)確稱取HTCC溶解于去離子水中，配制濃度為0.01 mol·L-1的AgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，以飽和甘汞電極為參比電極，銀電極為工作電極，當(dāng)電位的變化與滴定體積的變化比值最大時(shí)即為滴定終點(diǎn)，由公式(1)計(jì)算HTCC的取代度DS。

其中，V為消耗AgNO3的體積(L)，c為AgNO3的標(biāo)準(zhǔn)濃度(mol·L-1)，m1為樣品質(zhì)量(g)，m2為被取代樣品的質(zhì)量(g)，m2=Vc×313.5，162為單元?dú)ぞ厶欠肿恿浚?13.5為單元HTCC分子量。

采用TEM觀察納米粒子的尺寸和形貌；VSM測(cè)試樣品的飽和磁化強(qiáng)度。

采用DLS及MRI檢測(cè)Fe3O4/HTCC的分散穩(wěn)定性。檢測(cè)方法為：將Fe3O4/HTCC納米粒以PBS(pH= 7.4)緩沖液稀釋至200 mg·L-1，取1.5 mL于EP管中，豎直固定靜止1月后，分別進(jìn)行DLS檢測(cè)和MR掃描，其中MR檢測(cè)中，觀察EP管中MR信號(hào)均勻性，以判斷Fe3O4/HTCC納米粒分散穩(wěn)定性和MR穩(wěn)定性。

1.6 細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)

取HTCC、Fe3O4、Fe3O4/HTCC納米粒于超凈工作臺(tái)過0.22 μm微孔濾膜除菌后，分別用PBS緩沖溶液(pH=7.4)稀釋成0.01、0.05、0.1、0.25、0.5 mg· mL-1懸浮液，4℃無菌保存。

K562(5×104)細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每濃度設(shè)6復(fù)孔，每孔加入100 μL樣品，空白對(duì)照加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)7 d，然后每孔加入MTT(5 mg· mL-1)(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后離心，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，室溫震蕩20 min，490 nm酶標(biāo)儀測(cè)OD值。

1.7 Fe3O4/HTCC納米粒的體內(nèi)MR成像

選取雄性SD大鼠(5月齡，揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物中心)，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40 mg·kg-1)，然后經(jīng)靜脈注射Fe3O4/HTCC納米粒PBS懸浮液(0.05 mmol·kg-1)。30 min后，膝關(guān)節(jié)線圈于GE Signa Echospeed 1.5T MR掃描儀進(jìn)行成像檢測(cè)，掃描參數(shù)：PDWI TE 10 ms，TR 3000 ms；視野12～14 cm，矩陣256×224，層厚2～4 mm，層間距0.5～1.0 mm。

圖1 HTCC的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1Structure scheme of HTCC

圖2 殼聚糖和HTCC的紅外光譜圖Fig.2FTIR spectrum of CS and HTCC

圖3 HTCC溶液中滴定體積-電位關(guān)系圖Fig.3Potential varition with titration volume of AgNO3in HTCC solution

2 結(jié)果與討論

2.1 季銨鹽化殼聚糖的結(jié)構(gòu)表征

本文首先通過開環(huán)加合制備HTCC，獲得乳白色粉末，結(jié)構(gòu)如圖1所示。并通過紅外光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。如圖2紅外光譜所示，CS紅外譜特征吸收峰為：3 409 cm-1(O-H伸縮振動(dòng))，1 680 cm-1(-NHCOCH3中C=O伸縮振動(dòng))，1 600 cm-1(脫乙酰化的-NH2中的N-H彎曲振動(dòng))，1 380 cm-1(酰胺三帶的特征吸收，C-N的伸縮振動(dòng))，1 163 cm-1(不對(duì)稱橋氧伸縮振動(dòng))，1 065 cm-1(骨架上的C-O伸縮振動(dòng))。從HTCC紅外譜圖中可以清晰地看出，在1 600 cm-1N-H的特征吸收峰的強(qiáng)度降低，這是由于CS中的氨基與GTA中的環(huán)氧基團(tuán)發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。與CS的紅外譜圖相比，HTCC的紅外譜在1 486 cm-1出現(xiàn)了一個(gè)新的特征吸收峰，這是GTA中-(CH3)3的C-H彎曲振動(dòng)吸收峰。紅外譜圖結(jié)果表明，HTCC成功合成。

為了進(jìn)一步對(duì)HTCC的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，采用電位滴定法測(cè)定HTCC的取代度。電位滴定以0.01 mol·L-1AgNO3滴定HTCC溶液中的Cl-濃度，從而計(jì)算得出HTCC的取代度，由圖3求導(dǎo)獲得滴定體積，公式(1)計(jì)算結(jié)果表明，本文獲得的HTCC的取代度為31.10%。

2.2 Fe3O4/HTCC納米粒的性質(zhì)表征

圖4為Fe3O4/HTCC納米粒的TEM圖。由圖可知，F(xiàn)e3O4/HTCC納米粒的粒徑為(14.5±2.2)nm，形貌大多為球形或類球型，且具有較好的分散性。

圖4 Fe3O4/HTCC納米粒的TEM圖Fig.4TEM morphologies of Fe3O4/HTCCNPs

為了研究Fe3O4/HTCC納米粒的分散性及穩(wěn)定性，將Fe3O4和Fe3O4/HTCC納米粒分散在PBS(pH= 7.4)緩沖液中，靜置一個(gè)月后研究其DLS分布。圖5是Fe3O4和Fe3O4/HTCC納米粒的DLS圖。由圖可知，F(xiàn)e3O4納米粒的平均粒徑為748 nm，分布系數(shù)(PDI)為0.525，說明未經(jīng)改性的Fe3O4納米粒極易聚集。而Fe3O4/HTCC的平均粒徑為128.3 nm，分布系數(shù)(PDI)為0.180。由DLS結(jié)果表明Fe3O4/HTCC納米粒的分散穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Fe3O4納米粒。這是由于季銨鹽帶正電荷，HTCC表面修飾Fe3O4納米粒后使Fe3O4/HTCC納米粒表面呈現(xiàn)正電性，從而具有較強(qiáng)的靜電排斥作用，足以克服由于磁偶極的相互吸引而產(chǎn)生的聚集作用，因此Fe3O4/HTCC納米粒表現(xiàn)出良好的分散穩(wěn)定性。

圖5 Fe3O4納米粒和Fe3O4/HTCC納米粒的DLS分布(pH=7.4)Fig.5size of Fe3O4andFe3O4/HTCCNPs by DLS (pH=7.4)

圖6 Fe3O4/HTCC納米粒的MR檢測(cè)(a)T2*WI，(b)T1WIFig.6MRI of Fe3O4/HTCCNPsat sequence T2*WI(a) and T1WI(b)

影劑的分散穩(wěn)定性對(duì)于其MR成像至關(guān)重要，因此我們又采用MR對(duì)Fe3O4/HTCC的分散穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測(cè)。

圖6是Fe3O4/HTCC靜置1月后MR的T2*WI及T1WI圖像，從圖中可以看出，各層面信號(hào)均勻，沒有出現(xiàn)由于Fe3O4沉積所導(dǎo)致的磁化偽影。表1是Fe3O4/HTCC T2*WI及T1WI圖像中不同層面相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度，從表中也可以看出，不同層面T2*WI及T1WI序列所測(cè)得相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度無顯著性差異。這說明Fe3O4/HTCC靜置一月后分散穩(wěn)定，這將有利于進(jìn)行體內(nèi)磁造影實(shí)驗(yàn)。

造影劑的磁性是進(jìn)行MRI的關(guān)鍵，因此通過VSM研究表面包裹HTCC對(duì)Fe3O4納米粒磁性的影響。

圖7是Fe3O4和Fe3O4/HTCC納米粒的VSM圖。由圖7的磁滯回線可知Fe3O4和Fe3O4/HTCC納米粒的矯頑力和剩磁值均為零，說明兩者均具有超順磁性。與Fe3O4粒子(飽和磁化強(qiáng)度67.4 emu·g-1)相比，F(xiàn)e3O4/HTCC納米粒的飽和磁化強(qiáng)度稍有降低，這是由于聚合物表面呈現(xiàn)磁惰性所致。然而其飽和磁化強(qiáng)度仍達(dá)64.41 emu·g-1，可以應(yīng)用于磁造影。

表1 Fe3O4/HTCC不同層面T2*WI及T1WI序列的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度Table 1Relative signal strength at different levels of Fe3O4/HTCC NPs tubes

圖7 Fe3O4和Fe3O4/HTCC納米粒的磁性圖Fig.7Magnetization curve of Fe3O4NPs and Fe3O4/ HTCC NPs

圖8 HTCC、Fe3O4及Fe3O4/HTCC納米粒的細(xì)胞相容性(培養(yǎng)7 d)Fig.8Cytocompatibility of HTCC,Fe3O4and Fe3O4/HTCC NPs for 7 days of cell culture

2.3 HTCC、Fe3O4及Fe3O4/HTCC納米粒的細(xì)胞相容性

圖8是K562細(xì)胞分別與HTCC、Fe3O4和Fe3O4/ HTCC納米粒作用后的存活情況。從圖中可以看出，培養(yǎng)7 d后，HTCC、Fe3O4、Fe3O4/HTCC納米粒濃度從0 mg·mL-1增加到0.5 mg·mL-1，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)，當(dāng)濃度低于0.05 mg·mL-1時(shí)，細(xì)胞7 d后的存活率均大于90%，而當(dāng)濃度高于0.05 mg·mL-1時(shí)，細(xì)胞與HTCC和Fe3O4/HTCC納米粒作用7 d后的存活率仍然超過80%，而細(xì)胞與Fe3O4作用7 d后，其存活率降為70%左右(P＜0.05)，表明Fe3O4經(jīng)HTCC修飾后可以有效改善其細(xì)胞相容性，F(xiàn)e3O4/ HTCC納米?？捎米鳚撛诘脑煊皠?/p>

2.4 Fe3O4/HTCC納米粒的體內(nèi)MR成像

圖9是注射前及注射Fe3O4/HTCC納米粒后大鼠腹腔MRI圖，從圖中可以看出，注射Fe3O4/HTCC納米粒前，大鼠肝實(shí)質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度與其他器官差別不明顯，注射Fe3O4/HTCC納米粒后，大鼠肝實(shí)質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度明顯下降。這說明Fe3O4/HTCC納米?？勺鳛殛幮詫?duì)比劑用于肝核磁共振造影。

圖9 注射前及注射Fe3O4/HTCC納米粒后大鼠肝臟MRI圖Fig.9MRI images of rat liver before(a)and after(b)injection of Fe3O4/HTCC NPs

3 結(jié)論

(1)通過帶正電荷的季銨鹽化殼聚糖衍生物，表面改性Fe3O4納米粒，成功制備出具有較強(qiáng)的超順磁性和良好的細(xì)胞相容性且在pH=7.4的模擬生理環(huán)境中具有良好分散穩(wěn)定性的Fe3O4/HTCC納米粒。

(2)Fe3O4/HTCC納米粒在PH＝7.4的模擬生理環(huán)境中MRI信號(hào)均勻，注射Fe3O4/HTCC納米粒后大鼠肝實(shí)質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度明顯下降。表明Fe3O4/HTCC納米?？勺鳛殛幮詫?duì)比劑用于肝核磁共振造影。

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Preparation and Liver MRI of Fe3O4/N-(2-Hydroxyl)propyl-3-trimethyl Ammonium Chitosan Contrast Agent

SONG Xiao-Li＊,1LUO Xia-Dan2LI Ling1ZHU Ai-Ping＊,1
(1College of Chemistry and Chemical Engineering,Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu 225002,China)
(2Jinhua Research Academy of Environmental Sciences,Jinhua,Zhejiang 321000,China)

Supermagnetic Fe3O4/N-(2-hydroxyl)propyl-3-trimethyl ammonium chitosan nanoparticles were synthesized by combining Fe3O4and CS chemically modified with glycidyl trimethyl ammonium chloride.Properties of the obtained nanoparticles were investigated by transmission electron microscopy,dynamic light scattering,magnetic resonance imagingandvibrationsamplemagnetometer.Thecytocompatibilityofthenanoparticleswereassessed.Then the in vivo MRI of the nanoparticles were confirmed.The results demonstrate that the nanoparticles are uniform and stable in simulated physiological environment.Also the nanoparticles show good cyto-compatibility.The in vivo results show that the parenchyma signal intensity of rats liver is significantly decreased after injection of the nanoparticles.Thus it indicatesthatthenanoparticleshavepotentialapplicationinliverMRI asanegativecontrast.

N-(2-hydroxyl)propyl-3-trimethyl ammonium chitosan;supermagnetic Fe3O4;suspension stablility;magnetic resonance imaging

O614.81+1

A

1001-4861(2015)10-1987-06

10.11862/CJIC.2015.230

2015-03-11。收修改稿日期：2015-06-26。

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.21201149)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012259)資助項(xiàng)目。

＊通訊聯(lián)系人。E-mail：xlsong@yzu.edu.cn，apzhu@yzu.edu.cn；會(huì)員登記號(hào)：S06N7485M1405。