劉聰

（中國農業(yè)大學，北京 100094）

小熊貓卵巢肥大細胞與雌性生殖干細胞的初步觀察

劉聰

（中國農業(yè)大學，北京 100094）

肥大細胞分布于皮膚及內臟粘膜下的微血管周邊，其與嗜堿性細胞結構和功能相似。此次研究中選取17只成體小熊貓卵巢進行研究，將其制成組織切片，并采用甲苯胺藍進行染色，觀察不同時期肥大細胞數量變化情況，研究結果顯示，不同時期小熊貓卵巢肥大細胞數量對比存在顯著差異，P＜0.05；采用免疫組化染色，卵巢中存在組胺陽性細胞，小鼠脈管同系物（MVH）在卵母細胞和生殖上皮中呈現陽性，說明小熊貓卵巢中有雌性生殖肝細胞存在，且肥大細胞與參與小熊貓生殖過程。

小熊貓；卵巢肥大細胞；雌性生殖干細胞

肥大細胞能分泌多種細胞因子，且能參與免疫過程，具有若吞噬功能。相關研究中對發(fā)情前期大鼠和倉鼠進行研究，研究結果顯示，卵巢肥大細胞參與卵巢功能，在不同發(fā)情周期中數量不同差異性。而近年來，相關研究結果顯示，成年哺乳動物卵巢中存在雌性生殖干細胞。因此此次研究中以成年小熊貓卵巢組織切片作為研究對象，研究肥大細胞與不同生理期之間的關系，總結小熊貓卵巢中肥大細胞雌性生殖干細胞之間的聯系，為臨床研究小熊貓生殖過程提供更多參考。現將具體研究內容進行報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物選取我市某動物園17只死亡雌性小熊貓作為研究對象，其死亡原因均為非生殖系統(tǒng)疾病。取小熊貓卵巢制成組織切片，包括5例發(fā)情期，6例妊娠期，6例發(fā)情期。

1.1.2 試劑使用試劑包括上?；瘜W試劑廠生產的甲苯胺藍、Alcian Blue 8GX（阿爾新藍）、Safranine O（番紅花紅），上海古朵生物科技有限公司生產的鼠抗組胺抗體、兔抗小鼠IgG1、鼠抗MVH抗體。

1.2 方法

1.2.1 樣品制作將小熊貓卵巢進行組織切片，形成1.5cm×1.5cm×0.5cm的組織切塊，將組織切片放入福爾馬林（40mL/L）中浸泡4h，保存溫度為4℃。依據組織學技術制成半連續(xù)石蠟切片，厚度5μm。

1.2.2 染色將組織切片放于固定液，使用甲苯胺藍進行染色。將石蠟切片脫蠟，呈水狀后使用甲苯胺藍浸泡，30s后使用雙蒸水洗，水洗2次后使用乙醇（950mL/L）分色，使用顯微鏡觀察，分色完成標準為肥大細胞出現紫紅色顆粒。將分色完成的組織切片使用乙醇脫水，放入二甲苯，封片。進行AB-S脫色時，將切片進行脫蠟，使用pH1.42醋酸鈉鹽酸緩沖液（含3.6g/L阿爾新藍8GX、0.18g/L番紅花紅O）染色，30min后經乙醇脫水，放入二甲苯，封片。

1.2.3 免疫組化染色將切片脫蠟，放入過氧化氫室（30mL/L）10min滅活，放入正常山羊血清（50mL/L）培養(yǎng)，30min后取出，放入pH7.0磷酸buffer液（鼠抗組胺抗體1:400/鼠抗MVH抗體、tritonX-100 0.2mL/L、bsat 0.1mL/L）孵育，保持4℃，使用PBS進行漂洗，室溫下將兔抗小鼠IgG1孵育1h，室溫下在過氧化物酶、生物素、抗生物素蛋白中孵育1h。使用PBS沖洗3次，使用蘇木素再次染色，脫水后封片。

1.3 統(tǒng)計學方法

按不同生理期將切片分組，每只小熊貓取5張切片，在顯微鏡下對切片觀察5個視野，取平均數。使用SPSS18.0軟件進行單因素分析處理，計量數據采用均數±標準差（±s）表示正態(tài)計量數據的組間比較采用t檢驗。當P＜0.05時表示有顯著差異，有統(tǒng)計學意義。

2 結果

發(fā)情期肥大細胞數為（11.1±0.5）個，妊娠期為（4.1±0.4）個，發(fā)情期為（8.4±0.3）個，發(fā)情期肥大細胞數與發(fā)情期相比明顯較多，t=11.109，差異具備統(tǒng)計學意義，P＜0.05。發(fā)情期肥大細胞數與妊娠期相比明顯較多，t=21.066，差異具備統(tǒng)計學意義，P＜0.05。經AB-S染色后可將其分為結締組織型、黏膜型、混合型。經免疫組化染色后，組胺陽性細胞在發(fā)情期時數量多，在妊娠期時數量較少，但細胞形態(tài)較大，在發(fā)情期時數量少，形態(tài)較小。小鼠脈管同系物（MVH）在卵母細胞中呈陽性，且在生殖上皮中也呈陽性。

3 討論

肥大細胞是嗜堿性細胞在結締組織或粘膜中存在的一種形態(tài)，其來源于造血干細胞，能參與MHC分子、B7分子表達具備APC功能；與嗜堿性細胞相同，肥大細胞具有強嗜堿性顆粒，其中含有肝素、組胺等物質，能引起速發(fā)過敏反應。

肥大細胞是組胺重要來源之一，因此其能參與內分泌腺活動。研究結果顯示發(fā)情期肥大細胞數與發(fā)情期相比明顯較多，發(fā)情期肥大細胞數與妊娠期相比明顯較多，P＜0.05。相關研究證明肥大細胞脫顆粒作用與排卵過程存在聯系，當排卵開始時，肥大細胞數將顯著減少。肥大細胞從發(fā)情期開始脫顆粒，數量顯著增加，隨生殖期變化，肥大細胞減少，脫顆粒及組胺也隨之減少，因此可以得出肥大細胞參與小熊貓生殖過程，在小熊貓生殖期中起一定調節(jié)作用。經免疫組化染色后，在卵母細胞和生殖上皮中均發(fā)現雌性生殖干細胞，以往認為哺乳動物出生后卵母細胞不再生，這種理論對不育現象治療產生極大阻礙。此次研究結果與成年雄性哺乳動物精元干細胞產生精子時期研究的相似。其證明了哺乳動物出生后能生成新的卵母細胞，成年雄性哺乳動物整個生命周期中精元干細胞均能產生精子和此次研究中成年小熊貓卵巢中雌性生殖干細胞的存在為小熊貓的繁殖過程提供了更多理論參考。

[1]修云芳，等.小熊貓卵巢肥大細胞與雌性生殖干細胞的初步觀察[J].動物醫(yī)學進展，2015，06:96-99.

[2]白耀富.豬卵巢源雌性生殖干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定[D].西北農林科技大學,2013.04.

[3]周勵.大鼠雌性生殖干細胞建系、生物學特性研究與應用[D].上海交通大學，2014.03-05.

[4]陳忠良，等.雌性哺乳動物生殖干細胞:在爭議中前進[J].生物化學與生物物理進展,2013,40（11）:1081-1087.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．11.010

劉聰（1992～），河北省衡水市人，本科，研究方向：動物醫(yī)學