賀番，賀瑜，孟寧生，陳宇浩

（內(nèi)蒙古烏蘭察布市集寧師范學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000）

奶牛乳房炎克雷伯氏菌的分離鑒定

賀番，賀瑜，孟寧生，陳宇浩

（內(nèi)蒙古烏蘭察布市集寧師范學(xué)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布 012000）

奶牛乳房炎又名奶牛乳腺炎，是由病原微生物感染而引起乳房組織及乳頭發(fā)炎的一種疾病，也是奶牛場最常見、防治最困難、花費成本最高的一種疾病，該病不僅影響產(chǎn)奶量和牛奶的品質(zhì)，而且危及人的飲用安全，給我區(qū)的奶業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失?？死撞蠗U菌是乳房炎的主要病原菌之一。本試驗對烏蘭察布市周邊某小區(qū)奶牛養(yǎng)殖場中患乳房炎病牛的乳汁中進行了病原菌的分離，得到4株菌，分別編號為K1、K2、K3、K4。通過對它們的培養(yǎng)特性、形態(tài)以及染色特征的觀察和對其進行生化特性的檢測，以及進一步經(jīng)動物實驗鑒定表明這4株菌中有3株為克雷伯氏桿菌，通過上述微生物學(xué)診斷方法，表明該奶牛養(yǎng)殖場本次奶牛的乳房炎是與克雷伯氏桿菌感染有關(guān)，進一步的藥敏試驗表明該分離菌對慶大霉素最敏感，應(yīng)將慶大霉素定為首選藥物，其次是鏈霉素、頭孢唑啉，該菌對青霉素耐藥。

克雷伯氏菌；分離；鑒定

奶牛乳房炎是奶牛乳腺受到物理、化學(xué)、微生物刺激所發(fā)生的一種炎性變化，乳汁中體細胞含量增加，乳腺組織，受到不同程度的破壞，是奶牛的常發(fā)病之一。乳房炎對世界乳牛養(yǎng)殖業(yè)危害大，其發(fā)病率也相當(dāng)高。據(jù)有關(guān)資料報道，國外奶牛乳房炎的發(fā)病率約為25%～60%，據(jù)我國有關(guān)部門不完全統(tǒng)計，乳房炎作為我國奶牛場最嚴(yán)重的疾病之一，發(fā)病率達20%～70%，造成的經(jīng)濟損失嚴(yán)重。目前，呼和浩特市地區(qū)乳業(yè)持續(xù)高速發(fā)展，奶業(yè)已經(jīng)成為首府經(jīng)濟發(fā)展和農(nóng)牧民致富奔小康的支柱產(chǎn)業(yè)，但由于飼養(yǎng)管理差，疾病的防治技術(shù)落后，個體養(yǎng)牛戶濫用抗生素現(xiàn)象普遍，呼和浩特市也成為了乳房炎的多發(fā)地區(qū)。

引起乳房炎的各種因素中病原微生物達80多種，但絕大部分（＞95%）是由細菌引起的，其中克雷伯氏桿菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一。本研究對烏蘭察布市周邊某小區(qū)奶牛養(yǎng)殖場中患乳房炎病牛的乳汁進行病原菌分離鑒定，以期對牛乳房炎疫苗研制、篩選敏感藥物和治療等提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料烏蘭察布市周邊某小區(qū)奶牛養(yǎng)殖場中患乳房炎病牛的乳汁3份

1.1.2 培養(yǎng)基蛋白胨水溶液，三糖鐵瓊脂斜面，葡萄糖蛋白胨水溶液，甲基紅試劑，VP試劑，枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，半固體普通瓊脂培養(yǎng)基，生化鑒定培養(yǎng)基，氏尿素瓊脂培養(yǎng)基

1.1.3 藥敏紙片頭孢唑啉、青霉素G、慶大霉素、鏈霉素，共4種（由中國藥品生物制品檢定所提供）。

1.1.4 實驗動物內(nèi)蒙古大學(xué)動物實驗中心提供的10只健康小白鼠，體質(zhì)量均在22g左右。

1.2 方法

1.2.1 分離培養(yǎng)將乳樣接種到麥康凱平板上培養(yǎng)18h后取出，觀察長出的菌落形態(tài)，根據(jù)落的形態(tài)、大小、顏色等將菌落大致分類，然后配合顯微鏡下檢查觀察細菌的形態(tài)、革蘭氏染色特點仔細進行分類，排除環(huán)境中常存在的無致病性細菌，一般為革蘭氏染色呈陰性的桿菌。將篩選細菌純培養(yǎng)。

1.2.2 生化試驗純培養(yǎng)后鏡檢無雜菌者按有關(guān)生化鑒定方法進行生化鑒定，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3 藥物敏感性試驗吸取100μL分離到的細菌純培養(yǎng)物，涂布于普通瓊脂平板，室溫放置表面干燥后將4種藥物紙片按4片/平皿均勻貼于培養(yǎng)基表面。將平皿倒置于37℃溫箱中持續(xù)培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑并進行記錄，判斷病原菌對各種藥物的敏感性。藥物抑菌能力的判定按中國藥品生物制品檢定所、國家抗菌藥物細菌耐藥性監(jiān)測中心提供的抗菌藥物藥敏紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)進行判斷。

1.2.4 動物致病性試驗將克雷伯氏菌液腹腔接種10只試驗小白鼠，每只注射0.2×107個菌，觀察小白鼠的臨床癥狀及死亡率。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基形態(tài)特點和涂片染色鏡檢結(jié)果

克雷伯氏菌麥康凱培養(yǎng)基上可形成黏液狀濃厚、圓凸、閃光、豐盛的菌落，以接種環(huán)挑之易成絲。菌株革蘭氏染色為陰性，呈桿狀（圖1，圖2）。

圖1

圖2

2.2 生化試驗結(jié)果

按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》所介紹相應(yīng)的科屬下的各個種的生理生化指標(biāo)為依據(jù)，經(jīng)細菌培養(yǎng)特性，菌落形態(tài)，生化特性等鑒定表明：本實驗分離的4種菌有3株為克雷伯氏菌。

依據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，從菌落形態(tài)，染色特性，溶血情況及各項生理生化特性可以判定K1、K2、K3為克雷伯氏菌。

2.3 藥敏實驗結(jié)果

從試驗結(jié)果可以看出我們所分離出的4株菌中對慶大霉素敏感率最高，結(jié)果表明此牛場奶牛乳房炎病原菌對慶大霉素敏感，對其它類藥物均產(chǎn)生不同程度的耐藥性（表2）。

表2 藥敏實驗結(jié)果

2.4 動物實驗結(jié)果

接種克雷伯氏菌的10只試驗小白鼠均在初期精神沉郁，呼吸加快等癥狀，24h開始死亡，最終7只實驗鼠死亡，死亡后剖檢可見腹腔粘液增多，脾臟腫大出血，胰腺有出血點，肺臟嚴(yán)重充血增大等病變。

3 討論

經(jīng)過對牛場飼養(yǎng)管理、衛(wèi)生條件和消毒措施的調(diào)查結(jié)果，結(jié)合對奶牛環(huán)境性乳房炎病原的分離鑒定，表明奶牛環(huán)境性乳房炎主要是由環(huán)境性病原菌感染引起的。本研究對烏蘭察布市周邊某小區(qū)奶牛養(yǎng)殖場中患乳房炎病牛的乳汁中進行了病原菌的分離，得到4株疑似的克雷伯氏菌，通過常規(guī)實驗室細菌的分離與鑒定，確定其為克雷伯氏菌，藥物敏感性表明本次分離到的克雷伯氏菌對慶大霉素敏感，本研究對于研制有效的疫苗、篩選敏感藥物預(yù)防和治療內(nèi)蒙地區(qū)乳房炎具有重要意義。

同時本研究結(jié)果表明烏蘭察布地區(qū)克雷伯氏菌引發(fā)奶牛乳房炎較為嚴(yán)重，應(yīng)該予以重視。目前，該地區(qū)奶牛主要舍內(nèi)飼養(yǎng)，由于動物的活動受到限制以及環(huán)境性病原菌（主要是大腸桿菌、克雷伯氏菌、乳房鏈球菌及停乳鏈球菌）在牛體外環(huán)境的繁殖，從而增加了乳頭感染的機會，促使乳房炎的發(fā)生。因此，保持良好的環(huán)境衛(wèi)生防止細菌的繁殖是預(yù)防的關(guān)鍵。預(yù)防環(huán)境性乳房炎建議加強飼養(yǎng)管理，增強奶牛體質(zhì)，同時做好奶牛乳房炎的檢測工作，發(fā)現(xiàn)病牛及時隔離，并及早進行治療，以防止病原的蔓延擴散，對新引進的奶牛要進行隔離檢查。

表1 生化試驗結(jié)果

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[3]李少英，等主編:食品微生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)自編教材，1998，23-24，68-76.

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．11.009