席紹峰，李慧勇，譚建華，徐漢虹，王繼才，熊小婷，趙田甜，冼燕萍，郭新東（1.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣東廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，廣東廣州 510642.廣州質量監(jiān)督檢測研究院，國家化妝品質量監(jiān)督檢驗中心（廣州），廣東廣州 510110；）

SPE-UPLC-Q-TOF MS測定育發(fā)化妝品中人參和甘草類功效成分

席紹峰1，2，3，李慧勇3，譚建華3，徐漢虹1，2，王繼才3，熊小婷3，
趙田甜3，冼燕萍3，郭新東3
（1.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣東廣州 510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，廣東廣州 510642
3.廣州質量監(jiān)督檢測研究院，國家化妝品質量監(jiān)督檢驗中心（廣州），廣東廣州 510110；）

建立了甲醇超聲提取，陰離子交換固相萃?。⊿PE）凈化，超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法（UPLC-Q-TOF MS）測定育發(fā)化妝品中3種人參皂甙（Rg1、Rb1、Re）和2種甘草類功效成分（甘草次酸和光甘草定）。樣品采用甲醇超聲提取，MAX（500g／6L）固相萃取小柱凈化，以甲醇-0.002%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，在色譜柱HSS T3（2.1m×100mm×1.8μm）上分離，于UPLC-Q-TOF MS負離子模式下檢測。同時，對固相萃取條件和色譜-質譜條件進行了優(yōu)化，并對方法學進行了驗證。結果表明：5種目標化合物在5～200μg／L濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關系，線性相關系數(shù)大于0.999；方法檢出限為0.03～0.1mg／kg（S／N＝3）；在膏霜和洗發(fā)水基質中的加標回收率為71.9%～94.2%，相對標準偏差小于15.4%（n＝6）；分子質量偏差小于5×10-6。該方法適用于育發(fā)化妝品（特別是表面活性劑及油脂含量高的樣品）中人參皂甙和甘草類功效成分的定性定量檢測。

固相萃取（SPE）；超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF MS）；育發(fā)化妝品；人參；甘草；功效成分

人參和甘草是常見的中草藥植物，已有研究證明，人參和甘草提取物除了在皮膚護理領域中具有美白功效［1-2］外，也表現(xiàn)出較好的育發(fā)功效。趙玉磊等［3］和Park等［4］均通過C57BL／6小鼠模型的毛囊細胞實驗證明了人參等中藥能明顯減少退行期毛囊內(nèi)細胞凋亡，誘導和延長毛發(fā)的生長期；朱海琴等［5］研究認為甘草提取物能增強毛乳頭細胞分泌VEGF，從而起到促進毛發(fā)生長的作用。隨著對人參、甘草提取物育發(fā)功效研究的深入，它們在育發(fā)化妝品中的應用日益廣泛。然而，由于相關檢測方法的缺失，目前對于市售人參和甘草提取物類育發(fā)化妝品的質量監(jiān)管基本處于空白，導致出現(xiàn)了較多假冒偽劣、虛假宣傳等不良現(xiàn)象。因此，亟需建立相應的檢測方法對育發(fā)化妝品中人參和甘草類功效成分進行測定。

目前，關于人參和甘草類功效成分的檢測研究大多是針對中藥材植物［6-11］和藥物產(chǎn)品［12-16］等，主要采用高效液相色譜法［15-16］和高效液相色譜-質譜聯(lián)用法［6-14］進行檢測。其中，由于人參皂甙類化合物的紫外吸收為末端吸收，常用的高效液相色譜-紫外檢測法在分析基質較為復雜的樣品時，往往無法取得滿意的靈敏度和選擇性。在高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術中，飛行時間質譜由于能獲得化合物的精確質量數(shù)、準確的同位素豐度及豐富的質譜信息，在植物功效成分的定性或定量檢測研究［6，9-11］具有突出優(yōu)勢。

本實驗選擇3種人參皂甙（Rg1、Rb1、Re）和2種甘草功效成分（甘草次酸和光甘草定）為檢測對象，其結構式示于圖1。采用固相萃取技術對含高表面活性劑的育發(fā)化妝品進行有效凈化，結合超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質譜技術，定性定量檢測育發(fā)化妝品中人參和甘草類功效成分。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

圖1 5種目標化合物的結構式Fig.1 Structures of 5target compouds

超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時間質譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源（ESI）及Masslynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Allegra 64R高速冷凍離心機：德國Beckman公司產(chǎn)品；MS3basic漩渦混合器：德國IKA公司產(chǎn)品；BG-02C型超聲波發(fā)生器：廣州邦潔超聲設備有限公司產(chǎn)品；24孔位固相萃取裝置：上海安譜有限公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

人參皂甙Rg1、人參皂甙Rb1、人參皂甙Re、甘草次酸和光甘草定對照品：純度均大于99.0%，上海詩丹德生物技術有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈：色譜純，美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；甲酸、氨水、磷酸氫二鈉：色譜純，上海安譜公司產(chǎn)品；待分析的化妝品樣品：購自本地不同市場。

OasisHLB小柱（60g／3L）、Sep-Pak C18小柱（60g／3L）、OasisWAX小柱（60g／3L）、OasisMAX小柱（60g／3L、50g／6L、500g／6L）：均為美國Waters公司產(chǎn)品。

分別稱取10.0mg（精確至0.01mg）對照品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1g／L的單標標準儲備液。分別吸取適量的標準儲備液，用甲醇配制成所需的系列混合標準工作溶液，于4℃避光保存。

1.3 實驗條件

1.3.1 樣品的制備與提取 準確稱取0.5g（精確至0.001g）試樣于10 mL具塞比色管中，用甲醇定容至刻度，于漩渦振蕩器上混合，使樣品分散1min，超聲提取15min，取上清液于離心管中；以10 000r／min離心5min后，準確量取2mL上清液，加入8mL純凈水，混勻，待固相萃取凈化。

1.3.2 固相萃取凈化 用6mL甲醇、6mL水活化平衡MAX固相萃取柱，將1.3.1節(jié)中制備的溶液以不高于1mL／min的流速通過萃取小柱后，依次用6 mL 5%氨水溶液淋洗，10mL甲醇-水溶液（75∶25，V／V）洗脫人參皂甙Rg1、人參皂甙Rb1和人參皂甙Re，10mL甲醇淋洗高脂溶性雜質，12mL 2%甲酸甲醇溶液洗脫甘草次酸、光甘草定。2種洗脫液分別于65℃水浴中氮吹至小于1 mL，加甲醇至2mL，復溶（可根據(jù)樣品中目標化合物含量的高低來調(diào)整復溶溶劑體積的大?。^濾，待UPLC-Q-TOF MS測定。

1.3.3 色譜條件 色譜柱：HSS T3（2.1m× 100mm×1.8μm）；柱溫：35℃；進樣體積：5μL；流速：0.3mL／min；流動相：A為0.002%甲酸水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～2 min、40%～60%B，2～5 min、60%～100%B，6～8min、100%～40%B。

1.3.4 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），負離子模式；毛細管電壓：2.5kV；萃取錐孔電壓：45V；脫溶劑氣溫度：450℃；離子源溫度：100℃；脫溶劑氣流速：600L／h；錐孔氣流速：50L／h；四極桿采集質量數(shù)范圍：m／z100～1 000。數(shù)據(jù)采集模式：棒狀（centroid）；掃描采集時間：0.2s；TOF運行模式：V模式；以200μg／L亮氨酸腦啡肽（m／z 554.261 5）溶液進行實時校準。

2 結果與討論

2.1 SPE條件優(yōu)化

育發(fā)化妝品基質復雜，其表面活性劑和油脂的含量很高，如果不經(jīng)凈化直接進入質譜儀會引起嚴重的離子抑制，甚至會污染整個質譜系統(tǒng)。本研究選擇最常見的兩種育發(fā)化妝品，即膏霜（含油脂和非離子表面活性劑）和洗發(fā)液（含陰離子表面活性劑）樣品，采用簡單溶劑提取后進入UPLC-Q-TOF MS分析。結果發(fā)現(xiàn)：在膏霜樣品中，色譜保留較強的甘草次酸和光甘草定的響應抑制為10%～50%，這主要是因為與硬脂酸酯等油脂類化合物共出峰而產(chǎn)生的離子抑制；在洗發(fā)液樣品中，高含量的十二烷基硫酸銨（ALS）、月桂醇聚醚硫酸酯鈉（AES）等陰離子表面活性劑幾乎將人參皂甙Rb1、甘草次酸和光甘草定的離子響應完全抑制，甚至造成嚴重的殘留效應，其總離子流圖示于圖2。基于以上原因，本研究采用固相萃取方式對樣品進行凈化。

圖2 洗發(fā)液樣品經(jīng)MAX柱凈化（a）和未經(jīng)凈化（b）的總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatograms of paste shampoo with purified by MAX（a）and no purification（b）

實驗比較了4種不同填料類型的固相萃取小柱的凈化效果，包括以反相保留為主的OasisHLB和Sep-PakC18柱、弱陰離子交換的OasisWAX柱、強陰離子交換的OasisMAX柱。實驗發(fā)現(xiàn)：HLB和C18柱只能去除少量強保留的油脂，卻無法去除陰離子表面活性劑；WAX柱能去除陰離子表面活性劑，但很難使弱離子交換能力的甘草次酸和光甘草定與陰離子表面活性劑完全分離；MAX柱為聚合物基質的混合型強陰離子交換柱，同時具有陰離子交換和反相保留能力。

待分析的5種目標化合物的化學性質參數(shù)列于表1。其中，3種人參皂苷類物質的反相保留相對較弱，可通過優(yōu)化洗脫溶劑強度與油脂雜質分離；而2種甘草類物質由于具有酚羥基，可通過離子交換吸附在色譜柱上進行鎖定保留，采用甲醇淋洗將無離子交換能力的非極性油脂完全去除。由于MAX柱的強陰離子交換能力可以將陰離子表面活性劑進行不可逆的吸附；甘草次酸和光甘草定與MAX柱的吸附較弱，但采用2%甲酸甲醇溶液即能完全洗脫，從而達到油脂與陰離子表面活性劑雜質的完全分離。因此，本研究采用MAX柱對樣品提取液進行凈化。

表1 目標化合物的化學性質參數(shù)Table 1 Chemical properties of target compouds

實驗進一步比較了不同規(guī)格的MAX柱（60g／3L、150g／6L和500g／6L）的凈化效果。結果發(fā)現(xiàn)，由于MAX的離子交換量較?。s為0.25meq／g），而洗發(fā)液中的陰離子表面活性劑含量可能超過5%，甚至更高，導致在本方法的稀釋倍數(shù)下，陰離子表面活性劑在60g／3L 和150g／6LMAX柱上因吸附過載而被洗脫。因此，本研究采用500g／6L的MAX柱。

確定固相萃取柱之后，實驗優(yōu)化了人參皂甙Rg1、人參皂甙Rb1、人參皂甙Re的洗脫溶劑條件。采用體積比分別為60∶40、70∶30、75∶25、80∶20的甲醇-水溶液對目標化合物進行洗脫，結果示于圖3。由圖3可見，人參皂甙Rg1和人參皂甙Re在體積比為60∶40的甲醇-水溶液條件下能被基本洗脫，而人參皂甙Rb1在體積比為75∶25的甲醇-水溶液條件下才能被完全洗脫?？紤]到甲醇的比例越高，雜質被洗脫的越多，因此，本研究采用體積比為75∶25的甲醇-水溶液對人參皂甙Rg1、人參皂甙Rb1和人參皂甙Re進行洗脫。

圖3 3種人參皂甙化合物的固相萃取洗脫條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of SPE washing conditions of three ginsenoside compouds

對空白育發(fā)膏霜和洗發(fā)液進行樣品加標回收實驗時發(fā)現(xiàn)，樣品稀釋液（上固相萃取柱的溶液）中甲醇比例的高低將會影響膏霜樣品中甘草次酸和光甘草定的加標回收率。這可能是因為膏霜樣品中含油脂成分較高，樣品的甲醇提取液用純凈水稀釋后會由于油脂溶解度的降低而產(chǎn)生渾濁乳化現(xiàn)象。由于甘草次酸和光甘草定具有較高的酯溶性（log P值已列于表1），可能會在渾濁小顆粒上被少量吸附，而使回收率偏低。本研究嘗試采用破乳、過濾等方法去除小顆粒，均未能有效提高回收率，而通過增加稀釋液中的甲醇比例，使膏霜中油脂小顆粒減少，卻能提高甘草次酸和光甘草定的回收率。但是，由于人參皂甙Rg1、人參皂甙Rb1和人參皂甙Re的反相保留能力較弱，增加稀釋液的甲醇比例至30%時即會導致人參皂甙Rg1發(fā)生部分流失。經(jīng)綜合考慮，本研究將樣品的甲醇提取液用超純水按甲醇-水（2∶8，V／V）的比例稀釋后再過固相萃取小柱。

2.2 UPLC-Q-TOF MS條件優(yōu)化

研究了5種目標化合物在電噴霧正負離子模式下的響應特點，結果顯示，5種化合物在正負離子模式下均有較強的離子響應，其中，3種人參皂甙化合物在正離子模式下主要以［M＋Na］＋形式存在?？紤]到育發(fā)化妝品中常用的非離子型表面活性劑（如脂肪醇聚氧乙烯醚等）在正離子模式下的離子響應特別強，會對目標化合物產(chǎn)生離子抑制，本研究選用負離子模式進行分析。

通過比較不同流動相溶液（甲醇-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液）對5種目標化合物的色譜峰形和離子化效率的影響，發(fā)現(xiàn)3種人參皂甙化合物在乙腈體系流動相中的離子化效率要低于甲醇體系。由于甘草次酸具有羧基基團（pKa＝4.44），含甲酸的流動相能使其獲得對稱、尖銳的峰型，示于圖3，但流動相中的甲酸同時會對目標化合物產(chǎn)生離子抑制。本研究采用不同體積濃度的甲酸水溶液（0.001%、0.002%、0.005%、0.020%、0.010%、0.1%）為流動相進行實驗，結果發(fā)現(xiàn)，流動相中甲酸濃度在0.002%時，目標化合物的離子抑制不明顯，且能保證較好的色譜峰形，但隨著甲酸濃度的增加，離子抑制效應越來越強。因此，本研究選用甲醇-0.002%甲酸水溶液為流動相。

5種目標化合物的提取離子質譜圖示于圖4。5種目標化合物的分子離子［M-H］-較為穩(wěn)定，具有較強的豐度響應，但是，由于流動相體系中含有一定比例的甲酸，3種人參皂甙化合物的加酸離子［M＋HCOO］-也表現(xiàn)出較高豐度。因此，本研究以［M-H］-和［M＋HCOO］-為目標，對毛細管電壓、錐孔電壓、萃取電壓、脫溶劑氣溫度、離子源溫度、脫溶劑氣流速等質譜參數(shù)進行了優(yōu)化。結果發(fā)現(xiàn)，錐孔電壓對于［M-H］-和［M＋HCOO］-豐度的影響較大，且5種目標化合物最佳靈敏度時的錐孔電壓均不一致。為了使5種目標化合物均能得到較為滿意的靈敏度，本研究最終選擇錐孔電壓為50V，人參皂甙Rg1選?。跰＋HCOO］-為定量離子，其他化合物均選?。跰-H］-為定量離子。另外，本實驗同時采集第2質譜通道，通過施加梯度碎裂電壓（20～55V）將定量離子打碎，得到一個最大豐度的碎片離子峰。通過保留時間，分子離子和一個碎片離子的精確質量數(shù)進行定性確證。結果顯示，本實驗得到的分子質量準確度較高，與理論值的誤差均在5×10-6以內(nèi)，詳細數(shù)據(jù)列于表2。

分別配制質量濃度為5.0～200μg／L的系列標準溶液，在本實驗條件下，對目標化合物進行測定，根據(jù)定量離子豐度面積積分值（y）與相應質量濃度（x，μg／L）的響應關系，得到線性回歸方程及線性相關系數(shù)，結果列于表3。結果表明，在5.0～200μg／L范圍內(nèi)，5種目標化合物的線性關系良好，R2均在0.999以上。本實驗采用基質樣品加標，通過計算標樣的響應與背景噪音的比值（S／N＝3），得到3種人參皂甙的方法檢出限均為0.1mg／kg，甘草次酸和光甘草定的方法檢出限為0.03mg／kg。

2.3 方法回收率和精密度選用膏霜和洗發(fā)水兩種不同基質類型的空白育發(fā)化妝品為加標基質，進行0.1、1.0、2.0mg／kg 3個添加水平的回收率與精密度實驗，結果列于表4。結果顯示，3個濃度添加水平的回收率為71.9%～94.2%，相對標準偏差小于15.4%。

圖4 5種目標化合物的提取離子質譜圖Fig.4 Extracted ion chromatograms of 5target compouds

表2 目標化合物的保留時間，精確分子質量，理論分子質量和質量精確度Table 2 Retention time，accurate molecular mass，theory molecular mass and mass accuracy of target compouds

表3 目標化合物的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)和方法檢出限Table 3 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients（R2）and method detection limit of five target analytes

表4 回收率和精密度測定結果（n＝6）Table 4 Determination results of recoveries and precisions（n＝6）

2.4 實際樣品的測定

采用本方法對10份育發(fā)化妝品進行人參皂甙Rg1、人參皂甙Rb1、人參皂甙Re、甘草次酸和光甘草定含量的檢測。實驗結果顯示，在其中的2份育發(fā)化妝品中檢出人參皂甙Rg1、人參皂甙Rb1和人參皂甙Re，含量在10～32mg／kg之間，典型的育發(fā)化妝品的提取離子質譜圖示于圖5。

3 結論

本工作建立了固相萃取-超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法分析測定育發(fā)化妝品中3種人參功效成分和2種甘草功效成分。通過采用強陰離子交換固相萃取凈化技術，同時利用其離子交換和反相保留能力，有效地解決了育發(fā)化妝品中高含量表面活性劑和油脂的強基質干擾問題。將超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法應用于育發(fā)化妝品中人參和甘草類功效成分的鑒定，具有高靈敏度和高確證性的特點，可為育發(fā)化妝品中相關功效成分的質量監(jiān)控提供重要的方法依據(jù)。

圖5 典型的育發(fā)化妝品中5種目標化合物的提取離子質譜圖Fig.5 Extracted ion chromatograms of 5target compounds in real sample

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Determination of Active Constituents of Ginseng and Glycyrrhizae in Hair Growth Cosmetics by SPE-UPLC-Q-TOF MS

XI Shao-feng1，2，3，LI Hui-yong3，TAN Jian-hua3，XU Han-hong1，2，WANG Ji-cai3，XIONG Xiao-ting3，ZHAO Tian-tian3，XIAN Yan-ping3，GUO Xin-dong3
（1.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agrobioresources，Guangzhou510642，China；
2.The College of Agricultural of South China Agricultural University，Guangzhou510642，China；
3.Guangzhou Products Quality Supervision and Testing Institute，National Center
for Quality Supervision and Testing of Cosmetics（Guangzhou），Guangzhou510110，China）

A method for the determination of three active constituents of ginseng（ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1and ginsenoside Re）and two active constituents of gly-cyrrhizae（glycyrrhetic acid and glabridin）in hair growth cosmetics was developed by strong anion exchange-solid phase extraction（SPE）combined with ultra-performance liquid chromatography quadrupole-time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF MS）.The sample was extracted by methanol through ultrasonic wave，and purified by SPE（MAX，500g／6L）cartridge.Chromatographic separation was conducted on an UPLC HSS T3（2.1m×100mm×1.8μm）column with gradient elution using methanol and 0.002%fomic acid solution as mobile phases.MS analysis was set in electrospray ionization operated in negative mode.The experiment conditions of SPE（adsorbing materials and washing solvents）and UPLC-Q-TOF MS（mobile phases，ionization mode and mass spectrometric parameters）were optimized.The results demonstrate that the method shows good linearity in the concentration range of 5-200μg／L，with correlation coefficients no less than 0.999for the five investigated analytes.The limits of detection are in the range of 0.03-0.1mg／kg（S／N＝3）.The average recoveries in sample matrix of cream and paste shampoo are from 71.9%to 94.2%with relative standard deviations （RSDs）less than 15.4%（n＝6）.High resolution Q-TOF MS gives accurate mass measurement for identification of the target analytes from complicated matrices，with mass errors below 5×10-6.The method is suitable for the determination of ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1，ginsenoside Re，glycyrrhetic acid and glabridin in hair growth cosmetics，particularly for those containing high content of surfactants and greases.

solid phase extraction（SPE）；ultra-performance liquid chromatography quadrupole-time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF MS）；hair growth cosmetics；ginseng；glycyrrhizae；active constituents

O657.63

A

1004-2997（2015）04-0341-09

10.7538／zpxb.youxian.2015.0022

2014-09-11；

修回日期：2014-11-15

國家質檢總局公益性行業(yè)科研專項項目（2012104013-3）；廣東省質量技術監(jiān)督局科技項目（2011cz01）資助

席紹峰（1972—），男（漢族），河南人，高級工程師，從事色譜質譜檢測技術研究。E-mail：davidxi-007＠163.com

譚建華（1982—），男（漢族），湖南人，博士研究生，從事色譜質譜檢測技術研究。E-mail：tanjianhua0734＠aliyun.com

時間：2015-05-26

；

http：∥www.cnki.net／kcms／detail／11.2979.TH.20150526.0903.004.html