粟智平++楊益娥++趙偉鐸++李金慶++鄧叢良++尹偉力

摘要 番茄叢矮病毒（ToBSV）是我國進(jìn)境植物檢疫對象，也是進(jìn)境種子苗木等必檢項目。該病毒能侵染番茄、曼陀羅、葡萄、豇豆等20余科120余種植物。該研究根據(jù)ToBSV全基因組中p33蛋白基因，設(shè)計引物和TaqMan探針，建立了半巢式實時PCR檢測ToBSV的新方法。該研究巧妙地融合了巢式PCR和TaqMan探針技術(shù)，第二步半巢式-RT-Realtime PCR既進(jìn)一步放大了第一步檢測信號，也是對第一步PCR產(chǎn)物的確認(rèn)，與單一的巢式PCR或Realtime PCR等方法相比其檢測的準(zhǔn)確性、靈敏度更高。該方法檢測靈敏度可達(dá)50 fg/μL植物總RNA。

關(guān)鍵詞 番茄叢矮病毒（ToBSV）；半巢式RT-Realtime PCR；檢測

中圖分類號 S41-30 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）18-0148-03

Dectection of Tomato Bushy Stunt Virus by Semi-nested RT-Realtime PCR

SU Zhi-ping 1 YANG Yi-e 2 ZHAO Wei-duo 1 LI Jin-qing 1 DENG Cong-liang 3 YIN Wei-li 1

（1 Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai Shandong 264000； 2 Huitong County Agriculture Bureau of Hunan Province；

3 Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

Abstract Tomato bushy stunt virus（ToBSV）is a plant quarantine object in China，and it is a required inspection item for the imported grapes and so on.This virus can infect 120 kind of 20 families of plants，such as tomato，Datura stramonium L.，grape and cowpea.Three nested primers and one TaqMan probe were designed according to the p33 protein gene of the ToBSV，with which we set up a new method of semi-nested RT-Realtime PCR to detect the ToBSV.The nest-PCR and the probe-detection technique were combined maneuverably in this study.The semi-nested RT-Realtime PCR in the second step can both magnify the sigal and validate the result of the first step，which can provide a more sensitive and specific detection of the ToBSV.The sensitivity of the method can reach 50 fg/μL of total plant RNA.

Key words tomato bushy stunt virus（ToBSV）；semi-Nested RT-Realtime PCR；dectection

番茄叢矮病毒（ToBSV）屬番茄叢矮病毒科番茄叢矮病毒屬病毒[1]。該病是我國對外制種的檢疫對象，也是進(jìn)境葡萄等種子苗木必須施檢的項目。近年來，為了促進(jìn)我國葡萄業(yè)及葡萄酒產(chǎn)業(yè)的壯大，我國從美國、法國、意大利等進(jìn)口大量葡萄苗。這些葡萄苗大都來自番茄叢矮病毒的疫區(qū)，極有可能攜帶有該病毒，因此，開發(fā)出快速、靈敏檢測ToBSV的技術(shù)意義重大。

ToBSV病毒粒體為球狀，直徑30 nm，正20面多角體，分散在細(xì)胞質(zhì)和液泡內(nèi)。其體外存活期為幾周，致死溫度為80～90 ℃條件下10 min。該病毒能侵染番茄、曼陀羅、葡萄、豇豆等20余科120余種植物[2]。苗期受害后，初有環(huán)狀壞死斑出現(xiàn)，葉片褪綠且掉落。如果苗期施用氮肥過多，在莖組織中發(fā)展很快，莖部變軟，引起猝倒。系統(tǒng)癥狀表現(xiàn)為頂部壞死或幼葉卷曲，有叢生或側(cè)芽增生。病株底部葉片褪綠和變紫，番茄成熟果實上除有褪綠斑之外，還可產(chǎn)生平行斑或環(huán)斑。

ToBSV在積水的土壤條件下經(jīng)汁液傳毒進(jìn)入寄主植株。尚未明確侵染方法，但可能通過損傷的根細(xì)胞侵入。ToBSV即使通過人、畜的消化道也不能被消化，不改變其傳染性，因此人和動物被推斷認(rèn)為是該毒原的一種傳播途徑。此外，采用污水和淤泥作為肥料時，有可能傳播該病毒[3]。

目前，免疫電鏡、寄主癥狀和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等是國內(nèi)外檢測番茄叢矮病毒的重要方法之一[4]。但各種檢測技術(shù)均有弊端。該文提供了一套“半巢式反轉(zhuǎn)錄實時熒光PCR（即半巢式-RT-Realtime PCR）”檢測ToBSV的分子技術(shù)，該項檢測技術(shù)具有更快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏等特點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

番茄叢矮病毒（ToBSV）、藜草花葉病毒（SoMV）、草莓潛環(huán)斑病毒（SLRSV）、番茄黑環(huán)病毒（TBRV）和桃叢簇花葉病毒（PRMV），核酸由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院動植物檢疫研究所提供。endprint

核酸蛋白分析儀為BioPhotometer（德國eppendorf公司）；實時熒光PCR基因擴增儀為ABI PARISM 7000（美國ABI公司）；納米磁珠法植物總RNA提取試劑盒由北京出入境檢驗檢疫局提供；實時熒光PCR試劑盒（PlatinumR定量 PCR SuperMix-UDG，貨號：C11730-025）購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：DRR037A）購自大連寶生物公司（TaKaRa）。

1.2 TaqMAN探針與引物的設(shè)計合成

在NCBI中查詢到ToBSV全基因組中p33蛋白基因（p33 protein）序列保守區(qū)域，根據(jù)該區(qū)域分別設(shè)計3條引物（1條上游引物與2條下游引物）和1條TaqMan探針。上游引物用ToBSVF表示，其序列為：5′-TCCATACCAATCATAC CGCTGTT-3′，下游引物用ToBSVR表示，其中ToBSVR1序列為：5′-TAGTTCATTGCCAAAAGCCTTGA-3′，ToBSVR2序列為：5′-AGGCACCCTGACATTGAACG-3′。探針用ToBSVP表示，序列為5′（FAM）-ATGCCACTAGGGTACGCGCAGTCT CA-3′（TAMARA）。PCR產(chǎn)物長度ToBSVF/ToBSVR1為78 bp，ToBSVF/ToBSVFR2為99 bp。3條引物及探針可以組成2套不同的反應(yīng)組合，套1為ToBSVF/ToBSVR1/ToBSVP，套2為ToBSVF/ToBSVR2/ToBSVP。

1.3 總RNA提取及質(zhì)量控制

分別從感染上述病毒的葉片及健康葡萄葉片（CK1）中用納米磁珠法植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，為了獲得其濃度與純度值，測定其OD值（核酸蛋白分析儀BioPhotom-eter），并以此控制核酸質(zhì)量。

1.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

用反轉(zhuǎn)錄試劑盒DRR037A分別將“1.3”中提取的6個植物總RNA及DEPC水對照（CK2）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，以合成cDNA。反應(yīng)體系參照參考文獻(xiàn)[4-6]。

1.5 實時熒光PCR試驗

1.5.1 特異性試驗。進(jìn)行引物探針特異實時熒光PCR試驗，模板分別是“1.4”中合成的7個cDNA。反應(yīng)體系：在25 μL體系中分別加入PCR buffer（2×）12.5 μL，上游引物ToBSVF（15 μmol/L）1 μL，下游引物ToBSV R1（或ToBSVR2）（15 μmol/L）1 μL，探針（ToBSVP）（10 μmol/L）1 μL，ROX 0.5 μL，cDNA 2.0 μL，補充DEPC水至25 μL，每個模板設(shè)置至少2個重復(fù)；循環(huán)條件：50 ℃、2 min；95 ℃、2 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，45 cycles；在ABI PARISM 7000儀器的96孔板中進(jìn)行反應(yīng)[7-8]。

1.5.2 靈敏度試驗。用滅菌水后的DEPC處理水將從感染番茄叢矮病毒（ToBSV）的植物葉片中提取的總RNA分別稀釋為10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1及DEPC水11個梯度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行實時熒光PCR靈敏度試驗。實時熒光PCR與反轉(zhuǎn)錄操作同前所述。

1.5.3 2套引物探針的擴增效率對比試驗。為比較這2套引物探針的擴增效率，用同一個ToBSV病毒cDNA為模板，分別用套1組合（ToBSVF/ToBSVR1/ToBSVP）和套2組合（ToBSVF/ToBSVR2/ToBSVP）進(jìn)行實時熒光PCR試驗。實時熒光PCR操作同前。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性試驗PCR擴增結(jié)果

套1（ToBSVF/ToBSVR1/ToBSVP）PCR擴增結(jié)果見圖1、套2（ToBSVF/ToBSVR2/ToBSVP）PCR擴增結(jié)果見圖2。從圖1、2可以看出，除了在以ToBSV的cDNA為模板的反應(yīng)體系中出現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)的擴增曲線外，其他6種cDNA模板均未出現(xiàn)擴增信號，與預(yù)計的結(jié)果相符合，2套引物探針均具有良好的特異性。

2.2 靈敏度試驗PCR擴增結(jié)果

用DEPC處理水稀釋為10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、DEPC水11個梯度，稀釋從帶ToBSV的葉片中提取植物總RNA。反轉(zhuǎn)錄分別合成cDNA后，進(jìn)行實時熒光PCR擴增。套1和套2結(jié)果見圖3、4?？梢钥闯觯?dāng)RNA稀釋至10-7（即5 fg/μL）時，檢測不到信號，因此該方法檢測的靈敏度可達(dá)10-6，即50 fg/μL植物總RNA。

2.3 套1、套2引物探針的擴增效率對比試驗結(jié)果

2套引物探針：套1組合（ToBSVF/ToBSVR1/ToBSVP）和套2組合（ToBSVF/ToBSVR2/ToBSVP）的擴增效率對比試驗結(jié)果見圖5?？梢钥闯?，2套引物探針的擴增效率幾乎完全一樣。

3 結(jié)論與討論

該研究根據(jù)番茄叢矮病毒（ToBSV）全基因組中p33蛋白基因，設(shè)計引物和TaqMan探針，建立了半巢式實時PCR檢測ToBSV的新方法。該研究巧妙地融合了巢式PCR和TaqMan探針技術(shù)，第二步半巢式-RT-Realtime PCR既進(jìn)一步放大了第一步檢測信號，也是對第一步PCR產(chǎn)物的確認(rèn)，檢測靈敏度可以達(dá)到50 fg/μL植物總RNA。與單一的巢式PCR或Realtime PCR等方法相比其檢測的準(zhǔn)確性、靈敏度更高，同時也解決了由于不同方法而導(dǎo)致2次結(jié)果差異大、對結(jié)果難以判定的問題，能有效減少國際貿(mào)易中可能出現(xiàn)的貿(mào)易爭端[9-10]。

4 參考文獻(xiàn)

[1] RUSSO M，BURGYAN J，MARTELLI G P.Molecular biology of tombusv-iridae[J].Adv Virus Res，1994，44：381-428.

[2] 燕飛，宋雪梅，成卓敏.番茄叢矮病毒p19蛋白抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用機制[J].病毒學(xué)報，2005，21（5）：403-405.

[3] 洪健，周雪平.植物病毒的電鏡診斷[J].電子顯微學(xué)報，1999，18（3）：39-46.

[4] 朱建裕，朱水芳，廖曉蘭，等.實時熒光RT-PCR一步法檢測番茄環(huán)斑病毒[J].植物病理學(xué)報，2003（4）： 338-341.

[5] 趙文軍，安德榮.番茄環(huán)斑病毒HC-RT-PCR-ELISA檢測[J].微生物學(xué)報，2003（2）： 174-179.

[6] 趙巍巍，楊家強，周小毛，等.番茄斑萎病毒4種檢測方法比較[J].植物保護(hù)，2015（2）： 108-113.

[7] 趙文軍，陳紅運，朱水芳，等.雜交誘捕實時熒光PCR檢測番茄環(huán)斑病毒[J].植物病理學(xué)報，2007（6）： 666-669.

[8] 鄭元仙，劉雅婷.番茄斑萎病毒屬病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009（4）： 607-613.

[9] 曹慜，李志英，牟紅珍，等.番茄叢矮病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究，2013（3）：251.

[10] 王盛，王楊，李志英，等.TBSV病毒瞬時表達(dá)載體構(gòu)建及其表達(dá)[J].寧夏大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011（2）：159-163.endprint