朱德銳 韓 睿 沈國平 龍啟福 李丹丹 劉 建 劉德立

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青海湖鹽單胞菌Ectoine合成基因簇的重組共表達(dá)

朱德銳1, 2韓 睿3沈國平2龍啟福2李丹丹1劉 建1劉德立1

(1. 華中師范大學(xué)生命科學(xué)院湖北省遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430079; 2. 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心, 西寧 810016; 3. 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院, 西寧 810016)

鹽單胞菌屬()通過胞內(nèi)積聚有機(jī)相容溶質(zhì)(Compatible solutes)來抵抗胞外的高鹽滲透壓。為了探究相容溶質(zhì)Ectoine合成代謝相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)特征和異源共表達(dá)的可能性, 以青海湖鹽單胞菌sp. QHL1為材料, 通過高效液相色譜(HPLC)分析不同鹽梯度下QHL1胞內(nèi)Ectoine的積聚量, 并借助于染色體步移技術(shù)(Genome walking)捕獲QHL1菌株的Ectoine生物合成基因簇, 利用分子克隆技術(shù)分析基因簇的異源重組表達(dá)(BL21)。研究結(jié)果表明: 胞內(nèi)Ectoine的積聚量隨著培養(yǎng)基中Na+濃度的增加而增加, 最大積聚量為167.1 mg/g細(xì)胞干重(1.0 mol/L Na+), 但菌體生長卻受到高濃度Na+的強(qiáng)烈抑制作用。QHL1的操縱子全長序列為3580 bp, 結(jié)構(gòu)基因(579 bp)、(1269 bp)與(390 bp)串聯(lián)排列。基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析, 兩個(gè)啟動(dòng)子(δ70與δ38因子控制)和若干未知功能的保守模序(Motifs)存在于QHL1的操縱子上游。構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28-, 并在BL21中異源表達(dá)基因簇(2438 bp)。SDS-PAGE結(jié)果顯示EctA、EctB和EctC分別為27.2、52.5 和 20.8 kD, 與預(yù)測(cè)結(jié)果一致, 表明、和基因能在BL21中實(shí)現(xiàn)異源共表達(dá), 為構(gòu)建Ectoine合成代謝基因整合的系統(tǒng)代謝工程, 并實(shí)現(xiàn)低鹽發(fā)酵控制和過量化生產(chǎn)提供了重要的理論基礎(chǔ)。

鹽單胞菌屬; Ectoine;基因簇; 結(jié)構(gòu)基因; 共表達(dá)

鹽單胞菌屬()是中度嗜鹽菌的重要代表菌群, 革蘭陰性、需氧、桿狀, 多分布于鹽湖、鹽場(chǎng)、海洋或海洋極端環(huán)境之中。通常, 鹽單胞菌屬采用吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和生物合成相容溶質(zhì)的策略(Compatible solute strategy)來平衡高鹽滲透壓[1]。相容溶質(zhì)Ectoine是一類具有親水性和兩性離子特征的有機(jī)小分子, 可視為氨基酸的環(huán)化衍生物或部分氫化的嘧啶衍生物, 廣泛存在于嗜鹽或耐鹽菌胞內(nèi)。細(xì)胞中大量積聚, 可抵抗高滲透壓的沖擊, 亦可作為生物大分子和整個(gè)細(xì)胞的穩(wěn)定劑以及壓力保護(hù)劑, 有助于細(xì)胞抵抗冷凍、高溫高壓、高鹽干旱、酸堿輻射等各種逆境因素的影響[1, 2]。

經(jīng)過二十多年的研究, Ectoine合成途徑的研究在基因水平、酶水平和調(diào)控水平上已較為深入。作為Ectoine生物合成研究的模式種群, 最早報(bào)道了延長鹽單胞菌株DSM 2581與DSM 3043的合成代謝途徑[1]。截止到目前, Ectoine合成基因簇已在海球菌屬()、芽胞桿菌屬()、喜鹽芽胞桿菌屬()、假單胞菌屬()、涅斯捷連科氏菌屬()、鏈霉菌屬()、普勞塞氏菌屬()枝芽胞菌屬()、甲基盒菌屬()、色鹽桿菌屬()、甲基微菌屬()等[3—13]屬種中被成功克隆。在上述Ectoine的合成代謝途徑中, 以L-lysine生物合成途徑中的天冬氨酸半醛(L-aspartate-β-semialdehyde)為前體, 依賴于進(jìn)化高度保守的連鎖或-基因簇操縱子, 結(jié)構(gòu)基因、和分別編碼L-二氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(EctB)、L-二氨基丁酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(EctA)和四氫嘧啶合酶(EctC)聯(lián)合作用合成Ectoine[3—13]。此外, 基因編碼四氫嘧啶羥化酶(EctD), 可將Ectoine轉(zhuǎn)化為Hydroxyectoine[11,13]。

在生物醫(yī)學(xué)行業(yè)中, Ectoine可提高皮膚的再生能力、延緩其老化和抑制黑色素的生成, 可作為安全的化妝品保濕劑與增白劑[14]。隨著Ectoine在生物醫(yī)藥行業(yè)的廣泛應(yīng)用和巨大的商業(yè)需求, 導(dǎo)致各個(gè)研究機(jī)構(gòu)努力改善和提高細(xì)菌的Ectoine生產(chǎn)能力。盡管許多細(xì)菌能合成Ectoine, 但在合成能力、合成途徑的進(jìn)化和組織方式上, 存在著較大的差異。為此, 本研究以青海湖鹽單胞菌株sp. QHL1為材料, 分析不同鹽梯度下QHL1胞內(nèi)的Ectoine積聚量, 并探究Ectoine合成代謝相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)特征和實(shí)現(xiàn)了基因簇的異源共表達(dá), 為后期構(gòu)建系統(tǒng)代謝工程菌和工業(yè)應(yīng)用奠定了重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與培養(yǎng)基

野生嗜鹽菌株sp. QHL1分離來源于青海湖。菌株DH5a與BL21 (DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存, 克隆載體pMD18-T購于TaKaRa公司, 表達(dá)載體選取質(zhì)粒pET-28a(+)。OSM培養(yǎng)基(g/L)[7]: NaCl可調(diào), MgSO49.7 g, 檸檬酸鈉 3.0 g, KCl 2.0 g, CaCl20.2 g, 細(xì)菌蛋白胨10.0 g, 酵母抽提物2.0 g,調(diào)節(jié)pH為7.5。細(xì)菌LB液體培養(yǎng)基(g/L): 胰蛋白胨10.0 g, 酵母提取物5.0 g, NaCl 10.0 g, 用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0。固體培養(yǎng)基加瓊脂15.0 g, 1×105Pa滅菌15min。

1.2 主要試劑與儀器

Ectoine 標(biāo)準(zhǔn)品, HPLC級(jí)≥95%購自德國Fluka Analytical公司; 色譜級(jí)甲醇與乙腈購自天津康科德公司; 針筒式膜過濾器, 水系(0.45 μm), 購自上海德里安公司; 細(xì)菌DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒分別來自上海賽百盛公司、愛思進(jìn)生物公司和北京博大泰恒公司; 引物由上海捷瑞生物公司合成;DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶以及 Genome walking Kit (D316)均購自TaKaRa公司; 氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)與IPTG購自北京鼎國昌盛公司; HPLC儀(Aligent Technologies 1200 Series, USA); Eclipse XDB-C18色譜柱(5 μm, 4.6 mm×150 mm)。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI上公開的sp. NJ223 (Accession No. DQ886907)、sp. TNB I20 (AB119507)和sp. BYS-1(DQ017757)的基因序列, 設(shè)計(jì)合成了基因保守區(qū)段的簡(jiǎn)并引物(CSF與CSR), 見表1。根據(jù)已知的QHL1基因保守區(qū)段測(cè)序結(jié)果, 設(shè)計(jì)染色體步移擴(kuò)增上游和下游序列的引物(SPF1/2/3與SPR1/2/3), 用于巢式PCR擴(kuò)增基因保守區(qū)的側(cè)翼序列。根據(jù)測(cè)序獲得的QHL1 Ectoine合成基因簇, 設(shè)計(jì)基因簇PCR擴(kuò)增的上、下游引物(R與F)。引物設(shè)計(jì)采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì), 由上海捷瑞生物有限公司合成。

表1 本實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列

注: 下劃線為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn); 簡(jiǎn)并堿基突出顯示, 如Y(C/T), K (G/T), M (A/C), R (A/G)

Note: The base sequences underlined are the restriction sites. The highlighted base corresponds to degenerate bases as follows: Y (C/T), K (G/T), M (A/C), R (A/G)

1.4 鹽梯度誘導(dǎo)培養(yǎng)

菌株活化: 將QHL1菌株接種于4 mL OSM低鹽培養(yǎng)基, 120 r/min, 37℃恒溫振蕩培養(yǎng)12h活化, 至600值達(dá)1.20左右, 批量接種備用。NaCl誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn): 設(shè)置不同NaCl濃度梯度(0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mol/L)的OSM培養(yǎng)液(pH7.5), 150 mL培養(yǎng)體系, 1%接種量接種, 150 r/min、37℃恒溫振蕩培養(yǎng)12h后取出。測(cè)定600值。50 mL發(fā)酵液測(cè)其干重, 50 mL發(fā)酵液抽提Ectoine。細(xì)胞干重(Cellular dry weight)的測(cè)定: 取發(fā)酵液, 4℃、12000 r/min 離心 15min, 菌體用含有等滲緩沖溶液(NaCl濃度與培養(yǎng)基濃度相同)洗滌, 離心后沉淀 90℃烘干至恒重, 稱量。

1.5 HPLC檢測(cè)Ectoine

細(xì)菌胞內(nèi)Ectoine的抽提采用乙醇抽提法[15]。Ectoine標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制: 配制含有2.5 mg/mL的Ectoine標(biāo)準(zhǔn)品母液, 倍比稀釋梯度濃度, 備用檢測(cè)。采用高效液相色譜檢測(cè), 采用外標(biāo)法計(jì)算譜圖的峰面積, 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。Ectoine檢測(cè)波長是(200—215) nm, 流動(dòng)相采用乙腈/超純水(/, 80/20), Eclipse XDB- C18柱, 150 mm×4.6 mm, 柱溫20℃, 壓強(qiáng)400 bar, 進(jìn)樣量10 μL, 流速1.0 mL/min, 運(yùn)行時(shí)間8min[16]。

1.6 基因保守區(qū)的PCR擴(kuò)增

總DNA提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。以QHL1的基因組DNA為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(50mL): 模板DNA(約250 ng) 1mL; 引物-CSR (10 nmol/L) 1mL; 引物-CSF (10 nmol/L) 1mL; 10×PCR緩沖液 5mL; Mg2+(25 mmol/L): 7mL; dNTP Mixture (各2.5 mmol/L) 1mL;聚合酶(1.25 U/mL) 1mL; 去離子H2O 33mL。PCR擴(kuò)增條件: 95℃預(yù)變性5min; 95℃變性40s, 58℃退火40s, 72℃延伸60s, 30個(gè)循環(huán), 最后72℃延伸10min。以瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物, 克隆至pMD18-T, 轉(zhuǎn)化DH5a, 酶切鑒定陽性克隆, 并由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。

1.7 擴(kuò)增基因的側(cè)翼序列與基因簇結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)測(cè)序得到的基因序列, 分別設(shè)計(jì)了擴(kuò)增基因上游和下游序列的特異性引物各3條(SPF1/2/3與SPR1/2/3 Primer, 見表1), 用于染色體步移, 具體原理及操作步驟見試劑盒TaKaRa Genome walking Kit (D316)。反應(yīng)體系: 基因組DNA 1 μL, dNTP Mixture (各2.5 mmol/L ) 8 μL, 10×LA PCR Buffer (Mg2+plus) 5 μL, LA酶 (5 U/μL) 0.5 μL, SP引物1 μL, AP引物1 μL, 加滅菌去離子水至50 μL。取第1輪、第2輪、第3輪 PCR反應(yīng)液各5mL進(jìn)行1% (/)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒純化第3輪PCR特異性產(chǎn)物, 連接pMD18-T后, 轉(zhuǎn)化至DH5a菌株, 酶切鑒定陽性克隆, 并進(jìn)行DNA測(cè)序。通過DNAman軟件對(duì)克隆得到的基因簇序列與GenBank中選取的鄰近序列進(jìn)行核酸和氨基酸序列同源性分析, 并利用DNAstar軟件進(jìn)行ORF (Open reading frame)分析, 在線軟件(http: //www.fruitfly.org/seq_tools/promoter. html)預(yù)測(cè)分析啟動(dòng)子。

1.8 基因簇的克隆表達(dá)分析

以QHL1的基因組DNA為模板, PCR擴(kuò)增基因簇。PCR產(chǎn)物純化后克隆至pMD18-T, 通過TA互補(bǔ)連接后轉(zhuǎn)化DH5a, 酶切鑒定陽性克隆。H I和I雙酶切pMD18T-, 并亞克隆到表達(dá)載體pET-28a, 構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28-, 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)并篩選陽性克隆子, 測(cè)序分析?；虻恼T導(dǎo)表達(dá)與SDS-PAGE具體方法參考《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行[17]。將鑒定正確的陽性重組菌接種于含Kan (50mg/mL)的LB培養(yǎng)基中, 37℃、150 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(600約為0.6), 加入1 mmol/L IPTG, 37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24h, 間隔2h取樣。在相同條件下, 以不誘導(dǎo)的含表達(dá)載體的宿主菌作為對(duì)照。誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌液8000 r/min、10min離心收集沉淀, 重懸于1×SDS凝膠加樣緩沖液中, 煮沸10min, 8000 r/min離心2min, 取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析[18]。

1.9 重組工程菌的耐鹽測(cè)試

通過OSM培養(yǎng)基, 培養(yǎng)重組工程菌BL21 (pET-28-), 以未重組的菌株BL21為參照, 檢測(cè)其耐鹽能力。鹽梯度設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mol/L NaCl, 按1%接種量接種, 150 r/min、37℃恒溫振蕩培養(yǎng)12h, 測(cè)定600值。

2 結(jié)果

2.1 鹽單胞菌QHL1的Ectoine生物合成特性

嗜鹽菌sp. QHL1的生長鹽度范圍為(0.04—2.74) mol/L NaCl, 最適生長鹽度為0.86 mol/L NaCl, 隸屬中度嗜鹽菌。通過乙醇法抽提菌株QHL1的胞內(nèi)Ectoine, 并進(jìn)行HPLC定量分析。Ectoine屬于親水性、兼性離子的氨基酸環(huán)化衍生物, 因此HPLC分析時(shí)極易分離, 出峰時(shí)間短。通過比對(duì)分析QHL1菌株胞內(nèi)抽提物與Ectoine 的標(biāo)準(zhǔn)圖譜(39.06 μg/mL) (圖1), 結(jié)果顯示QHL1菌株的細(xì)胞抽提物(1.0 mol/L NaCl)出峰時(shí)間為1.189—1.195min, 峰形特征和出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品基本一致, 說明QHL1菌株胞內(nèi)含有相容溶質(zhì)Ectoine, 亦預(yù)示著QHL1菌株內(nèi)存在有Ectoine生物合成的基因簇。

A. HPLC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品Ectoine (39.06 μg/mL); B. HPLC檢測(cè)QHL1菌株胞內(nèi)抽提物, 采用改良的OSM培養(yǎng)基培養(yǎng)QHL1菌株, 培養(yǎng)鹽度1.0 mol/L NaCl

A. The spectra of authentic ectoine by HPLC (39.06 μg/mL); B. The map of intracellular ectoine extracted from strain QHL1 by HPLC. QHL1 was cultivated at 1.0 mol/L of NaCl in the improved Oesterhelt-Stoeckenius medium

設(shè)置不同 Na+濃度梯度的OSM培養(yǎng)基, 在生長優(yōu)化條件下培養(yǎng)QHL1, 采用HPLC測(cè)定其菌體提取物中的Ectoine含量。以Ectoine質(zhì)量濃度(mg/L)和600為縱坐標(biāo), Na+濃度(mol/L)為橫坐標(biāo), 繪制Ectoine濃度-離子濃度關(guān)系曲線圖, 如圖2所示。分析表明: 低濃度的Na+(≤1.0 mol/L)對(duì)QHL1菌株的生長沒有明顯的影響, 而當(dāng)Na+濃度高于1.0 mol/L以后, 菌體生長量明顯受到強(qiáng)烈的抑制作用; 胞內(nèi)Ectoine的積聚量嚴(yán)格受到Na+的影響作用, 極低濃度的Na+(0.25 mol/L)沒有刺激Ectoine的大量積聚, 但當(dāng)鹽度從0.25 mol/L增加至1.0 mol/L時(shí), Ectoine的積聚量維持較高的水平, 至1.0 mol/L時(shí)可高達(dá)121.14 mg/L (12h), 此時(shí)Ectoine的細(xì)胞干重比亦最大(167.1 mg/g CDW), 此后隨Na+濃度的增加而減少, 菌體生長明顯受到抑制, 由此表明Ectoine積聚量主要依賴Na+存在, 但又受到高濃度Na+對(duì)其生長的強(qiáng)烈抑制作用。

細(xì)胞干重: Cellular dry weight (CDW, mg/g)

2.2 鹽單胞菌QHL1基因簇的克隆

Ectoine的合成途徑依賴于進(jìn)化高度保守的或或-基因簇, 在染色體上連鎖構(gòu)成操縱子(圖3A), 結(jié)構(gòu)基因中以基因最為保守, 其中鹽單胞菌屬的相似度>84%。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取QHL1的總DNA。以基因組DNA為模板, 采用簡(jiǎn)并引物(表1)進(jìn)行基因保守序列的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化回收后, 連接至克隆載體pMD18-T, 轉(zhuǎn)化DH5a, 提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定分析, 陽性克隆子測(cè)序, 獲得基因保守序列977 bp。利用上游引物SPR1/SPR2/SPR3與下游引物SPF1/SPF2/ SPF3 (表1), 通過染色體步移擴(kuò)增基因保守區(qū)段的上游和下游序列(圖3B)。經(jīng)三輪巢式PCR擴(kuò)增基因上游序列, 獲得上游序列約1500 bp, 下游序列約1200 bp。將上、下游巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化, 克隆至pMD18-T載體, 并轉(zhuǎn)化至DH5a菌株, 酶切鑒定分析并測(cè)序。

經(jīng)過染色體步移擴(kuò)增基因上下游序列, 測(cè)序比對(duì)拼接3580 bp。DNAStar軟件分析表明: 結(jié)構(gòu)基因與串聯(lián)排列;與間隔109 bp,與間隔91 bp;上游調(diào)控序列635 bp, 應(yīng)全部含蓋啟動(dòng)系列元件和操縱子元件。QHL1的基因長度為579 bp, 編碼192個(gè)氨基酸的肽鏈, 預(yù)測(cè)pI為4.78, 與的基因相似性為74%—80%, 與EctA蛋白相似性為58%—98%, GenBank Accession No. JX312790; 基因長度為1269 bp, 編碼422個(gè)氨基酸的肽鏈, 預(yù)測(cè)pI為5.98, 與的基因相似性為78%—91%, 與EctB蛋白相似性為85%—98%, GeneBank Accession No. JX312791; 基因長度為390 bp, 編碼129個(gè)氨基酸的肽鏈, 預(yù)測(cè)pI為5.30, 與的基因相似性為72%— 96%, 與EctC蛋白相似性為75%—96%, GenBank Accession No. JX312792。

A.DSM 2581T菌株基因簇的結(jié)構(gòu)與組成; B. 巢式PCR擴(kuò)增保守序列策略; 中心實(shí)線區(qū)域?yàn)?77 bp的基因保守序列; 引物AP1/2/3/4來自Genome Walking Kit D316

A. The gene composition and organization of the-cluster inDSM 2581T; B. Strategy of amplification of the flanking sequence by nested PCR. Solid lines in the center represent 977 bp known conservative sequence of. Primers AP1/2/3/4 were provided by the Genome Walking Kit D316

2.3 啟動(dòng)子預(yù)測(cè)比對(duì)和操縱子的結(jié)構(gòu)分析

通過采用在線軟件伯克利大學(xué)Neural Network Promoter Prediction (http://fruitfly.org.9005/seq-tools/ promoter.html)預(yù)測(cè)分析基因上游序列中的啟動(dòng)子。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果和結(jié)構(gòu)基因位置, 初步認(rèn)定sp. QHL1基因上游序列28 bp處應(yīng)為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1), 典型的保守特征有: 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS, 以A為起始點(diǎn))、–10區(qū)序列(TATAAT)、–35區(qū)序列(TTGAAT)以及–10區(qū)和–35區(qū)序列的間隔距離(17 bp), 此與的δ70啟動(dòng)子序列核心區(qū)域保守模式一致。與基因上游的間隔序列, 未發(fā)現(xiàn)具有明顯特征的啟動(dòng)子序列, 初步認(rèn)定串聯(lián)排列的基因簇是一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元。

利用MEGA 4.0比對(duì)分析sp. NJ223 (GeneBank Accession No. DQ886907)、sp. BYS-1(DQ017757)、延長鹽單胞菌.DSM 2581 (FN869568)和DSM 3043(AJ011103)的基因的上游序列, 確定其可能的啟動(dòng)子序列及位置(圖2)。比對(duì)結(jié)果顯示:的代表性菌株中可能普遍存在兩個(gè)啟動(dòng)子, 即δ70因子控制啟動(dòng)子與δ38因子控制啟動(dòng)子, 與已有報(bào)道一致[19—20]。通常, 典型的δ70因子控制啟動(dòng)子具有–10區(qū)與–35區(qū)間隔序列為17 bp的特征。在QHL1菌株中, δ70因子控制啟動(dòng)子的–10區(qū)與–35區(qū)(TTGAAT [17nt] TATAAT)結(jié)構(gòu)類似于的δ70因子控制啟動(dòng)子。δ38因子控制啟動(dòng)子(滲透壓調(diào)控)位于基因上游約91 bp處, –10區(qū)與–35區(qū)分別為保守的CATAAC序列與GCCGC序列(G-elements)。此外, 若干保守的、未知功能的Motifs存在于基因的上游, 諸如: 在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(+1)與核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)之間存在7 nt的AATTCGC序列; 緊鄰Pribnow box (–10)處存在5 nt的GCTGT序列; 在–35區(qū)的兩側(cè)翼分別存在5 nt的CATAA序列和6 nt的AATAAT序列。

A. 基于MEGA 4.0軟件比對(duì)分析ectA基因上游啟動(dòng)子序列. 1為本研究中的QHL1上游序列; 2為sp. NJ223; 3為sp. BYS-1; 4為DSM2581; 5為DSM3043. RBS代表核糖體結(jié)合位點(diǎn); 箭頭為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1); B. QHL1菌株基因簇啟動(dòng)子與終止子的結(jié)構(gòu)特征與組成

A. The upstreampromoter region was shown based on the sequence alignment by MEGA4.0 software. 1. QHL1 in this study; 2.sp. NJ223; 3.sp. BYS-1; 4.DSM2581; 5.DSM3043. RBS: ribosome-binding site, and arrows indicated the transcription initiation sites (+1); B. Putative structural features of the promoter and terminator was predicted ingenes cluster of QHL1

2.4 基因簇的克隆表達(dá)分析

以QHL1的基因組DNA為模板, 利用引物(-F/-R)進(jìn)行基因簇的PCR擴(kuò)增, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見特異性的目的條帶, 其分子量大小與預(yù)期結(jié)果一致, 表明成功克隆基因簇。PCR產(chǎn)物純化回收, 克隆至pMD18-T, 轉(zhuǎn)化DH5a, 酶切鑒定陽性克隆并測(cè)序, 目的基因簇為2438 bp。將基因簇的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆至表達(dá)載體pET-28a, 構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-。經(jīng)H I和I酶切分析, 目的條帶約2500 bp, 與預(yù)期的結(jié)果一致。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證, 結(jié)果表明其目的基因的插入位置、大小和讀碼框均正確, 未發(fā)生錯(cuò)配及移碼。將重組表達(dá)載體pET-28-轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中, 成功構(gòu)建重組菌株。

在BL21中, 采用IPTG(1 mmol/L, 37℃)誘導(dǎo), 異源表達(dá)基因簇(圖5)。SDS-PAGE結(jié)果顯示EctA、EctB和EctC分別為27.2、52.5和20.8 kD, 與預(yù)測(cè)結(jié)果一致, 表明、和基因能在BL21中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá), 且基因簇能同時(shí)翻譯表達(dá), 但的表達(dá)量略小于和基因的表達(dá)量, 可能因?yàn)槭艿剿拗鰾L21的蛋白水解酶降解, 亦或受到和基因轉(zhuǎn)錄后的抑制作用[19]。

M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker; N為未誘導(dǎo)的重組菌株; 泳道2、4、6、8、12與24分別代表不同的誘導(dǎo)時(shí)間(h);重組菌株BL21/ pET-28a-在T7強(qiáng)啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá), 表達(dá)產(chǎn)物EctA, EctB與EctC均為單體酶蛋白

M. protein marker. N: recombination strain not induced. Number 2, 4, 6, 8, 12 and 24. different induction time (h). Recombinant strainBL21(pET-28a-) was inducted and expressed with a strong promoter T7, and expression products EctA, EctB and EctC were monomer enzyme proteins

2.5 重組菌株BL21/pET-28a-的耐鹽適應(yīng)性

設(shè)置不同鹽濃度梯度(0—1.2 mol/L NaCl)的OSM培養(yǎng)基, 檢測(cè)基因簇是否影響B(tài)L21和重組菌株的生長量, 結(jié)果顯示:BL21能生長的鹽度范圍為(0—0.8) mol/L NaCl; 而BL21 (pET-28a-)能耐受的鹽度為1.0 mol/L NaCl, 且生長量要略大于其對(duì)照菌株(圖6)。由此, 表明重組菌株在鹽度耐受上, 要優(yōu)于未重組菌株, 能抵抗一定的滲透壓沖擊。

3 討論

本研究采用HPLC定量分析sp. QHL1菌株胞內(nèi)Ectoine的積聚情況, 結(jié)果表明QHL1菌株胞內(nèi)可積聚單一組分的Ectione。當(dāng)培養(yǎng)基的Na+濃度為(0.25—1.0) mol/L時(shí), Ectoine的積聚量隨鹽度的升高而逐漸增大; 當(dāng)Na+濃度為1.0 mol/L時(shí), Ectoine的細(xì)胞干重比最大(167.1 mg/g CDW, 12h); 此后隨Na+濃度的增加而減少, 菌體生長明顯受到抑制, 由此表明: 在環(huán)境滲透壓脅迫下, 培養(yǎng)基中的Na+濃度對(duì)Ectoine的合成具有重要的影響。在一定的NaCl濃度范圍內(nèi), Ectoine的合成量隨培養(yǎng)基中Na+濃度的升高而增加, 但是高濃度的Na+亦能降低細(xì)胞生長速度和生物量[1]。

生長量的檢測(cè)通過測(cè)定600值, 培養(yǎng)時(shí)間12h (37℃); 誤差分析表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)方程(=3),＜0.05

The growth rate was checked by measuring the600after 12h incubation at 37℃. Error bars were expressed as means±standard deviation (=3). Statistical significance was set at<0.05

利用染色體步移技術(shù), 本研究克隆獲得QHL1菌株的Etoine生物合成基因簇。目前, NCBI數(shù)據(jù)庫中有關(guān)鹽單胞菌屬不同菌株的基因簇全序列的提交數(shù)據(jù)相對(duì)較少。本研究共收集獲得7株鹽單胞菌屬菌株的基因簇全序列, 如sp. NJ223 (DQ886907)、sp. BYS-1(DQ017757)、DSM 3043(AJ011103)、DSM 2581(FN869568)、(D88359)、(AF031489)以及原隸屬鹽單胞菌屬的DSM 3043(NC007963), 且以延長鹽單胞菌居多?；诙嘈蛄蟹治? 部分菌株的基因簇全序列數(shù)據(jù)完全相同。截止目前, 在NCBI數(shù)據(jù)庫中, 鹽單胞菌屬實(shí)際上僅有5株菌株有效的基因簇全序列數(shù)據(jù)(包括本研究中的QHL1)。

基因組中完整的基因簇序列廣泛存在于嗜鹽細(xì)菌與耐鹽細(xì)菌之中。在30株革蘭陰性細(xì)菌中, 基因簇與天冬氨酸激酶基因, 采用-串聯(lián)的操縱子模式; 而在革蘭陽性細(xì)菌中, 僅以操縱子模式存在[19]。目前, 典型操縱子模式有以下幾種[20]: (1) 在延長鹽單胞菌、需鹽色鹽桿菌s、泊庫島食烷菌、克勞氏芽胞桿菌與之中, 結(jié)構(gòu)基因、與串聯(lián)形成操縱子; (2) 在菌株耐鹽芽胞桿菌、魯杰氏菌sp. TM1040以及所有的弧菌屬()種成員之中, 由基因簇與基因形成-操縱子; (3) 在海洋泉古菌、海洋芽螺旋菌、天藍(lán)色鏈霉菌A3及β-變形綱成員之中, 則以操縱子存在; (4) 在阿拉斯加鞘氨醇單胞菌、海單胞菌sp. MWYL1與施氏假單胞菌A1501等菌株之中,基因簇與基因形成-操縱子。在本研究中,sp. QHL1的操縱子隸屬上述第一種類型, 屬于操縱子, 其內(nèi)部結(jié)構(gòu)具有δ70因子控制啟動(dòng)子與δ38因子控制啟動(dòng)子, 此與先前的報(bào)道一致[20]。

本研究成功構(gòu)建了重組菌株BL21/pET- 28a(+)-, 經(jīng)1 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)后, SDS- PAGE結(jié)果分析表明: EctA, EctB和EctC分別為27.2、52.5和20.8 kD, 與預(yù)測(cè)結(jié)果一致, 表明、、基因能在BL21中實(shí)現(xiàn)異源共表達(dá), 且重組菌株在耐鹽能力上有明顯提高。在Ectoine合成代謝相關(guān)基因的克隆表達(dá)與代謝工程菌構(gòu)建方面[21], 諸多研究已取得系列技術(shù)上的突破,為后期工業(yè)應(yīng)用提供了重要的技術(shù)思路。早期Zhao等[5]、Reshetniko等[6]、Zhang等[7]、Rajan等[10]和Bestvater等[22]分別從達(dá)坂喜鹽芽胞桿菌D-8T、嗜堿產(chǎn)甲烷菌20Z、耐鹽芽胞桿菌、正喜鹽涅斯捷連科氏菌DSM 20541和嗜鹽海球菌中克隆了+基因簇, 實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá); Seip等[13]和St?veken等[23]分別從施氏假單胞菌DSM 5190T和A1501菌株中, 克隆了基因簇并實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá), 且Ectoine/Hydroxyectoine的產(chǎn)量高于以基因簇構(gòu)建的工程菌; Eilert等[24]和Moya等[25]采用系統(tǒng)整合的方法, 分別將延長鹽單胞菌ATCC33173與需鹽色鹽桿菌的基因簇重組整合至多形漢遜酵母和DH5α菌株, 實(shí)現(xiàn)Hyd-roxyectoine的過量化生產(chǎn); Becker等[26]基于系統(tǒng)代謝工程, 成功將A1501菌株的基因簇, 系統(tǒng)整合至谷氨酸棒桿菌, 實(shí)現(xiàn)了Ectoine的過量化生產(chǎn)。本研究以青海湖鹽單胞菌株sp. QHL1為材料, 分析不同的鹽梯度下QHL1胞內(nèi)的Ectoine積聚量, 并探究Ectoine合成代謝相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)特征和實(shí)現(xiàn)了基因簇的異源共表達(dá), 為后續(xù)構(gòu)建Ectoine合成代謝相關(guān)基因系統(tǒng)代謝工程菌株、實(shí)現(xiàn)低鹽發(fā)酵控制和大規(guī)模應(yīng)用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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RECOMBINANT CO-EXPRESSION OF THE ECTOINE BIOSYNTHESIS GENE CLUSTERINFROMQINGHAI LAKE

ZHU De-Rui1, 2, HAN Rui3, SHEN Guo-Ping2, LONG Qi-Fu2, LI Dan-Dan1, LIU Jian1and LIU De-Li1

(1.Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, School of Life Science, Central China Normal University, Wuhan430079, China; 2.Research Center of Basic Medical Sciences, Qinghai University Medical College, Xining 810016, China; 3. Qinghai Academy of Agricultural Forestry Sciences, Qinghai University Medical College, Xining 810016, China)

is capable of synthesizing organic compatible solutes ectoine in response to high osmotic pressure. To reveal the possibility of heterologous co-expression of ectoine biosynthesis genes, intracellular ectoine insp. QHL1 strain was determined by HPLC under different salt gradients. The entiregene cluster for ectoine synthesis was cloned using genome walking and expressed in the heterologous recombinantBL21. The results showed that the concentration of ectoine accumulated in the cells had a positive correlation with the extracellular Na+concentration and reached a maximumvalue (167.1 mg/g cell dry weight) at 1.0 mol/L Na+, and high concentration of Na+strongly inhibited the bacteria growth. The entiregene cluster in QHL1 strain was 3580 bp, containing structural gene(579 bp),(1269 bp) and(390 bp). Based on bioinformatics prediction analysis, two putative promoters (δ70and δ38-controlled promoter) and several conserved motifs with unknown function were identified in the upstreamof-operon. The recombinant plasmid pET-28a (+)-was successfully constructed, and the results of heterologous expression indicated that these three genes could be simultaneously translated to protein EctA (27.2 kD), EctB (52.5 kD) and EctC (20.8 kD). These results contribute further improvements in ectoine high yield and hypohaline biotechnological process optimization, and also provided a framework for future genetic manipulation of systems metabolic engineering.

; Ectoine; Gene cluster; Structural gene; Co-expression

10.7541/2015.47

Q933

A

1000-3207(2015)02-0358-10

2014-04-09;

2014-06-15

國家自然科學(xué)基金(No.31060013); 青海省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.2013Z725)資助

朱德銳(1979—), 男, 湖北鶴峰人; 博士; 主要研究方向極端鹽湖環(huán)境微生物。E-mail: zhuderui2005@126.com

劉德立(1959—), 男, 湖北荊門人; 教授, 博士生導(dǎo)師; 主要研究方向環(huán)境微生物與分子生物學(xué)。Tel: +86-027-67867221; E-mail: deliliu2013@163.com