單喜雙 岳華梅 陳細(xì)華 葉 歡 楊曉鴿 李創(chuàng)舉

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達(dá)氏鱘生長(zhǎng)激素基因cDNA克隆、表達(dá)及免疫熒光定位研究

單喜雙1, 2岳華梅1陳細(xì)華1葉 歡1楊曉鴿1李創(chuàng)舉1

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430223; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306)

為研究達(dá)氏鱘()生長(zhǎng)激素(Growth Hormone, GH)基因的功能, 合成了達(dá)氏鱘垂體SMART cDNA, 克隆得到全長(zhǎng)cDNA序列。達(dá)氏鱘全長(zhǎng)cDNA序列為1008 bp, 由52 bp的5′端非編碼區(qū)(Untranslated region, UTR)、編碼214個(gè)氨基酸的645 bp開(kāi)放閱讀框(Open reading frame, ORF)和311 bp的3′UTR構(gòu)成。運(yùn)用GH氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn), 達(dá)氏鱘與兩棲類、爬行類和哺乳類的一致性要高于真骨魚(yú)類。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明, 達(dá)氏鱘mRNA主要在垂體和下丘腦中表達(dá), 且垂體中的表達(dá)量約為下丘腦的110倍; Western-blot研究結(jié)果與qRT-PCR一致, 僅在垂體和下丘腦中檢測(cè)到生長(zhǎng)激素蛋白, 且垂體中GH的表達(dá)量遠(yuǎn)高于下丘腦。免疫熒光定位結(jié)果顯示, GH主要定位于垂體中部, 下丘腦中也有少量熒光信號(hào); 蘇木精-伊紅組織切片染色研究表明, GH主要是由嗜酸性的生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞分泌。研究為深入研究脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)激素基因的進(jìn)化和人工養(yǎng)殖達(dá)氏鱘的生長(zhǎng)調(diào)控提供了基礎(chǔ)。

達(dá)氏鱘; 生長(zhǎng)激素; qRT-PCR; Western-blot; 熒光免疫組化

鱘是最古老的脊椎動(dòng)物之一, 已生存超過(guò)2億年, 具有重要的進(jìn)化地位。達(dá)氏鱘()為我國(guó)長(zhǎng)江上游特有的淡水定居型魚(yú)類, 與長(zhǎng)江中另外兩種鱘中華鱘()和白鱘()相比, 其個(gè)體較小, 性成熟年限相對(duì)較短(雌性5—7齡, 雄性3—5齡)。歷史上達(dá)氏鱘曾是長(zhǎng)江上游重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一, 20世紀(jì)70年代以來(lái), 由于水利水電工程建設(shè)、航運(yùn)、水體污染和過(guò)度捕撈等人類活動(dòng)的影響, 達(dá)氏鱘生存環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞, 物種處于極度瀕危狀況, 已于1988年被列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物[1—3]。目前對(duì)于達(dá)氏鱘的保護(hù)主要采用建立自然保護(hù)區(qū)、禁漁、增殖放流等方式[4], 取得了一定的成效, 特別是達(dá)氏鱘規(guī)模化全人工繁殖技術(shù)的突破, 對(duì)于延續(xù)達(dá)氏鱘物種有重要意義。但是, 人工養(yǎng)殖達(dá)氏鱘仍然面臨生長(zhǎng)發(fā)育較慢和初次性成熟時(shí)間較長(zhǎng)等問(wèn)題, 限制了其資源恢復(fù), 尋找合適的方式促進(jìn)達(dá)氏鱘的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)其物種保護(hù)和資源利用具有重要的意義。

魚(yú)類生長(zhǎng)激素是由腺垂體分泌的一類具有廣泛生理作用的單鏈多肽, 腺垂體分泌的生長(zhǎng)激素通過(guò)下丘腦-垂體-肝臟生長(zhǎng)調(diào)控軸, 刺激肝臟分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGF-I), 通過(guò)IGF-I受體的介導(dǎo)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能[5—9]。生長(zhǎng)激素的分泌受到下丘腦分泌的生長(zhǎng)激素釋放激素、促性腺激素釋放激素和生長(zhǎng)激素抑制激素的調(diào)控, 研究顯示生長(zhǎng)激素不僅在魚(yú)類的生長(zhǎng)調(diào)控方面起主要作用, 與魚(yú)類的生殖[10, 11 ]、免疫[12]、滲透壓[13]等生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)也息息相關(guān)。由于生長(zhǎng)激素在魚(yú)類生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中的重要作用, 引起了科研工作者和漁業(yè)生產(chǎn)者的普遍關(guān)注, 20世紀(jì)80年代中期開(kāi)始國(guó)內(nèi)外很多實(shí)驗(yàn)室對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)激素基因進(jìn)行了研究, 如中華鱘、俄羅斯鱘()、歐洲鰉()、波斯鱘()大馬哈魚(yú)()、虹鱒()、草魚(yú)()、南方鲇()、黃鱔()和泥鰍()、鯽()等[14—22]。具有快速生長(zhǎng)特征的轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因魚(yú)于1984年在我國(guó)首次誕生[23], 迄今已在世界范圍內(nèi)成功獲得了幾十種轉(zhuǎn)基因魚(yú)。此外, 利用基因工程方法對(duì)外源生長(zhǎng)激素基因進(jìn)行基因重組, 構(gòu)建原核和真核表達(dá)系統(tǒng), 獲得重組生長(zhǎng)激素通過(guò)投喂或者注射的方式促進(jìn)魚(yú)類生長(zhǎng)的研究也比較多[24]。魚(yú)類生長(zhǎng)激素的研究近幾十年來(lái)在國(guó)內(nèi)外逐漸開(kāi)展并取得顯著進(jìn)展, 在未來(lái)的很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)仍是熱點(diǎn)。

本研究克隆了達(dá)氏鱘生長(zhǎng)激素全長(zhǎng)cDNA序列, 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative real-time poly-merase chain reaction, qRT-PCR)和Western-blot方法研究了達(dá)氏鱘不同組織中生長(zhǎng)激素mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況; 隨后采用熒光免疫組織化學(xué)方法對(duì)垂體和下丘腦中生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞進(jìn)行定位, 并用HE染色的方式對(duì)其分泌細(xì)胞進(jìn)行辨別。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚(yú)取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所太湖試驗(yàn)場(chǎng)(湖北荊州), 為全人工繁殖的一齡子二代達(dá)氏鱘。分別取肝、脾、心、性腺、脂肪、腎、肌肉、腸、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦等組織, 在液氮中速凍后, 存放于–80℃?zhèn)溆?。本研究中所用GH多克隆抗體依據(jù)中華鱘GH氨基酸序列制備, 為中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所桂建芳院士贈(zèng)送。

1.2 總RNA提取、單鏈cDNA及SMART cDNA合成

總 RNA參照SV Total RNA Isolation System (Promega, 美國(guó))試劑盒說(shuō)明書提取; 利用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa, 日本)試劑盒合成第一鏈cDNA用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn), 按 Super SMART?PCR cDNA Synthesis Kit 操作手冊(cè)的方法合成達(dá)氏鱘垂體SMART cDNA。

1.3 達(dá)氏鱘基因全長(zhǎng)cDNA克隆及序列分析

參考中華鱘基因cDNA序列(GenBank登錄號(hào): EU599640.2)設(shè)計(jì)引物-F和-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng), 克隆獲得部分達(dá)氏鱘cDNA序列, 根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異引物5′-R15′- R23′-F13′-F2擴(kuò)增cDNA5′端和3′端, 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連入pMD19-T載體, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α), 挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。利用DNA StarSeqMan軟件對(duì)獲得的基因各片段進(jìn)行拼接, NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast. cgi)對(duì)所得序列進(jìn)行分析, SignalP4.1 (http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè), 在線進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/ services/ NetNGlyc/), 應(yīng)用ClustalX 對(duì)推導(dǎo)的氨基酸同其他脊椎動(dòng)物進(jìn)行比對(duì), 利用DNAMAN 6.0 軟件進(jìn)行氨基酸序列一致性分析, 利用Mega5 軟件以鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù), 自引導(dǎo)檢驗(yàn)(Bootstrap)獲得系統(tǒng)分支的置信度(重復(fù)次數(shù)為1000)。

表1 本研究所用引物序列

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)所得到達(dá)氏鱘cDNA序列, 設(shè)計(jì)定量引物RT-和RT-(表 1), 以 1 齡個(gè)體的不同組織(心、肝、脾、脂肪、性腺、肌肉、腎、腸、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦)cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng), 按SYBR?Premix ExTM(Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明書操作, 實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次, 以達(dá)氏鱘-為內(nèi)參基因。擴(kuò)增反應(yīng)在 Bio-Rad CFX96TM Real Time System 儀上進(jìn)行, 反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性10min, 95℃變性 15s, 54℃退火15s, 72℃延伸15s, 共40個(gè)循環(huán)。

1.5 Western-blot分析

取達(dá)氏鱘各種組織加入適量蛋白勻漿緩沖液(100 mmol/L β-磷酸甘油, 20 mmol/L HEPES, 20 mmol/L EGTA, 15 mmol/L MgCl2, pH7.3, 臨用前加入1 mmol/L DTT, 2 mmol/L PMSF, 2.5 μg/mL leupetin, 2.5 μg/mL aprotinin), 冰浴勻漿, 離心取上清, 加入Loading Buffer沸水浴10min, 冷卻后經(jīng)SDS-PAGE 蛋白電泳分離, 使用Mini Trans-Blot (Bio-Rad, 美國(guó))電轉(zhuǎn)儀, 將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF 膜(80 V, 0.5h)。TBS溶液(0.1 mol/L NaCl, 0.1 mol/L Tris, pH 7.5)漂洗3次, 5%脫脂奶粉封閉(2h), 1︰500稀釋中華鱘GH抗體4℃孵育過(guò)夜; TBS漂洗3次后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的1︰5000稀釋的二抗, 室溫孵育1h, TBS漂洗后使用NBT/BCIP避光顯色, 選取達(dá)氏鱘Adβ-actin為內(nèi)參蛋白, 實(shí)驗(yàn)過(guò)程與GH相同, 一抗1︰10000稀釋, 二抗1︰1000稀釋。

1.6 熒光免疫組化及組織學(xué)觀察

達(dá)氏鱘腦組織樣品用4%多聚甲醛固定, 常規(guī)脫水透明處理, 石蠟包埋, 橫向連續(xù)切片, 厚度約為4 μm, 熒光免疫組化與HE染色選用鄰近切片。選取石蠟切片脫蠟后HE 染色, 光學(xué)顯微鏡觀察拍照。熒光免疫組化石蠟切片脫蠟后, PBS洗三次, 每次5min; 抗原修復(fù)液煮沸10min, 自然冷卻至室溫, PBS洗三次, 每次5min; 3%過(guò)氧化氫37℃下處理30min, PBS洗三次, 每次5min; 5%脫脂奶粉封閉1h, 添加一抗(1︰200)處理, “濕盒”過(guò)夜; PBST洗5次, 每次10min, PBS洗兩次, 每次10min; 以2%正常羊血清稀釋FITC標(biāo)記的羊抗兔血清(1︰100), 在室溫條件下避光孵育1h; PBS洗5次, 每次10min, DAPI(1︰1000)染色30min; PBS洗5次, 每次10min, 最后用抗淬滅劑封片, 熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 達(dá)氏鱘全長(zhǎng)cDNA及推導(dǎo)的氨基酸序列

分別以3尾達(dá)氏鱘垂體SMART cDNA為模板, 擴(kuò)增出的達(dá)氏鱘cDNA全長(zhǎng)序列完全一致, 利用Blast軟件與GenBank中已知的序列進(jìn)行同源性比較, 結(jié)果證實(shí)所得序列為的cDNA。cDNA序列全長(zhǎng)1008 bp, 包含52 bp的5′UTR和311 bp的3′UTR, 其開(kāi)放閱讀框ORF為645 bp, 編碼214個(gè)氨基酸, 相對(duì)分子質(zhì)量約為24 kD。根據(jù)SignalP4.1預(yù)測(cè), 其多肽前24個(gè)氨基酸為信號(hào)肽, 成熟肽包含190個(gè)氨基酸, 在氨基酸序列中存在一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(Asn-Cys-Ser)和4個(gè)半胱氨酸Cys殘基, 形成2個(gè)二硫鍵(GenBank登錄號(hào): KJ650095)。

2.2 達(dá)氏鱘GH氨基酸序列一致性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

將推導(dǎo)的達(dá)氏鱘GH氨基酸序列與其他代表性脊椎動(dòng)物相應(yīng)序列進(jìn)行多重比對(duì), 結(jié)果表明, 達(dá)氏鱘與其他幾種鱘形目魚(yú)類的GH氨基酸序列一致性最高, 均達(dá)到95%以上。達(dá)氏鱘GH與兩棲類非洲爪蟾()、爬行類的棕樹(shù)蛇()、鳥(niǎo)類的雞()及哺乳類的人()和小鼠()相應(yīng)序列一致性均超過(guò)50%, 而與幾種真骨魚(yú)類的一致性較低, 為40%—45%。運(yùn)用Mega 5軟件構(gòu)建了基于GH氨基酸序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1), 結(jié)果表明, 以高等脊椎動(dòng)物(兩棲類、爬行類、鳥(niǎo)類和哺乳類)為外群, 可識(shí)別出2個(gè)單系類群: 7種鱘形目魚(yú)類聚為一類; 3種真骨魚(yú)類和1種軟骨魚(yú)類聚為一類。

2.3 達(dá)氏鱘mRNA的組織表達(dá)特征

選擇達(dá)氏鱘-作為內(nèi)參基因, 采用real-time qPCR方法檢測(cè)了達(dá)氏鱘mRNA在達(dá)氏鱘垂體、下丘腦、心、肝等不同組織中的表達(dá)情況, 熔解曲線顯示為單一峰值, 表明無(wú)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體。結(jié)果發(fā)現(xiàn),mRNA僅在垂體和下丘腦中表達(dá), 垂體GH表達(dá)量約為下丘腦中的110倍, 而在其他檢測(cè)的組織中無(wú)表達(dá)(圖2)。

2.4 達(dá)氏鱘GH蛋白的組織表達(dá)

采用Western-blot方法檢測(cè)了達(dá)氏鱘GH蛋白在垂體、下丘腦、心、肝等不同組織中的表達(dá)情況。與mRNA的組織分布一致, GH蛋白僅在垂體和下丘腦中表達(dá), 且垂體中GH蛋白的表達(dá)量明顯高于下丘腦(圖3)。

A. 達(dá)氏鱘腦組切片位置示意圖; B. 垂體及下丘腦熒光免疫組化圖片, B1和B2分別為下丘和垂體部分區(qū)域放大, GH抗體利用FITC綠色熒光標(biāo)記, 藍(lán)色熒光DAPI標(biāo)記細(xì)胞核; C. 下丘腦及垂體組織HE染色, C1為局部區(qū)域放大圖、C2和C3分別為下丘腦和垂體部分區(qū)域放大, 圖中強(qiáng)嗜酸性細(xì)胞(胞質(zhì)紅色)為生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞; Pi. 垂體; Hy. 下丘腦; 圖中標(biāo)尺單位為μm

Schematic drawing of a sagittal section of the brain ofshowing the location of the transverse section (A); Immunofluorescence signals stained with anti-Growth Hormone (GH) antiserum, showing GH immunoreactive cells in the pituitary and hypothalamus (B). The pituitary and hypothalamus stained with Harris’s hematoxylin and eosin (C); Pi. pituitary; Hy. Hypothalamus; Bar μm

2.5 達(dá)氏鱘GH分泌細(xì)胞的定位

將達(dá)氏鱘腦組織整體固定后, 橫向連續(xù)切片, 切片位置如示意圖4A所示, 熒光免疫組化及HE染色試驗(yàn)選用臨近切片。熒光免疫組化顯示, 達(dá)氏鱘下丘腦(圖4B、4B1)和垂體(圖4B、4B2)中存在對(duì)GH抗體強(qiáng)烈的特異性免疫反應(yīng), 信號(hào)明顯, 下丘腦及垂體中具有特異性信號(hào)的細(xì)胞形態(tài)一致。與垂體中(圖4B2)信號(hào)細(xì)胞排列比較密集相比, 下丘腦中(圖4B1)信號(hào)細(xì)胞分布比較分散且數(shù)量較少。HE染色輔助定位生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞(圖4C、4C1、4C2、4C3), 生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞含有致密的嗜酸性細(xì)胞質(zhì), 易被伊紅著色, 在垂體(圖4C3)和下丘腦內(nèi)(圖4C2)分布著強(qiáng)嗜酸性細(xì)胞, 區(qū)域位置與熒光免疫組化中的特異性信號(hào)細(xì)胞一致, 可以確定為生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞。

3 討論

本研究從達(dá)氏鱘垂體中擴(kuò)增獲得達(dá)氏鱘的全長(zhǎng)cDNA序列, 該序列編碼214個(gè)氨基酸, 與其他已報(bào)道的幾種鱘魚(yú)GH序列一致。對(duì)不同脊椎動(dòng)物GH蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn), 從低等的魚(yú)類至高等的哺乳類, Cys殘基的數(shù)目和位置都是一致的, 可形成2個(gè)二硫鍵, 這對(duì)GH蛋白的正確折疊、特定空間結(jié)構(gòu)維持及生物學(xué)活性的實(shí)現(xiàn)起重要作用。在達(dá)氏鱘GH氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)一個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn), 值得關(guān)注的是在所有參與序列分析的鱘形目魚(yú)類、軟骨魚(yú)類、真骨魚(yú)類、甚至還有兩棲類的非洲爪蟾及鳥(niǎo)類的雞中相同區(qū)域存在完全一樣的潛在糖基化位點(diǎn)“NCT”, 符合經(jīng)典的三聯(lián)子N-糖基化序列Asn-X-Thr/Ser; 而在哺乳類的人、鼠及爬行類的棕樹(shù)蛇中, 沒(méi)有符合經(jīng)典N-糖基化的序列。三種真骨魚(yú)類除“NCT”外, 還存在“NDS”這一潛在的糖基化位點(diǎn), 糖基化位點(diǎn)在蛋白分泌到細(xì)胞表面的過(guò)程中起到信號(hào)的作用, 是生物體內(nèi)最為重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式之一[25, 26], 不同物種間的差別可能是由于進(jìn)化或功能分化造成的。

生長(zhǎng)激素基因是一個(gè)相對(duì)保守的基因, 其序列結(jié)構(gòu)具有高度進(jìn)化分類意義, 將達(dá)氏鱘GH的氨基酸序列與其他幾種脊椎動(dòng)物比對(duì)分析顯示, 不同類群的一致性差異較大, 其中達(dá)氏鱘與生境部分重疊的中華鱘氨基酸序列的一致性高達(dá)98%, 與其他幾種鱘形目魚(yú)類相比一致性也在95%以上, 表明GH在鱘形目魚(yú)類中高度保守。值得關(guān)注的是達(dá)氏鱘GH氨基酸序列同兩棲類的非洲爪蟾、爬行類的棕樹(shù)蛇、鳥(niǎo)類的雞、哺乳類的人和鼠的一致性要高于幾種真骨魚(yú)類, 這與在中華鱘[14]、歐洲鰉和俄羅斯鱘[15]、波斯鱘[16]中的研究類似, 表明了達(dá)氏鱘作為一種比較原始的魚(yú)類, 在遺傳上與四足類脊椎動(dòng)物的親緣關(guān)系要近于真骨魚(yú)類。將達(dá)氏鱘與其他幾種鱘形目魚(yú)類、真骨魚(yú)類、軟骨魚(yú)類和兩棲類、爬行類、鳥(niǎo)類、哺乳動(dòng)物進(jìn)行了同源性聚類分析,能得到同樣的結(jié)論, 達(dá)氏鱘作為硬骨魚(yú)類家族中古老的物種, 研究其進(jìn)化過(guò)程具有重要意義。

魚(yú)類生長(zhǎng)受到遺傳、營(yíng)養(yǎng)和內(nèi)分泌等多種因素的調(diào)控, 而遺傳及營(yíng)養(yǎng)因素主要是通過(guò)內(nèi)分泌途徑影響生長(zhǎng)。目前已知調(diào)控魚(yú)類生長(zhǎng)的內(nèi)分泌軸主要為下丘腦-垂體-肝臟生長(zhǎng)調(diào)控軸, 垂體處于魚(yú)類生長(zhǎng)內(nèi)分泌調(diào)控系統(tǒng)的核心位置, 垂體分泌的生長(zhǎng)激素通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)送到肝臟及其他靶器官, 靶器官受到刺激后胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-I)得以表達(dá), 進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能。除垂體外, 在包括魚(yú)類在內(nèi)的脊椎動(dòng)物中還發(fā)現(xiàn)有垂體外組織存在GH的表達(dá)[27—30], 生長(zhǎng)激素在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)內(nèi), 在皮膚里、在骨骼中甚至在心血管系統(tǒng)內(nèi)都能檢測(cè)到它的表達(dá), 它的功能和作用不僅僅是靠?jī)?nèi)分泌的方式所體現(xiàn), 還能夠通過(guò)自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮生理功能。本研究利用real-time qPCR和western-blot技術(shù)從mRNA和蛋白質(zhì)水平來(lái)了解生長(zhǎng)激素在達(dá)氏鱘組織中的表達(dá)特征, 結(jié)果表明mRNA及蛋白在垂體和下丘腦中表達(dá)。下丘腦在空間距離和功能作用上與垂體聯(lián)系緊密。在對(duì)小鼠的研究中也發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)激素在下丘腦中存在表達(dá), 可能參與了對(duì)腦的功能的調(diào)控[26]。在本研究中除下丘腦和垂體外并未在其他組織中檢測(cè)到mRNA和蛋白的表達(dá), 而GH在不同組織中的表達(dá)和性別、年齡及生長(zhǎng)發(fā)育情況都有一定關(guān)系。本研究試驗(yàn)魚(yú)為1齡幼魚(yú), 可能存在幼魚(yú)期垂體中GH的合成和分泌非常旺盛, 通過(guò)GH-IGFI軸刺激肝臟合成的IGF水平比較高, 從而抑制了垂體外各組織中GH的表達(dá), 不同年齡、性別和生長(zhǎng)發(fā)育情況達(dá)氏鱘GH表達(dá)特征還有待于進(jìn)一步研究。

垂體是魚(yú)類重要的內(nèi)分泌腺體, 參與魚(yú)類生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖和滲透壓等各種生命活動(dòng)的調(diào)控。GH、促性腺激素(GtH)、促甲狀腺激素(TSH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、催乳激素(PRL)、生長(zhǎng)催乳素(SL)和黑色素細(xì)胞刺激激素(MSH)共同組成了魚(yú)體的腺垂體激素, 它們由不同的分泌細(xì)胞分泌, 其分布特征在不同種魚(yú)間是相似的[31—33]。針對(duì)幾種分泌激素的腺垂體細(xì)胞的研究手段主要有常規(guī)染色、免疫組織化學(xué)及免疫熒光標(biāo)記等方法, 本研究利用中華鱘GH抗體進(jìn)行熒光免疫組織化學(xué)研究, 生長(zhǎng)激素抗原能夠特異性的識(shí)別抗體而得以定位, 常規(guī)HE染色輔助定位生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞, HE染色生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞呈強(qiáng)嗜酸性, 兩種定位方式選擇相近切片, 細(xì)胞區(qū)域位置一致, 形態(tài)一致, 共同定位了垂體和下丘腦中的生長(zhǎng)激素分泌細(xì)胞(圖4), 得出的結(jié)果與其他研究一致[31—33]。

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cDNA CLONING, EXPRESSION AND IMMUNOLOCALIZATION OF GROWTH HORMONE GENE IN

SHAN Xi-Shuang1, 2, YUE Hua-Mei1, CHEN Xi-Hua1, YE Huan1, YANG Xiao-Ge1and LI Chuang-Ju1

(1. Key Laboratory of Freshwater Biodiversity Conservation, Ministry of Agriculture of China, Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China; 2.College of Fisheries and Life, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The Dabry’s sturgeon (Dumeril, 1868) mainly distributes in the upper Yangtze River of China. It is currently endangered due to the destruction of their spawning grounds and other anthropogenic interferences. In this study, the full-length cDNA sequence ofwas cloned from SMART cDNAs of pituitary in. The Dabry’s sturgeoncDNA was 1008 bp in length, including a 52 bp 5′-untranslated region (UTR), a 311 bp 3′ UTR and a 645 bp open reading frame (ORF) encoding a peptide of 143 amino acids. Amino acid sequence alignment revealed thatGH shared extremely high identities (over 95%) with its counterparts in other sturgeons. Moreover, sturgeons showed lower GH sequence identities with other bony fish than that of Amphibia, Reptilia, Aves, and Mammalia. By quantitative real-time PCR,mRNAs were detected in the pituitary and hypothalamus but absent in any of other somatic organs examined. Moreover, the expression ofmRNAs in the pituitary was about 110 times to that of hypothalamus. Western-blot analysis suggested the GH expression in both the pituitary and hypothalamus, with higher expression level in the pituitary, which is consistent with the result of qRT-PCR. Immuno?uoresence locali-zation showed strong GH-positive signals in the pars intermedia of the pituitary, together with weak fluorescence signals detected in the hypothalamus. HE staining indicated that GH was mainly secreted by eosinophilic cells in the adenohypophysis. This study will benefit both the evolution study of vertebrategenes and the further biological function study of GH in cultured.

; Growth hormone; qRT-PCR; Western-blot; Immunolocalization

10.7541/2015.41

Q344+.1

A

1000-3207(2015)02-0307-08

2014-04-25;

2014-09-22

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目課題一(2011AA100401); 中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2013JBFZ01); 國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31001104)資助

單喜雙(1989—), 男, 吉林扶余人; 碩士研究生; 主要研究方向?yàn)轸~(yú)類分子遺傳。E-mail: s9shanxishuang@126.com

李創(chuàng)舉, 博士, 副研究員, 碩士研究生導(dǎo)師; E-mail: lcj@yfi.ac.cn