李 雷，王永杰，陳 浩，秦永剛，周煜博，趙嘉勛，郭 麗

（吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長春 130021）

燒傷是熱、電、化學(xué)和放射等造成損傷的總稱，是醫(yī)學(xué)界一直關(guān)注的研究重點。嚴重?zé)齻l(fā)多器官功能障礙綜合征的死亡率極高。嚴重?zé)齻饳C體低灌注造成全身性的缺血缺氧和代謝障礙、炎癥反應(yīng)和Ca2＋穩(wěn)態(tài)失調(diào)等是造成多器官衰竭的重要機制［1－2］。海馬體是人類大腦的重要功能區(qū)，與學(xué)習(xí)記憶等高級功能有密切關(guān)聯(lián)，對炎癥和缺血低灌注損傷極具易感性，是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的主要中樞結(jié)構(gòu)，也是應(yīng)激作用的主要靶器官［3］。研究［4］表明：血腦屏障早在嚴重?zé)齻?h后開放，并持續(xù)數(shù)天。嚴重?zé)齻?，炎癥反應(yīng)進一步對大腦造成損害［5］。Li等［6］證實：燒傷后大腦血管內(nèi)皮、神經(jīng)元和突觸有不同程度的壞死。自噬是真核細胞的細胞器和蛋白質(zhì)分子降解的主要細胞路徑［7］，機體受到應(yīng)激刺激可過度激活自噬的發(fā)生，造成細胞死亡和組織功能受損。Zhu等［8］研究發(fā)現(xiàn)：利用小鼠構(gòu)建缺血缺氧模型，在腦缺血8h后大量自噬泡形成，自噬相關(guān)蛋白輕鏈3蛋白 （light chain 3 protein，LC3B）高表達。并且在神經(jīng)退行性病變中過度自噬可引起神經(jīng)細胞壞死［9］。自噬標(biāo)志物輕鏈3（light chain 3，LC3）的活性形式LC3B是自噬體膜的特異性組成成分，可指示自噬激活。Beclin 1也是常用做評價自噬激活的指示蛋白［10］。

神經(jīng)膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要細胞類型，具有滋養(yǎng)神經(jīng)細胞、傳遞信息的作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時，能保護和重塑神經(jīng)元［11］。研究［12］表明：在正常情況下神經(jīng)膠質(zhì)細胞標(biāo)志物神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白 （glial fibrillary acidic protein，GFAP）受星形膠質(zhì)細胞的動力調(diào)節(jié)，損傷后增生的GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞能促進星形膠質(zhì)細胞的有絲分裂，使原始祖細胞分化為成熟的星形膠質(zhì)細胞，GFAP是神經(jīng)膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生的標(biāo)志。在中樞神經(jīng)受到刺激或損傷，神經(jīng)膠質(zhì)細胞會反應(yīng)性增生，代償保護神經(jīng)元免受應(yīng)激等帶來的損傷［13］。

目前，關(guān)于嚴重?zé)齻蠛ｑR損傷研究主要集中在神經(jīng)標(biāo)志物方面，對燒傷能否引起神經(jīng)細胞自噬和神經(jīng)膠質(zhì)細胞反應(yīng)未見報道。因此，本實驗通過制備嚴重?zé)齻笫竽Ｐ?，探討大鼠海馬體神經(jīng)細胞在燒傷刺激后的改變，闡明自噬和神經(jīng)膠質(zhì)細胞反應(yīng)在海馬體神經(jīng)細胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性Wistar大鼠20只，體質(zhì)量 （200±20）g，購于吉林大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：SCXK－（吉）2008－0005。隨機分為正常對照組和模型組，每組10只。模型組大鼠用于制備燒傷模型。

1.2 燒傷模型的制備 根據(jù)文獻 ［14］報道的方法并略有改進制備嚴重?zé)齻笫竽Ｐ?。按照Mech－Rubner公式：A （cm2）＝ K·W2／3［A，動物體表面積；K＝9.1（大鼠）；W，動物體質(zhì)量］，計算動物30%總體表面積 （total body surface area，TBSA），并在大鼠背部進行標(biāo)記。大鼠燒傷前背部剃毛，8%硫化鈉脫毛，清水洗凈晾干，備皮待處理。以0.3mL·100g－1體質(zhì)量的劑量向腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛溶液麻醉后，將大鼠背部的標(biāo)記區(qū)域浸入 （97±1）℃水中18s，造成30%TBSAⅢ度燙傷，之后立即按4mL·100g－1劑量腹腔注入生理鹽水抗休克，分籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水。

1.3 大鼠一般情況觀察 造模后1周內(nèi)觀察大鼠進食、飲水等情況。

1.4 大鼠海馬體神經(jīng)細胞病理組織學(xué)觀察 造模1周后斷頭取大鼠大腦，固定于10%甲醛固定液中。石蠟包埋，切片，HE染色和尼氏體染色，顯微鏡下觀察大鼠海馬體的病理組織學(xué)表現(xiàn)。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠海馬體GFAP、神經(jīng)元標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白2（MAP－2）和LC3B、Beclin 1的表達 采用SP法：石蠟切片常規(guī)脫蠟，自來水洗3次；98℃枸櫞酸溶液抗原修復(fù)5min；室溫冷卻；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育30min；PBS洗3次；動物非免疫血清，室溫封閉30min；加一抗 （GFAP和MAP－2，1∶300稀釋；LC3B和Beclin 1，1∶200稀釋），4℃過夜；PBS洗3次；生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育30min；PBS洗3次；加入鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶，室溫孵育30min；PBS洗3次；DAB顯色；自來水洗2次；蘇木精復(fù)染；弱氨水返藍；過梯度酒精和二甲苯，脫水透明；中性樹脂封片。采用Image Pro Plus 6.0軟件分析 GFAP、MAP－2、LC3B和Beclin 1的表達情況，以積分光密度 （IA）值表示蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。各組大鼠海馬體神經(jīng)膠質(zhì)細胞中GFAP、MAP－2、LC3B和Beclin 1蛋白表達水平以表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗。以α＝0.05為檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般情況 正常對照組大鼠進食、飲水正常，活潑、好動；模型組大鼠在燒傷后1周內(nèi)進食、飲水減少，萎靡少動。

2.2 大鼠海馬體組織病理形態(tài)學(xué) 大鼠燒傷后1周，HE染色結(jié)果：模型組大鼠海馬體神經(jīng)細胞呈水腫狀態(tài)，核固縮；尼氏體染色結(jié)果：模型組大鼠神經(jīng)細胞內(nèi)尼氏體淡染，排列紊亂。正常對照組大鼠神經(jīng)細胞中未觀察到組織病理改變。見圖1。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠海馬體神經(jīng)細胞標(biāo)志物的表達 模型組大鼠海馬體神經(jīng)膠質(zhì)細胞中GFAP呈高表達，MAP－2表達較少。模型組大鼠海馬體神經(jīng)膠質(zhì)細胞中GFAP表達明顯高于正常對照組 （P＜0.05）；模型組大鼠海馬體神經(jīng)膠質(zhì)細胞中MAP－2的表達明顯低于正常對照組 （P＜0.05）。見圖2和表1。

2.4 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠海馬體神經(jīng)膠質(zhì)細胞中LC3B和Beclin 1的表達 模型組大鼠海馬體神經(jīng)膠質(zhì)細胞中LC3B和Beclin 1自噬蛋白均呈高表達。模型組大鼠海馬體神經(jīng)膠質(zhì)細胞中LC3B和Beclin 1表達水平明顯高于正常對照組 （P＜0.05）。見圖3和表1。

表1 嚴重?zé)齻笫蠛ｑR體神經(jīng)膠質(zhì)細胞中GFAP、MAP－2、LC3B和Beclin 1的表達水平Tab.1 Expression levels of GFAP，MAP－2，LC3B，and Beclin 1in neuroglia cells in hippocampus tissue of severe burn rats（）

表1 嚴重?zé)齻笫蠛ｑR體神經(jīng)膠質(zhì)細胞中GFAP、MAP－2、LC3B和Beclin 1的表達水平Tab.1 Expression levels of GFAP，MAP－2，LC3B，and Beclin 1in neuroglia cells in hippocampus tissue of severe burn rats（）

＊ P＜0.05compared with normal control group.

Group IA GFAP MAP－2 LC3B Beclin 1 Normal control 3756.38±383.09 10405.05±1472.38 686.52±85.56 982.95±65.68 Model 14372.61±1500.86＊ 4417.90±802.66＊ 2710.84±175.98＊ 4951.59±1062.94＊

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠燒傷后1周，狀態(tài)較差；HE和尼氏體染色病理觀察顯示：模型組大鼠的海馬神經(jīng)細胞受損；神經(jīng)元標(biāo)志物MAP－2在模型組大鼠海馬體低表達進一步說明受損的神經(jīng)細胞包括神經(jīng)元。神經(jīng)膠質(zhì)細胞標(biāo)志物GFAP在海馬體高表達提示：燒傷后海馬體的神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化，出現(xiàn)反應(yīng)性增生的現(xiàn)象。同時，模型組大鼠海馬體神經(jīng)細胞中LC3B和Beclin 1表達明顯升高提示：燒傷后海馬體的神經(jīng)細胞出現(xiàn)過度自噬。

有研究［15］表明：缺血、缺氧和炎性介質(zhì)等可造成海馬部位神經(jīng)元損傷。嚴重?zé)齻自斐膳K器缺血缺氧、細胞中鈣超載、能量代謝障礙、機體炎癥反應(yīng)和釋放氧自由基及炎癥因子等。在血腦屏障開放的情況下，氧自由基和炎癥因子等進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可造成海馬體神經(jīng)細胞損傷［4］。自噬標(biāo)志性蛋白LC3B和Beclin 1在模型組大鼠海馬體中呈高表達，表明燒傷啟動了神經(jīng)細胞的過度自噬過程可能是神經(jīng)細胞損傷的機制。研究［16－17］表明：創(chuàng)傷性腦損傷 （TBI）中，谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLT－1活性明顯下降，細胞外谷氨酸濃度升高，從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性，可能導(dǎo)致神經(jīng)元自噬的發(fā)生。GLT－1活性下調(diào)可導(dǎo)致細胞外谷氨酸濃度升高，刺激NMDA受體、代謝型谷氨酸受體1（mGluRl）和紅藻氨酸鹽受體，導(dǎo)致了神經(jīng)元自噬發(fā)生及興奮性神經(jīng)元死亡［18］。由此推測嚴重?zé)齻赡芙档土舜笫蠛ｑRGLT－1轉(zhuǎn)運體活性，引起海馬過度自噬的激活。

另外，GFAP作為神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標(biāo)志物，在模型組大鼠的海馬體中呈高表達，可能是神經(jīng)膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元的代償性保護。研究［13，19－21］顯示：腦缺血后星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性上調(diào)縫隙連接蛋白Cx43和Cx43mRNA的表達，保護受損的神經(jīng)細胞。

綜上所述，燒傷作為損傷因素在損傷模型中起主要作用，最終引起神經(jīng)細胞死亡。嚴重?zé)齻烧T發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)海馬體的神經(jīng)細胞的過度自噬，損傷神經(jīng)細胞，受損神經(jīng)細胞可啟動神經(jīng)膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生以減輕損傷強度，但具體機制及兩者關(guān)系仍需深入研究。

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