孫曉宏，房福元，李 卉，尹 娜，龐作良，李惠武

（1.新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，新疆 烏魯木齊 830011；2.廣東省深圳市人民醫(yī)院胸外科，廣東 深圳 518020；3.新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院科研中心，新疆 烏魯木齊 830001）

食管癌是居于全球第8位的惡性腫瘤，在全球癌癥死亡原因中位列第6位。2008年，全球被診斷為食管癌患者482300例，有406800例死于食管 癌［1］。2003—2007 年 我 國 食 管 癌 發(fā) 病 率 為19.24／10萬，在癌癥發(fā)病構成中排列第6位，同期食管癌死亡率為15.39／10萬，在癌癥死亡原因中列第4位［2］。中國食管癌發(fā)病占全球的53.8%，死亡占全球的51.9%［3］。腫瘤細胞的轉移與細胞外基質 （extra cellular matrix，ECM）的降解有密切關聯(lián)［4］。ECM由多種蛋白裂解酶降解，其中包括基質金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinase，MMP）。國外鮮有關于MMP與食管癌發(fā)生發(fā)展關系的研究，國內對于MMP的研究多采用免疫組織化學法，且多是單獨針對MMP中某一單一基因的研究。本研究應用逆轉錄－聚合酶鏈式反應 （RTPCR）技術檢測基質金屬蛋白酶2（MMP－2）和基質金屬蛋白酶9（MMP－9）基因在食管癌組織及其相應的癌旁組織中的表達情況，同時采用Western blotting技術在蛋白水平予以驗證，從基因轉錄水平和蛋白表達水平探討兩者在食管癌發(fā)生發(fā)展和轉移中的作用，闡明兩者之間的關聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2009年12月—2011年10月在新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院行食管癌根治性切除的100例患者的手術標本，均為經病理檢查證實的食管鱗狀細胞癌標本，每例標本分別取癌組織及其相應癌旁組織各1份，于液氮冷凍后在－80℃冰箱儲存留待檢測。100例患者中，男性72例，女性28例；年齡37～80歲，中位年齡為57.4歲。食管癌TNM分期：T1＋T2期24例，T3＋T4期76例；有淋巴結轉移者52例，無淋巴結轉移者48例；高分化者77例，中、低分化者23例。

1.2 主要試劑和儀器

實驗所用Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，PCR試劑盒購自上海生物工程有限公司，溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、氯仿、無水乙醇、異戊醇和異丙醇等由新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院科研中心提供；PCR擴增儀和DC 2000凝膠成像分析儀為美國Bio－Rad公司生產。

1.3 RT－PCR法檢測 MMP－2和 MMP－9mRNA 陽性表達率

1.3.1 組織標本中總RNA的提取及其濃度檢測

按照Trizol試劑盒的操作步驟提取組織標本總RNA，于紫外分光光度計下分別測定提取的1μg RNA在260和280nm處的吸光度A260和A280值，計算A260／A280比值，使其在1.8～2.1以保證所提取的RNA的濃度和純度。取5μL RNA于1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像分析儀觀察提取的RNA 18S和28S條帶，確保所提RNA的質量。

1.3.2 合成cDNA 在1μL總RNA標本中分別加引物1μL和雙蒸水9μL，將其混勻后72℃恒溫溫浴10min后取出，將混合液置于冰上，依次加dNTP 2μL、MgCl24μL、RNA酶抑制劑0.5μL、10×緩沖液2μL和逆轉錄酶0.5μL混勻，42℃恒溫1h，95℃恒溫5min，取出并放置在冰上，再加入雙蒸水80μL使最終逆轉錄產物體積為100μL。

1.3.3 PCR反應 向6μL雙蒸水中依次加入目的基因正、反向引物各1μL和2倍濃度的PCR試劑盒反應液10μL，再加已合成的cDNA 2μL，使PCR反應體系終體積為20μL。各基因引物序列、產物大小和PCR反應溫度值見表1。

表1 MMP－2、MMP－9和GAPDH的引物序列和PCR反應條件Tab.1 Primer sequences of MMP－2，MMP－9and GAPDH and reaction conditions of PCR

1.3.4 PCR擴增產物的判定 于5μL PCR反應產物中加入緩沖液 （buffer）1μL后，行2%瓊脂糖凝膠電泳，在DC 2000凝膠成像分析儀下觀察目的基因條帶并保存圖像。在499bp附近出現(xiàn)亮色條帶，則 MMP－2表達陽性，否則為陰性；在308bp附近出現(xiàn)亮色條帶，則MMP－9表達陽性，否則為陰性。

1.4 Western blotting法檢測 MMP－2和 MMP－9蛋白表達

選用Trizol法制備蛋白樣品，測定蛋白水平，電泳完畢后轉膜，然后封閉蛋白膜，分別加一抗孵育和二抗孵育，孵育結束后給予化學發(fā)光、顯影及定影，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標條帶的相對分子質量和A值。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。癌組織和癌旁正常組織中 MMP－2和 MMP－9陽性表達率比較采用χ2檢驗。MMP－2和MMP－9陽性表達率的相關性分析采用Pearson相關分析。

2 結 果

2.1 RT－PCR法檢測癌組織和癌旁正常組織中MMP－2mRNA 和 MMP－9mRNA 表達率

100例癌組織標本中MMP－2mRNA陽性表達率為 89.0% （89／100），對應癌旁正常組織中MMP－2mRNA的陽性表達率為76.0%（76／100），MMP－2mRNA在癌組織中的陽性表達率高于癌旁正 常組織（χ2＝5.853，P＝0.016）；癌組織中MMP－9mRNA陽性表達率為48.0% （48／100），對應癌旁正常組織中MMP－9mRNA的陽性表達率為16.0% （16／100），MMP－9mRNA 在癌組織中的陽性表達率高于癌旁正常組織 （χ2＝23.529，P＝0.000）。見圖1。

圖1 癌組織和癌旁正常組織中 MMP－2mRNA和MMP－9 mRNA表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expreesions of MMP－2mRNA and MMP－9mRNA in tumor tissue and adjacent normal tissue

2.2 Western blotting法檢測癌組織和癌旁正常組織中MMP－2和MMP－9蛋白表達水平

隨機選取5例標本，Western blotting檢測結果與對應的RT－PCR檢測結果基本一致。見圖2。

2.3 不同臨床病理特征食管鱗狀細胞患者癌組織中 MMP－2和MMP－9mRNA陽性表達率

MMP－2mRNA和 MMP－9mRNA陽性表達率與腫瘤浸潤深度有關聯(lián) （P＜0.05），與腫瘤淋巴結轉移、患者的性別、年齡和腫瘤分化程度均無關聯(lián) （P＞0.05）。見表2。

圖2 癌組織和癌旁正常組織中MMP－2和 MMP－9蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of MMP－2and MMP－9proteins in tumor tissue and adjacent normal tissue

2.4 癌組織中 MMP－2mRNA 和 MMP－9mRNA陽性表達率的相關性分析

Pearson相關分析結果顯示：MMP－2mRNA與MMP－9mRNA陽性表達率呈正相關關系 （r＝0.274，P＝0.006）。見表3。

3 討 論

MMPs是一類能夠降解ECM和基底膜組分的蛋白水解酶，其家族成員目前已超過20個，根據(jù)各自降解底物的特異性和自身結構的不同分為膠原酶、間質溶解素和明膠酶。關于MMP－2在各種腫瘤組織及正常組織中的表達情況有多位學者進行了研究，因所采用的研究方法不同，其研究結果不盡相同，甚至有些結果是截然相反的。李秀梅等［4］采用RT－PCR法檢測食管癌組織中MMP－2表達結果顯示：食管癌組織中MMP－2的表達較正常組織增高。多位學者［5－8］采用免疫組織化學法檢測食管癌組織中MMP－2的表達結果顯示：MMP－2在食管癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織。本研究結果顯示：食管鱗狀細胞癌組織中的 MMP－2 mRNA的表達水平明顯高于癌旁正常組織，并且MMP－2mRNA的表達與腫瘤浸潤深度有關聯(lián)。本研究結果與上述研究結果一致，故認為MMP－2在食管癌發(fā)生和浸潤性生長過程中發(fā)揮了重要作用。Hong等［9］和 Koskensalo等［10］應用免疫組織化學法檢測結直腸癌組織中 MMP－2的表達，結果顯示：MMP－2與結直腸癌的淋巴結轉移無關聯(lián)。Hwang等［11］應用免疫組織化學法觀察胃癌組織中MMP－2的表達結果顯示：MMP－2與腫瘤淋巴結轉移無關。于維娜等［12］應用免疫組織化學法檢測食管癌組織中 MMP－2的表達結果顯示：MMP－2蛋白表達與淋巴結轉移無關聯(lián)。本研究結果顯示：MMP－2的表達與腫瘤淋巴結轉移無關聯(lián)，與上述研究結果一致，故認為MMP－2在食管癌淋巴結轉移方面不發(fā)揮關鍵作用。

表2 不同臨床特征食管鱗狀細胞癌患者癌組織中MMP－2mRNA和MMP－9mRNA陽性表達率Tab.2 Positive expression rates of MMP－2mRNA and MMP－9mRNA in tumor tissue of patients with different clinical characteristics

表3 癌組織中MMP－2mRNA和MMP－9mRNA表達水平的相關性Tab.3 Correlation between expressions of MMP－2mRNA and MMP－9mRNA in tumor tissue

近年研究［13－14］顯示：MMPs在多種腫瘤組織中均高表達，且與腫瘤浸潤有關聯(lián)。MMP－9在胃癌組織中的表達水平高于癌旁正常胃黏膜組織，且MMP－9的表達與胃癌浸潤深度有關聯(lián)；Chen等［15］對食管癌的研究發(fā)現(xiàn)：胎盤生長因子（PLGF）促進食管癌的轉移是通過對MMP－9的激活實現(xiàn)的。Li等［16］研究發(fā)現(xiàn)：環(huán)孢菌素A／MMP－9信號通路有助于食管癌細胞的惡性轉變。有關食管癌的其他研究［17］也顯示：癌組織中MMP－9的表達水平高于癌旁正常組織，且其表達與食管癌浸潤深度有關聯(lián)。本研究結果顯示：癌組織中 MMP－9 mRNA陽性表達率明顯高于癌旁正常組織，并且其表達與腫瘤浸潤深度有關聯(lián)。本研究結果與上述各研究結論一致，故認為MMP－9在食管癌發(fā)生及浸潤性生長過程中發(fā)揮了重要作用。Koskensalo等［10］應用免疫組織化學法對結直腸癌的研究顯示：MMP－9的表達與腫瘤淋巴結轉移無關聯(lián)。Durlik等［18］應用免疫組織化學法對胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn)：MMP－9的表達與淋巴結轉移無關聯(lián)。Oshima等［19］應用RT－PCR法對結直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)：MMP－9與腫瘤淋巴結轉移無關聯(lián)。Lu等［20］應用免疫組織化學法對食管癌的研究發(fā)現(xiàn)：MMP－9與淋巴結轉移無關聯(lián)。本研究結果顯示：MMP－9的表達與腫瘤淋巴結轉移無關聯(lián)，與上述研究結果一致，故認為MMP－9在食管癌淋巴結轉移方面不發(fā)揮關鍵作用。

本研究結果顯示：MMP－2與 MMP－9mRNA的表達呈正相關關系，說明 MMP－2mRNA和MMP－9mRNA的表達之間有相互促進的作用，可能相互協(xié)同促進腫瘤的發(fā)生和進展。

綜上所述，食管癌的發(fā)生發(fā)展不是單一基因控制的反應過程。本研究結果顯示：MMP－2和MMP－9可能促進了食管鱗狀細胞癌的發(fā)生，同時可能增強了食管鱗狀細胞癌的浸潤生長能力；MMP－2和 MMP－9與食管癌的淋巴結轉移可能均無關聯(lián)；MMP－2和 MMP－9表達水平的上調可能是食管癌發(fā)病的機制之一；對 MMP－2和 MMP－9的聯(lián)合檢測可評價食管鱗狀細胞癌的浸潤生長程度。本研究結果為進一步闡明食管癌的發(fā)生發(fā)展和轉移機制提供了實驗依據(jù)。

［1］Jemal A，Bray F， Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61 （2）：69－90.

［2］張思維，張 敏，李光琳，等.2003－2007年中國食管癌發(fā)病與死亡分析 ［J］.中國腫瘤，2012，21 （4）：241－247.

［3］Wei WQ，Yang J，Zhang SW，et al.Analysis of the esophageal cancer mortality in 2004－2005and its trends during last 30years in China ［J］.Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi，2010，44 （5）：398－402.

［4］李秀梅，陳 艷，王洪江，等.哈薩克族食管癌中MMP－1、MMP－2、MMP－7、TIMP－1和 MTA1的表達及其臨床病理意義 ［J］.癌變·畸變·突變，2011，23 （3）：190－193，198.

［5］劉 敏，郭曉娟，張紅霞，等.食管癌中EGFRvⅢ、MMP－2的表 達特點 及意 義 ［J］.現(xiàn)代腫 瘤醫(yī)學，2010，18 （1）：62－66.

［6］陳超伍，馬洪升.基質金屬蛋白酶在食管癌組織中的表達及與微量元素含量之間的關系 ［J］.世界華人消化雜志，2010，18 （19）：1995－2000.

［7］岳慶峰，向 明，李方明，等.食管癌組織DcR3、MMP－2表達及其對生存率的影響 ［J］.中國癌癥雜志，2010，20 （10）：745－750.

［8］Li Y，Ma J，Guo Q，et al.Overexpression of MMP－2and MMP－9in esophageal squamous cell carcinoma ［J］.Dis Esophagus，2009，22 （8）：664－667.

［9］Hong SW， Kang YK， Lee B， et al. Matrix metalloproteinase－2and－7expression in colorectal cancer ［J］.Korean Soc Coloproctol，2011，27 （3）：133－139.

［10］Koskensalo S，Hagstr?m J，Linder N，et al.Lack of MMP－9expression is a marker for poor prognosis in Dukes’B colorectal cancer［J］.BMC Clin Pathol，2012，12 （7）：12－24.

［11］Hwang TL，Lee LY，Wang CC，et al.Claudin－4expression is associated with tumor invasion， MMP－2and MMP－9 expression in gastric cancer ［J］.Exp Ther Med，2010，1 （5）：789－797.

［12］于維娜.MMP－2、TIMP－2、PINCH在食管鱗狀細胞癌中的表達意義及相關性研究 ［D］.石家莊：河北醫(yī)科大學，2011.

［13］董剛強，王永占，蒲 紅，等.基質金屬蛋白酶MMP－9在胃癌中的表達及其臨床意義 ［J］.腫瘤預防與治療，2012，25 （4）：240－242.

［14］陳其軍，呂自力，黨裔武，等.MMP－9和TIMP－1在胃癌組織中的表達失衡及其與ZHX2的相關性 ［J］.世界華人消化雜志，2012，20 （20）：1832－1837.

［15］Chen Y，Jiang T，Mao A，et al.Esophageal cancer stem cells express PLGF to increase cancer invasion through MMP9 activation［J］.Tumour Biol，2014，35 （12）：12749－12755.

［16］Li Y，Guo H，Dong D，et al.Expression and prognostic relevance of cyclophilin A and matrix metalloproteinase 9in esophageal squamous cell carcinoma ［J］.Diagn Pathol，2014，18 （8）：207－212.

［17］關耀武.食管鱗狀細胞癌組織中VEGF、MMP－9的表達及意義 ［J］.山東醫(yī)藥，2011，51 （6）：86－87.

［18］Durlik M，Gardian K.Metalloproteinase 2and 9activity in the development of pancreatic cancer［J］.Pol Przegl Chir，2012，84 （8）：377－382.

［19］Oshima T， Kunisaki C， Yoshihara K， et al.Clinicopathological significance of the gene expression of matrix metalloproteinases and reversion－inducing cysteine－richprotein with Kazal motifs in patients with colorectal cancer：MMP－2gene expression is a useful predictor of liver metastasis from colorectal cancer ［J］.Oncol Rep，2008，19 （5）：1285－1291.

［20］Lu CL，Ji Y，Ge D，et al.The expression of CXCR4and its relationship with matrix metalloproteinase－9／vascular endothelial growth factor in esophageal squamous cell cancer［J］.Dis Esophagus，2011，24 （4）：283－290.