武 興，賈志芳，尤麗麗，曹東慧，王 川，曹雪源，姜 晶

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院臨床流行病學(xué)研究中心，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院胃結(jié)直腸外科，吉林 長春 130021）

胃癌在我國惡性腫瘤中發(fā)病率居第2位，并且發(fā)現(xiàn)時以中晚期為主，預(yù)后較差，5年生存率僅為20%左右［1］。研究［2－3］發(fā)現(xiàn)：遺傳變異特別是基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與胃癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。

近年來，隨著表觀遺傳學(xué)的興起，與基因轉(zhuǎn)錄過程相關(guān)酶的基因多態(tài)性研究已成為熱點(diǎn)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase1，DNMT1）是DNA甲基化過程的關(guān)鍵酶，對新合成的DNA鏈進(jìn)行甲基化修飾以維持其甲基化水平，其功能的紊亂可引起抑癌基因的高甲基化而失活，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。DNMT1在許多惡性腫瘤如胃癌和乳腺癌中表達(dá)升高，且表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的分化程度、臨床分期相關(guān)，提示DNMT1可能參 與 了 腫 瘤 的 發(fā)生發(fā)展過程［4－5］。 已有研究［6－7］顯示：DNMT1基因多態(tài)性與乳腺癌、卵巢癌等腫瘤易感性有密切關(guān)聯(lián)。既往國內(nèi)外研究大多只關(guān)注于DNMT1基因變異與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，但目前尚未見DNMT1基因多態(tài)性與胃癌預(yù)后的相關(guān)報(bào)道。本研究選擇DNMT1基因上的5個標(biāo)簽SNPs，旨在探討SNP與胃癌預(yù)后的關(guān)系，以期尋找預(yù)測胃癌預(yù)后的可能的標(biāo)志物，為個體化治療提供合理的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象的選擇 選取2008年1月—2010年12月在吉林大學(xué)第一醫(yī)院確診為胃癌的患者共447例納入研究隊(duì)列。納入標(biāo)準(zhǔn)：來自吉林省長春地區(qū)，中國北方漢族人，年齡30～90歲，在本院胃結(jié)直腸外科進(jìn)行胃癌根治術(shù)治療，并經(jīng)組織病理學(xué)確診為胃癌 （非賁門癌）的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡小于30歲或大于90歲者，非中國漢族北方人群，并發(fā)其他嚴(yán)重疾病可能會影響到胃癌病情進(jìn)展者。本研究獲得吉林大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象簽署知情同意書同意參加研究并捐獻(xiàn)4mL EDTA抗凝血。

1.2 術(shù)后隨訪管理 由隨訪員于患者術(shù)后3個月、6個月和之后每6個月1次對所有研究對象進(jìn)行電話隨訪，收集胃癌患者術(shù)后治療、復(fù)發(fā)進(jìn)展和死亡等資料，患者最后一次隨訪截止日期為2014年11月24日，全部患者完成了5.8～76.7個月的隨訪 （中位隨訪時間為51.3個月）。生存分析時，觀察終點(diǎn)為患者由于胃癌復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移引起死亡，其他與胃癌無關(guān)的心腦血管疾病等導(dǎo)致的死亡均按失訪處理。生存時間定義為從手術(shù)日期到死亡日期 （如果對象死亡），或到末次隨訪時間 （如果尚存活），或到上一次有隨訪信息的時間 （如果失訪）。若研究對象出院后至第一次隨訪 （術(shù)后3個月）間失訪或死于手術(shù)并發(fā)癥，生存分析時予以排除。

1.3 胃癌患者基因組DNA的提取 采集422例胃癌患者外周靜脈血各4mL，分離出白細(xì)胞層，采用Axyprep血基因組DNA提取試劑盒（Axygen公司，美國）提取外周血DNA。采用NanoDrop 2000核酸測定儀 （Thermo Fisher Scientifc公司，美國）檢測DNA濃度及純度，以A280／A260比值 （比值應(yīng)在1.8～2.0之間，若明顯降低，說明樣本已被蛋白污染，需重新制備）來判斷DNA樣本純度，計(jì)算DNA樣本的濃度，標(biāo)準(zhǔn)化到20μg·L－1待用。將提取好的DNA置于－80℃冰箱中恒溫保存待用。

1.4 SNPs位點(diǎn)的選擇和分型 應(yīng)用SNP browserTMv 4.0軟件篩選中國漢族人群DNMT1基因的標(biāo)簽SNPs，要求其最小等位基因頻數(shù)（MAF）＞0.05且r2＞0.8［8］，共27個SNPs位點(diǎn)滿足MAF＞0.05，其中21個SNPs顯示與標(biāo)簽SNPs完全連鎖不平衡 （D’＝1且r2＞0.8），并且由于rs8108166與rs2228611完全連鎖不平衡（D’＝1且r2＝1），故將rs8108166予以排除。最終選 擇了 rs16999593、rs10420321、rs2288349、rs2228611和rs2228612共5個位點(diǎn)。采用TaqMan技術(shù) （Applied Biosystems公司，美國）進(jìn)行基因分型，由此避免了常規(guī)PCR操作中帶來的諸多污染源，可保證結(jié)果的良好重復(fù)性。BIORAD S1000TM 熱循環(huán)儀 （Bio－Rad公司，美國）設(shè)置的反應(yīng)條件為：95℃、10min，95℃、15s，60℃、1min，共40個循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用Kaplan－Meier法計(jì)算同一位點(diǎn)不同基因型患者的術(shù)后中位生存時間并繪制生存曲線，Log－rank檢驗(yàn)分析各基因型的生存曲線有無差異。Cox單因素回歸模型定量計(jì)算腫瘤分化程度、臨床分期等與生存的關(guān)系。在調(diào)整性別、年齡和臨床分期等因素后，采用Cox多因素回歸模型計(jì)算不同基因型的胃癌患者生存率的風(fēng)險比 （hazard ratio，HR）及95%可信區(qū)間 （confidence interval，CI）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象的一般特征 447例胃癌手術(shù)治療的患者中，有22例患者圍手術(shù)期死于手術(shù)并發(fā)癥，3例術(shù)后出院后即失訪，因此422例研究對象納入生存分析。其中，男性305例 （72.3%），女性117例 （27.7%）；手術(shù)時年齡中位數(shù)為61歲（35～90歲），納入患者的一般特征見表1。

表1 不同臨床病理特征胃癌患者的生存時間Tab.1 Survival time of patients with different clinicopathological characteristics

截止到最后一次隨訪，422例研究對象的中位隨訪時間為51.3個月，最長為76.7個月。期間有175例患者死于胃癌，10例患者死于其他原因，7例患者失訪，230例患者仍存活。單因素Cox回歸模型顯示：腫瘤直徑＞5cm、有脈管浸潤、分化程度低的患者術(shù)后死亡風(fēng)險升高。隨著腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移程度和臨床分期的升高胃癌患者的中位生存時間明顯縮短 （P＜0.01）。未發(fā)現(xiàn)患者的年齡、性別、胃癌病理類型及有無術(shù)后化療與生存時間有關(guān)聯(lián) （P＞0.05）。

2.2 DNMT1基因多態(tài)性對胃癌預(yù)后的影響Log－rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示：攜帶rs2228611GA／AA基因型的胃癌患者較攜帶GG基因型的患者術(shù)后死亡風(fēng)險明顯降低 （Log－rank P＝0.006，圖1A）。在調(diào)整了年齡、性別和臨床分期后，攜帶rs2228611GA／AA基因型的患者術(shù)后死亡風(fēng)險較GG基因型的患者降低了34% （HR：0.66，95%CI：0.49～0.88）。 與 rs2228611 相 反， 攜 帶rs2288349GA／AA基因型患者術(shù)后死亡風(fēng)險是GG基因型患者的1.33倍 （HR：1.33，95%CI：1.00～1.77，圖 1B）。未發(fā) 現(xiàn)其他3 個 位 點(diǎn)（rs16999593、rs10420321和rs2228612）與胃癌患者術(shù)后的生存有關(guān)聯(lián) （表2）。

2.3 胃癌患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析 為了鑒別影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素，采用逐步回歸的方法分別將rs2228611和rs2288349基因多態(tài)性與胃癌術(shù)后患者生存的關(guān)系進(jìn)行多因素Cox回歸分析（表3），將單因素分析結(jié)果中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素回歸模型。腫瘤直徑大小、有無脈管浸潤、臨床分期和rs2228611（GA＋AA vs GG）是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素，且rs2228611 GA／AA基因型與胃癌術(shù)后死亡風(fēng)險降低有關(guān)（HR：0.68，95%CI：0.50～0.92）。經(jīng)多因素回歸模型調(diào)整后，雖然rs2288349GA／AA基因型患者術(shù)后死亡風(fēng)險是GG基因型患者的1.37倍（HR：1.37，95%CI：0.98～1.82），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義 （P＝0.068）。

3 討 論

圖1 不同DNMT1基因型胃癌患者術(shù)后Kaplan－Meier生存曲線Fig.1 Kaplan－Meier survival curves of gastric cancer patients with different genotypes of DNMT1after operation

臨床上影響胃癌預(yù)后的因素有很多，即使在相同病期和治療條件下，患者的預(yù)后也不盡相同，提示患者自身的遺傳因素在預(yù)后中發(fā)揮了重要作用。SNP是人類基因組中最常見的遺傳變異，因此，本研究重點(diǎn)討論DNMT1基因多態(tài)性對胃癌患者術(shù)后長期生存的影響。本研究結(jié)果顯示：攜帶DNMT1rs2228611位點(diǎn)GA／AA基因型的胃癌患者，術(shù)后死亡風(fēng)險較GG基因型攜帶者降低34%，在多因素分析調(diào)整了混雜因素可能對生存的影響后結(jié)果無變化，提示A等位基因在術(shù)后生存中可能扮演了一個保護(hù)性角色。

DNA甲基化是常見的表觀遺傳修飾，由DNMTs家族催化，包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b 等［9］。DNMT1基因位于染色體19p13.2，全長62000bp，由40個外顯子組成，是DNA進(jìn)行復(fù)制修復(fù)并維持其正常甲基化的關(guān)鍵酶。許多研究結(jié)果［10］顯示：DNMT1與DNA甲基化異常有關(guān)，且二者與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。DNMT1蛋白表達(dá)水平上升，催化抑癌基因的啟動子發(fā)生高甲基化，致使抑癌基因沉默，從而導(dǎo)致包括胃癌在內(nèi)的腫瘤發(fā)生［11］。近年來研究［12］發(fā)現(xiàn)：多種抑制DNMT1活性的胞苷類似物，能降低和消除DNMT1表達(dá)，可有效地誘導(dǎo)并穩(wěn)定p16等抑癌基因的表達(dá)，發(fā)揮治療腫瘤的作用。除此之外也有研究［13］提示：胃癌組織中過度表達(dá) miR 200b和miR 200c，可以直接靶向作用于SP1（DNMT1的反式激活因子）、DNMT3a和DNMT3b基因，使 DNMT1、DNMT3a 和DNMT3b的表達(dá)水平明顯降低，引起抑癌基因p16、RASS1A1 和E－cadherin的再表達(dá)。因此DNMT1低表達(dá)可以使被沉默的抑癌基因表達(dá)恢復(fù)，有可能延緩腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。rs2228611位點(diǎn)位于DNMT1基因第17外顯子 （NCBI RNA序列號NM＿001379.2）上，雖然G到A的變異為同義突變 （CCG→CCA，脯氨酸→脯氨酸），但是SNP 功能預(yù)測工具 SNPinfo［14］和 F－SNP［15］顯示：G到A的變異可以降低外顯子剪切增強(qiáng)子SF2／ASF和SRp55與靶序列的結(jié)合，降低DNMT1正常剪切本的水平從而降低DNMT1蛋白的表達(dá)。

表2 不同DNMT1SNPs基因型胃癌患者的預(yù)后Tab.2 Prognosis of gastric cancer patients with different DNMT1SNPs genotypes

表3 與胃癌患者預(yù)后有關(guān)聯(lián)的影響因素Tab.3 Influencing factors related to prognosis of patients with gastric cancer

Adrianna等［16］研究發(fā)現(xiàn)：在rs2228611位點(diǎn)攜帶AA／AG基因型的波蘭女性中，卵巢癌發(fā)病風(fēng)險下降；另外，Ye等［17］研究發(fā)現(xiàn)：rs8101866攜帶T等位基因的人群乳腺癌發(fā)病風(fēng)險下降，由于rs8101866和rs2228611有完全的連鎖不平衡（D’＝1，r2＝1），表明rs2228611攜帶 A等位基因的人群乳腺癌發(fā)病風(fēng)險下降，證明A等位基因在腫瘤發(fā)生中起到了保護(hù)性作用。本研究前期易感性研究結(jié)果［18－19］雖未發(fā)現(xiàn)rs2228611位點(diǎn)基因多態(tài)性與胃癌易感性有關(guān)，但在預(yù)后研究中發(fā)現(xiàn)A等位基因具有保護(hù)意義，由此推測rs2228611位點(diǎn)G到A的變異可以通過降低DNMT1表達(dá)水平從而抑制胃癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，延長患者的生存時間。

綜上所述，DNMT1基因多態(tài)性對胃癌患者術(shù)后長期生存有影響。在rs2228611位點(diǎn)，攜帶GA／AA突變型基因是胃癌預(yù)后的保護(hù)因素，提示在中國北方漢族人群中DNMT1基因多態(tài)性可以作為預(yù)測胃癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。但DNMT1 rs2228611位點(diǎn)多態(tài)性的存在是否導(dǎo)致DNA甲基化水平的改變，進(jìn)而影響胃癌患者的預(yù)后，尚需擴(kuò)大樣本量并對不同基因型的功能開展研究進(jìn)行驗(yàn)證。

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