潘 濤，郭彩霞，金明華，劉曉梅，劉 穎，杜海英，孫志偉，4

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.西安醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，陜西 西安 710021；3.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，北京 100069；4.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生化學(xué)與毒理學(xué)系，北京 100069）

三維空間尺度中至少有一維處于納米尺度范圍的材料稱為納米材料，粒徑為1～100nm的納米顆粒、直徑為1～100nm的納米線和厚度為1～100nm的納米薄膜均是納米材料。近年來隨著納米技術(shù)的迅猛發(fā)展，工程化的納米二氧化硅材料已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活的各個領(lǐng)域，人們通過呼吸、飲食、皮膚接觸等途徑接觸到納米二氧化硅材料的機會越來越多，其生物學(xué)安全性也受到廣泛的關(guān)注［1］。目前大部分體外研究更多地關(guān)注于由納米二氧化硅所引起的細(xì)胞毒性，然而在細(xì)胞的生長增殖未受到影響、細(xì)胞未發(fā)生死亡之前，某些特定的細(xì)胞功能 （如細(xì)胞的黏附、遷移和分化等）可能已發(fā)生改變，而常規(guī)的毒理學(xué)指標(biāo)并不能有效地檢測出這些變化［2］。本實驗以人正常肝細(xì)胞株HL－7702為研究對象，探討納米二氧化硅顆粒對細(xì)胞黏附遷移的影響，旨在為更全面地評價納米二氧化硅顆粒的生物安全性，建立更完善的安全性評價體系提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 納米二氧化硅顆粒 （吉林大學(xué)化學(xué)院惠贈），RPMI－1640培養(yǎng)基 （Gibco公司，美國），胎牛血清 （天津灝洋生物公司），胰蛋白酶（DIFCO公司，美國），二甲基亞砜 （DMSO，沈陽市試劑五廠），麥?zhǔn)夏z （Matrigel，Becton Dickinson公司，美國），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。透射電子顯微鏡 （transmission electron microscope，TEM）（JEOL公司，日本），激光粒度分析儀 （Beckman Coulter公司，美國），多功能酶標(biāo)儀 （MDC公司，美國），光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 納米二氧化硅顆粒的制備 在三頸瓶中加入100mL無水乙醇、4mL氨水、2mL水和5mL正硅酸乙酯，機械攪拌下于40℃水浴中反應(yīng)12h，攪拌速度為150r·min－1；所得產(chǎn)物通過離心分離，離心轉(zhuǎn)速13000r·min－1，離心時間20min，所得粒子用超純水洗3次，并重新分散于100mL超純水中。

1.3 TEM觀察納米二氧化硅顆粒的形貌和粒徑分布 將納米二氧化硅顆粒分散于無血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中，濃度為200mg·L－1，放置24h后，采用TEM觀察顆粒的形貌和分散性，Image－Pro－Plus軟件計算平均粒徑。

1.4 納米二氧化硅顆粒在分散介質(zhì)中的粒度分布 將納米二氧化硅顆粒分別用含不同濃度血清 （0、1%、5%和10%）的RPMI－1640培養(yǎng)液稀釋，放置24h后，用動態(tài)光散射法檢測納米二氧化硅顆粒水合粒徑的大小，從而反映出納米二氧化硅顆粒在分散介質(zhì)中的粒度分布。

1.5 人正常肝細(xì)胞株HL－7702的培養(yǎng) 人正常肝細(xì)胞系HL－7702購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.6 細(xì)胞黏附實驗 用無血清RPMI－1640培養(yǎng)液配制 Matrigel（1∶8稀釋）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，10g·L－1），以50μL／孔均勻涂布于96孔板中，4℃過夜，BSA為對照基底。棄去各孔上清，加入含10g·L－1BSA的無血清培養(yǎng)液進(jìn)行封閉，50μL／孔，37℃、30min。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105mL－1接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL，并設(shè)空白對照孔（不加細(xì)胞，其他步驟與陰性對照組相同）。于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)24h后，加入分散于無血清RPMI－1640培養(yǎng)液中的納米二氧化硅顆粒，濃度分別為12.5、25.0、50.0和100.0mg·L－1，每孔2mL，對照組加無血清培養(yǎng)液2mL。培養(yǎng)24h后，溫PBS洗3次，胰酶消化收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105mL－1，接種于已包被Matrigel膠和BSA的96孔板中，每孔200μL，每組3復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)2h后洗去未黏附細(xì)胞，按MTT比色法測定各孔細(xì)胞的吸光度 （A）值，根據(jù)A值計算相對黏附率。相對黏附率 （%）＝ （實驗組A值－空白組A值）／（對照組A值－空白組A值）×100。

1.7 劃痕修復(fù)實驗 用無血清RPMI－1640培養(yǎng)液配制Matrigel（1∶8稀釋），1mL／孔均勻涂布于6孔板中，4℃過夜。吸出殘液，每孔加入1mL含10g·L－1BSA的無血清培養(yǎng)液進(jìn)行封閉，37℃、30min。取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于已包被Matrigel的6孔板中，每孔2mL，每組3復(fù)孔，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞基本融合，用200μL滅菌吸頭在孔內(nèi)劃痕，選取拍照點，做好標(biāo)記，光鏡下拍照，測量出劃痕寬度作為0時的細(xì)胞劃痕寬度。棄掉培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，加入分散于無血清RPMI－1640培養(yǎng)液中的納米二氧化硅 顆 粒， 濃 度 分 別 為 12.5、25.0 和50.0mg·L－1，對照組加入無血清 RPMI－1640培養(yǎng)液，每孔2mL，培養(yǎng)24h后，在劃痕標(biāo)記點處再次拍照，測量出劃痕寬度作為24h的細(xì)胞劃痕寬度。各標(biāo)記點24h劃痕寬度減去0時劃痕寬度記為24h內(nèi)細(xì)胞的遷移距離。損傷修復(fù)率 （%）＝遷移距離／0時細(xì)胞劃痕寬度×100。

1.8 TEM觀察細(xì)胞對納米二氧化硅顆粒的攝取及顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105mL－1接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2mL。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24h后，加入含濃度為25.0mg·L－1納米二氧化硅顆粒的無血清RPMI－1640培養(yǎng)液，每孔2mL，對照組加無血清培養(yǎng)液2mL。培養(yǎng)24h后，溫PBS洗3次，胰酶消化細(xì)胞，1000r·min－1離心10min，棄上清。細(xì)胞用含有2.5%戊二醛和4%多聚甲醛的0.1mol·L－1PBS固定3h，PBS洗后，放入2%瓊脂糖凝膠中，4%鋨酸后固定1h，蒸餾水洗后，以醋酸雙氧鈾染色1h，梯度乙醇 （體積分?jǐn)?shù)分別為30%、60%、70%、90%和100%）脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制作超薄切片，并以5%醋酸雙氧鈾和2%枸櫞酸鉛雙重染色后，TEM觀察。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組細(xì)胞相對黏附率和損傷修復(fù)率以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 納米二氧化硅顆粒的形貌 TEM結(jié)果顯示：納米二氧化硅呈圓形，顆粒大小均勻一致，分散性良好。應(yīng)用Image Pro－Plus軟件計算顆粒平均粒徑為 （67.42±5.69）nm，屬于納米級顆粒。見圖1。

圖1 納米二氧化硅顆粒的透射電鏡圖像（×50000）Fig.1 TEM image of SiO2nanoparticles（×50000）

2.2 納米二氧化硅顆粒在含不同濃度血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中的粒徑 應(yīng)用動態(tài)光散射法檢測納米二氧化硅顆粒在含不同濃度血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中的粒度分布，結(jié)果顯示：納米二氧化硅顆粒在無血清RPMI－1640培養(yǎng)液中水合粒徑為 （134.13±2.78）nm，而在含1%、5%和10%血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中的水合粒徑明顯增大，分別為 （188.87±2.84）、 （170.23±2.00）和 （177.03±1.19）nm。

2.3 各組HL－7702細(xì)胞相對黏附率 經(jīng)納米二氧化硅顆粒作用24h后，隨著作用濃度的增加，納米顆粒對細(xì)胞黏附能力的抑制程度增強，呈一定的濃度依賴效應(yīng)。當(dāng) HL－7702細(xì)胞暴露于濃度為12.5mg·L－1的納米二氧化硅顆粒時，細(xì)胞的相對黏附率輕微下調(diào)，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），當(dāng)納米二氧化硅濃度上升至25.0、50.0和100.0mg·L－1時，相對黏附率分別下降至78.04%、70.66%和62.30%，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。見表1。

表1 納米二氧化硅顆粒作用24h后各組HL－7702細(xì)胞相對黏附率和損傷修復(fù)率Tab.1 Adhesion rates and healing rates of HL－7702cells after treated with SiO2nanoparticles for 24hin various groups （n＝3，，η／%）

表1 納米二氧化硅顆粒作用24h后各組HL－7702細(xì)胞相對黏附率和損傷修復(fù)率Tab.1 Adhesion rates and healing rates of HL－7702cells after treated with SiO2nanoparticles for 24hin various groups （n＝3，，η／%）

＊ P＜0.05 vs control group.

Group Adhesion rate Healingrate Control 100.00±13.58 49.55±6.73 SiO2nanoparticles（mg·L－1）12.5 97.18±8.73 47.81±6.5425.0 78.04±2.39＊ 34.25±4.47＊50.0 70.66±5.34＊ 23.03±4.27＊100.0 62.30±2.94＊ —

2.4 各組HL－7702細(xì)胞損傷修復(fù)率 采用劃痕修復(fù)實驗檢測納米二氧化硅顆粒對細(xì)胞遷移能力的影響，因在100mg·L－1的作用劑量下，細(xì)胞單層破壞嚴(yán)重，劃痕邊緣已分辨不清，故本實驗只選擇12.5、25.0 和 50.0mg·L－13 個 染 毒 組。當(dāng)HL－7702細(xì)胞暴露于納米二氧化硅顆粒時，細(xì)胞的遷移能力可被抑制，并且隨著作用濃度的增加，納米顆粒對細(xì)胞遷移能力的抑制程度增強，呈濃度依賴效應(yīng)。12.5mg·L－1納米二氧化硅顆粒暴露組HL－7702細(xì)胞的損傷修復(fù)率稍有下降，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。25.0和50.0mg·L－1納米二氧化硅顆粒暴露組 HL－7702細(xì)胞的遷移能力明顯下降，損傷修復(fù)率分別下降至34.25%和23.03%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。見表1。

2.5 HL－7702細(xì)胞對納米二氧化硅顆粒的攝取及顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布 TEM結(jié)果顯示：對照組細(xì)胞呈橢圓形，表面布滿了許多微絨毛；細(xì)胞核較大，呈橢圓形，核仁一個，較大明顯；細(xì)胞質(zhì)里可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，糖原顆粒等 （圖2A）。24h后，25.0mg·L－1納米二氧化硅顆粒暴露組 HL－7702細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯的損傷性改變，但大量的納米顆粒已經(jīng)被細(xì)胞攝取 （圖2B）；可見細(xì)胞膜凹陷，包裹吞噬納米顆粒的過程 （箭頭處）（圖2C）；顆粒以成簇的形式分布于內(nèi)吞小泡中 （箭頭處）；亦可見顆粒散在分布于胞質(zhì)中，周圍無膜結(jié)構(gòu)包被（箭頭處）（圖2D）。

圖2 TEM觀察HL－7702細(xì)胞對納米二氧化硅顆粒的攝取及顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布Fig.2 Cellular uptake of SiO2nanoparticles in HL－7702cells and its distribution in cells observed with TEM

3 討 論

顆粒物可通過調(diào)理作用被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)如肝臟和脾臟攝取。有研究［3］證實：納米二氧化硅顆粒易于在肝臟蓄積并引起病理性改變。本研究以人正常肝細(xì)胞株HL－7702為受試物，探究納米二氧化硅顆粒對其黏附和遷移能力的影響。

納米顆粒的粒徑、形貌和分散性等特征對其生物學(xué)效應(yīng)及毒性有很大影響［4］，因此納米顆粒的表征是評價其生物學(xué)效應(yīng)及毒性的重要參數(shù)［5］。本研究首先應(yīng)用TEM和DLS對納米二氧化硅顆粒進(jìn)行表征，TEM結(jié)果顯示：顆粒呈圓形，大小均一，分散性良好，其平均粒徑為67.42nm，屬納米級顆粒；DLS結(jié)果顯示：在含有不同濃度血清的培養(yǎng)液中，納米顆粒的水合粒徑均比在無血清培養(yǎng)液中的大，結(jié)果表明血清對于納米顆粒的水合粒徑有較大影響。為了避免血清對納米二氧化硅粒徑的影響，本研究選擇分散于無血清RPMI－1640培養(yǎng)液中的納米二氧化硅顆粒作為受試物。

細(xì)胞的黏附和遷移是動物細(xì)胞的基本的生命活動。細(xì)胞黏附通過一系列相關(guān)黏附分子的精密配合而完成，在細(xì)胞的存活、生長增殖、分化、組織的形成中均扮演重要角色［6］。細(xì)胞遷移也參與一系列生理和病理過程，在胚胎發(fā)育、傷口愈合、血管的再生和重塑及組織的形成等眾多生理過程中起關(guān)鍵作用，在炎癥反應(yīng)和腫瘤轉(zhuǎn)移等病理過程中也扮演重要角色［7］。有學(xué)者［2］認(rèn)為：納米顆粒能夠通過不同的途徑進(jìn)入細(xì)胞或停留在細(xì)胞外基質(zhì)中，除影響細(xì)胞的存活外，還可能會造成細(xì)胞的黏附遷移、分化等生理功能的改變，而這些細(xì)胞功能的改變卻不能通過經(jīng)典常用的毒理學(xué)方法 （例如MTT和LDH活力實驗）來檢測。本研究采用細(xì)胞黏附實驗和劃痕修復(fù)對細(xì)胞的黏附遷移進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明：當(dāng)HL－7702細(xì)胞暴露于納米二氧化硅顆粒時，顆粒能夠?qū)?xì)胞的黏附遷移產(chǎn)生抑制作用，并且隨著作用濃度的增加，納米顆粒對細(xì)胞黏附遷移能力的抑制程度增強，呈一定的濃度依賴效應(yīng)。值得注意的是，根據(jù)本組前期的研究結(jié)果［8］，納米二氧化硅顆粒在25mg·L－1的作用劑量下并不能對HL－7702細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，但在此劑量下卻能明顯抑制HL－7702細(xì)胞的黏附和遷移能力，結(jié)果表明：納米二氧化硅顆粒對細(xì)胞黏附和遷移造成的影響發(fā)生在細(xì)胞存活受抑制、細(xì)胞膜受損之前。

為了避免因細(xì)胞膜損傷而致使納米二氧化硅顆粒被動地進(jìn)入細(xì)胞，本研究選用無毒劑量（25.0mg·L－1）來觀察細(xì)胞對納米二氧化硅顆粒的攝取及顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布，TEM結(jié)果表明：在25.0mg·L－1作用劑量下，細(xì)胞已能大量攝取納米二氧化硅顆粒，顆粒主要已呈簇的方式蓄積于內(nèi)吞泡中，同時細(xì)胞膜凹陷、包裹吞噬納米顆粒的過程可被捕捉到，而散在分布、周圍無膜包被的顆?？赡苡捎趦?nèi)吞泡破裂進(jìn)而釋放到胞質(zhì)中［9］。研究［10］表明：細(xì)胞攝取納米顆粒最常見的方式是通過細(xì)胞內(nèi)吞，此過程包括細(xì)胞膜凹陷，進(jìn)而包裹吞噬納米顆粒。由此推測本研究中HL－7702細(xì)胞也是通過內(nèi)吞的方式攝取納米二氧化硅顆粒。細(xì)胞骨架系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)吞過程中起重要作用，內(nèi)吞的發(fā)生需要肌動蛋白細(xì)胞骨架的重組，在細(xì)胞通過內(nèi)吞方式大量攝取納米顆粒的過程中，細(xì)胞骨架可能會受到損傷而導(dǎo)致骨架結(jié)構(gòu)紊亂［11］，而細(xì)胞骨架系統(tǒng)與細(xì)胞黏附和遷移有密切關(guān)系。在本研究中，當(dāng)無毒劑量 （25mg·L－1）的納米二氧化硅顆粒作用于細(xì)胞時，細(xì)胞的存活沒有受到影響、細(xì)胞膜未發(fā)生明顯的損傷［8］，然而大量的顆粒卻已進(jìn)入細(xì)胞并且對細(xì)胞的黏附和遷移均產(chǎn)生了影響，其原因可能是當(dāng)HL－7702細(xì)胞通過內(nèi)吞方式大量攝取納米二氧化硅顆粒時，細(xì)胞骨架發(fā)生了損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞黏附和遷移能力下調(diào)。也有研究者［2］認(rèn)為：納米二氧化硅顆粒可能通過影響FAK信號通路，抑制Src、PI3K和AKT激酶活性，從而抑制細(xì)胞的黏附和遷移，具體的作用機制還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，納米二氧化硅顆粒能夠抑制HL－7702細(xì)胞的黏附和遷移能力，并呈一定的濃度依賴效應(yīng)。本研究為進(jìn)一步探討納米二氧化硅顆粒的毒性提供了實驗基礎(chǔ)，為納米材料的安全性評價提供了新思路。

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