孫亞楠，毛曉韻，劉 崇，陳 浩，郭 揚(yáng)，金 鋒

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科教研室 普外綜合／燒傷科，遼寧 沈陽 110001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科教研室 乳腺外科，遼寧 沈陽 110001）

乳腺癌的生物學(xué)特征中，以侵襲性和轉(zhuǎn)移性最為突出。1994年Toh等［1］在篩選乳腺癌細(xì)胞系時發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（metastasis－associated gene 1，MTΑ1）。有學(xué)者［2］證實：MTA1為組蛋白去乙?；瘡?fù)合物 （nucleosome remodeling and histone deacetylation，NURD）的亞單位，是一種DNA損傷應(yīng)激反應(yīng)蛋白，在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色。雌激素受體α（estrogen receptor－alpha，ERα）作為類固醇激素受體，其啟動子CpG島甲基化與ERα蛋白失表達(dá)有關(guān)，往往提示腫瘤預(yù)后不良［3］。本課題組前期研究［4］顯示：散發(fā)性乳腺癌中ERα啟動子甲基化與MTΑ1陽性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，二者在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中可能存在重要作用，但二者在乳腺癌細(xì)胞系中是否也存在相關(guān)性，是否相互調(diào)控，目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。本研究采用改變?nèi)橄侔┘?xì)胞系ERα啟動子甲基化狀態(tài)的方法觀察其對MTΑ1基因表達(dá)的影響，闡明ERα啟動子去甲基化后可以下調(diào)MTΑ1基因的表達(dá)，為研究二者在乳腺癌中的調(diào)控關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 人乳腺癌細(xì)胞系 MDΑMB－435s、 MD?。璏B－231、 SK－BR－3、 T47D 和MCF－7均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。去甲基化藥物5－aza－2′－deoxycytidine（5－Αza－dC）（Α3536，美國Sigma公司），RPMI－1640培養(yǎng)基 （美國Invitrogen公司），胎牛血清 （美國Hyclone公司），MTT和DMSO （美國Promega公司）。

1.2 方 法 人乳腺癌細(xì)胞系MD?。璏B－435s、MD?。璏B－231、SK－BR－3、T47D和 MCF－7均培養(yǎng)于RPMI－1640培養(yǎng)基中，血清體積分?jǐn)?shù)均為10%。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。用甲基化特異性PCR （MSP）法篩選乳腺癌細(xì)胞系MD?。璏B－435s、 MDΑ－MB－231、SK－BR－3、T47D和 MCF－7的 ERα啟動子1、3、4、5的甲基化情況。選取ER1、ER4高甲基化狀態(tài)的人乳腺癌細(xì)胞系 MD?。璏B－435s和ER3低甲基化MDΑ－MB－231作為本實驗所用細(xì)胞系。選取對數(shù)生長期的人乳腺癌細(xì)胞系 MD?。璏B－435s和MDΑ－MB－231，接種于96孔培養(yǎng)板待其貼壁后，分為對照組和不同濃度5－Αza－dC處理組（5－Αza－dC終濃度分別為1、2、5、10、20 和40μmol·L－1），每組設(shè)6個復(fù)孔，對照組加入等量無5－Αza－dC的1640培養(yǎng)液。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)72h后每孔加入20μL（5g·L－1）的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄上清加入DMSO （180μL／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10min，使結(jié)晶物溶解，用酶標(biāo)儀測定490nm處各孔的吸光度 （A）值，以不加任何細(xì)胞的空白對照孔調(diào)零，實驗重復(fù)3次，選取5μmol·L－1為 5－Αza－dC作用濃度。用濃度為5μmol·L－1的5－Αza－dC處理不同甲基化狀態(tài)的乳腺癌細(xì)胞系，RT－PCR檢測5－Αza－dC處理前后乳腺癌細(xì)胞系 MTΑ1mRNΑ表達(dá)情況，Western blotting法檢測5－Αza－dC處理后細(xì)胞系 MTΑ1蛋白表達(dá)的變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。各組乳腺癌細(xì)胞中MTΑ1mRNΑ和蛋白表達(dá)水平均以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組乳腺癌細(xì)胞系中ERα啟動子1、3、4和5甲基化情況 5－Aza－dC去甲基化處理前后MD?。璏B－435s和 MDΑ－MB－231乳腺癌細(xì)胞系ERα啟動子甲基化狀態(tài)見圖1。MSP結(jié)果顯示：5－Aza－dC去甲基化處理逆轉(zhuǎn)了ER1、ER4高甲基化狀態(tài)的人乳腺癌細(xì)胞系 MD?。璏B－435s和ER3低甲基化狀態(tài)的MDΑ－MB－231細(xì)胞系ERα啟動子甲基化。

圖1 5－Aza－dC去甲基化處理后 MD?。璏B－435s和 MDΑMB－231細(xì)胞系ERα啟動子甲基化狀態(tài)Fig.1 Methylation status of ERαpromoter in MDΑ－MB－435sand MD?。璏B－231cell lines after demethylation

2.2 各組乳腺癌細(xì)胞系中MTΑ1mRNA表達(dá)水平 RT－PCR 檢測結(jié)果顯示：MDΑ－MB－435s和MD?。璏B－231 細(xì)胞系中5－Aza－dC 處理組MTΑ1mRNΑ表達(dá)水平均低于對照組 （P＜0.05）。見圖2和表1。

圖2 MD?。璏B－435s和 MD?。璏B－231細(xì)胞中MTΑ1 mRNA表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of MTA1mRNA expressions in MDΑ－MB－435sand MD?。璏B－231cells

表1 MDA－MB－435s和 MDA－MB－231細(xì)胞中 MTA1mRNA和蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of MTA1mRNA and protein in MDA－MB－435sand MDA－MB－231cells（n＝3，）

表1 MDA－MB－435s和 MDA－MB－231細(xì)胞中 MTA1mRNA和蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of MTA1mRNA and protein in MDA－MB－435sand MDA－MB－231cells（n＝3，）

＊ P＜0.05compared with control group.

Group MTA1 mRNA Protein IVD mRNA Protein MDA－MB－235s Control 31.27±10.41 38.29±14.21 0.83±0.28 1.50±0.505－Aza－dC treated 16.89±5.63＊ 33.71±12.02＊ 0.55±0.18＊ 1.09±0.38 MDA－MB－231 Control 25.18±8.40 36.41±13.27 0.72±0.24 1.37±0.465－Aza－dC treated 13.23±4.41＊ 29.71±7.83＊ 0.42±0.14 0.79±0.26＊

2.3 各組乳腺癌細(xì)胞系中MTΑ1蛋白表達(dá)情況Western blotting法檢測結(jié)果顯示：MD?。璏B－435s和 MDΑ－MB－231細(xì)胞系5－Aza－dC 處理組 MTΑ1蛋白表達(dá)水平均低于對照組 （P＜0.05）。見圖3和表1。

3 討 論

本課題組在前期工作中采用免疫組織化學(xué)法檢測了102例女性散發(fā)性乳腺癌組織及癌旁組織中MTA1蛋白的表達(dá)、MSP方法檢測上述癌組織中ERα基因啟動子區(qū)4個CpG島密集區(qū)域 （ER1、ER3、ER4和ER5）甲基化水平，結(jié)果顯示：乳腺癌組織中ERα啟動子甲基化與MTΑ1陽性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，提示二者在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中可能起重要作用，但二者在乳腺癌細(xì)胞系中是否

圖3 MD?。璏B－435s和 MDΑ－MB－231細(xì)胞中 MTΑ1蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of MTA1protein expressions in MD?。璏B－435sand MD?。璏B－231cells

也存在調(diào)控機(jī)制尚不明確。為驗證該觀點，本研究采用去甲基化藥物5－Αza－dC處理ERα啟動子高甲基化狀態(tài)的 MDΑ－MB－435s和低甲基化狀態(tài)的MD?。璏B－231乳腺癌細(xì)胞系，將2組細(xì)胞系又分為5－Αza－dC處理組及未處理的對照組，MSP檢測ERα啟動子甲基化狀態(tài)，Western blotting和RT－PCR法檢測去甲基化對 MTΑ1mRNA及蛋白表達(dá)狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示：5－Aza－dC去甲基化處理逆轉(zhuǎn)了ER1、ER4高甲基化狀態(tài)的人乳腺癌細(xì) 胞 系 MDΑ－MB－435s、ER3 低 甲 基 化 狀 態(tài) 的MD?。璏B－231細(xì)胞系ERα啟動子的甲基化狀態(tài)，2組細(xì)胞系中5－Aza－dC處理組MTΑ1mRNΑ及蛋白表達(dá)水平均低于對照組，說明ERα啟動子去甲基化后可以下調(diào)MTΑ1基因的表達(dá)，驗證了在乳腺癌細(xì)胞系中，ERα基因啟動子甲基化狀態(tài)對MTΑ1基因表達(dá)的調(diào)控作用。Toh等［5－6］研究發(fā)現(xiàn)：在肝癌及食管鱗癌患者中，MTΑ1過表達(dá)者癌腫浸潤更深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高，提示 MTΑ1高表達(dá)可能使癌細(xì)胞更具惡性表型，增強(qiáng)了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力。國內(nèi)學(xué)者林川等［7］對原發(fā)性肝癌及癌旁組織中 MTΑ1mRNΑ表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MTΑ1在癌旁正常組織內(nèi)僅微弱表達(dá)，而在肝癌組織中呈陽性表達(dá)，尤其在肝外轉(zhuǎn)移、癌腫直徑＞5cm、術(shù)后1年內(nèi)死亡患者的癌組織中表達(dá)量顯著增高，表明MTΑ1基因不僅與癌細(xì)胞的惡性表型有關(guān)，還可能與患者的預(yù)后有關(guān)。劉運(yùn)賢等［8］對117例肺癌組織MTΑ1表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：肺癌組織中 MTΑ1陽性表達(dá)2l例 （21／117），這21例肺癌MTΑ1陽性表達(dá)者隨訪為19例，均在2年內(nèi)死亡，說明MTΑ1的表達(dá)與肺癌組織的分化程度及是否有浸潤或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有較明顯的關(guān)系，即分化程度差、侵襲能力強(qiáng)。本課題組在前期實驗中也發(fā)現(xiàn) MTΑ1表達(dá)與乳腺腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，這一結(jié)論與上述觀點較吻合。

研究［9］表明：NuRD是包含 MTΑ1蛋白在內(nèi)的多亞單位復(fù)合物，主要參與染色質(zhì)重構(gòu)。MTΑ1蛋白與NuRD復(fù)合物中的組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDΑC） 結(jié) 合 后， 聚 集HDΑC至靶基因啟動子區(qū)域，重塑染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，使其變得緊密而不利于轉(zhuǎn)錄［10－12］。MTΑ1可直接與乳腺癌細(xì)胞中ERα的ΑF2區(qū)結(jié)合，募集HDΑC于ERα啟動子附近，使組蛋白去乙酰化增加，下調(diào)ERα轉(zhuǎn)錄水平，使ER陽性的乳腺癌細(xì)胞發(fā)展成更具侵襲能力的惡性表型［13－14］，提示ERα介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄受到MTΑ1／NuRD復(fù)合體的核內(nèi)調(diào)節(jié)。乳腺癌患者中，ERα表達(dá)狀況作為內(nèi)分泌治療療效和預(yù)后評價的一個重要生物學(xué)指標(biāo)已取得普遍共識，ERα基因啟動子甲基化是ERα失表達(dá)的機(jī)制之一，其失表達(dá)往往是腫瘤向惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，Mirza等［15］報道：印度女性浸潤性導(dǎo)管癌中檢測到ERα基因啟動因子甲基化頻率為66% （33／50），Nass等［16］報道：在美國乳腺癌患者中ERα啟動因子甲基化為49% （54／111），本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中ERα基因啟動子甲基化發(fā)生率為37.3% （38／102），與上述結(jié)果較一致。本實驗中，采用去甲基化藥物5－Aza－dC處理ERα啟動子甲基化不同狀態(tài)的乳腺癌細(xì)胞系，證實5－Aza－dC處理可以使乳腺癌細(xì)胞系 MDΑ－MB－435s和MD?。璏B－231ERα啟動子去甲基化，進(jìn)一步用Western－blotting和RT－PCR法觀察ERα啟動子去甲基化后對乳腺癌細(xì)胞系MTΑ1mRNA和蛋白表達(dá)狀態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)MTΑ1mRNΑ和蛋白表達(dá)均下降。有研究［17－19］顯示：ERα去甲基化后其重新表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞凋亡或進(jìn)一步分化，并降低其DNΑ損傷修復(fù)能力、轉(zhuǎn)移能力和化療耐受?？赡墚?dāng)乳腺癌細(xì)胞系ERα啟動子去甲基化后，HDΑC下調(diào)，導(dǎo)致與HDΑC密切相關(guān)的 MTΑ1表達(dá)下調(diào)；或者ERα去甲基化后導(dǎo)致ERα重新表達(dá)通過其他通路導(dǎo)致MTΑ1的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而降低癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力。本文作者認(rèn)為：ERα啟動子去甲基化后可以下調(diào)MTΑ1基因的表達(dá)，本研究結(jié)果為乳腺癌臨床治療及改善預(yù)后提供新的靶點和思路。

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