崔順艷,李丹,劉玉升,王洪慶,盛志,李旭,李秀穎,陳凱*

1.沈陽化工研究院有限公司生物技術(shù)研究室,遼寧沈陽110021

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,山東泰安271018

一種昆蟲源提取物的生物活性測定

崔順艷1,李丹1,劉玉升2,王洪慶1,盛志1,李旭1,李秀穎1,陳凱1*

1.沈陽化工研究院有限公司生物技術(shù)研究室,遼寧沈陽110021

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,山東泰安271018

以微波干燥的黃粉蟲為原料，采用索氏抽提法和柱層析法對黃粉蟲粉末提取，并測定了提取物對小麥白粉病和玉米銹病的防治效果。利用紅外法初步鑒定了提取物中抗菌物質(zhì)的有效成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃粉蟲的甲醇提取物對小麥白粉病和玉米銹病的防治效果分別為60%和65%。

生物農(nóng)藥;昆蟲源提取物;黃粉蟲;小麥白粉病;玉米銹病

傳統(tǒng)高毒、高殘留、環(huán)境危害大的農(nóng)藥已經(jīng)越來越不適用于農(nóng)業(yè)生態(tài)文明建設(shè)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要，生物農(nóng)藥相對于化學(xué)農(nóng)藥來說一般具有綠色環(huán)境友好、低殘留和不易產(chǎn)生抗藥性等特性，因此近年來一直是國際國內(nèi)的研究熱點(diǎn)[1,2,3]。生物農(nóng)藥主要來源包括從植物中的提取物、微生物活體和微生物代謝產(chǎn)物、動(dòng)物中提取的毒素和昆蟲的信息素農(nóng)藥（即性信息素和激素）[4]。昆蟲是地球上數(shù)量最多的動(dòng)物群體，已發(fā)現(xiàn)超過100萬種，其中單鞘翅目中所含的總數(shù)就比其它所有動(dòng)物界中的總數(shù)還多。如此數(shù)量巨大的昆蟲，蘊(yùn)藏著巨大的資源有待于開發(fā)利用。昆蟲可以生存在異常惡劣環(huán)境條件中的原因是，其體內(nèi)具有一定量的抗菌物質(zhì)，可以高效地殺死或抑制病源微生物[5,6]。在醫(yī)藥領(lǐng)域昆蟲源抗菌物質(zhì)具有一定研究，但是由于其來源有限并且提純過程較為復(fù)雜昂貴，目前在農(nóng)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究極少。

近年來一些昆蟲如黃粉蟲被應(yīng)用于處理規(guī)模化養(yǎng)殖帶來的禽畜糞便以及餐廚尾菜所帶來的環(huán)境污染問題，并且取得了很好的處理效果[6,7]。黃粉蟲因其養(yǎng)殖投資少、技術(shù)簡單易學(xué)等特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛工廠化養(yǎng)殖，被昆蟲專家稱為是繼家蠶和蜜蜂之后的第三大昆蟲產(chǎn)業(yè)。黃粉蟲又叫面包蟲，在昆蟲分類學(xué)上隸屬于鞘翅目，擬步行蟲科，粉甲蟲屬（擬步行蟲屬）。原產(chǎn)于北美洲，50年代從蘇聯(lián)引進(jìn)我國飼養(yǎng)，黃粉蟲干品含脂肪30%，含蛋白質(zhì)高達(dá)50%以上，并含有多種常規(guī)和微量元素[8-10]。本文探討了不同方式提取的黃粉蟲提取物對小麥白粉病和玉米銹病的防治效果，為這2種病害的防治提供了一些數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試黃粉蟲

黃粉蟲由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。在凍干機(jī)（型號）凍干以后于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試菌株

小麥白粉病原菌和玉米銹病病原菌由沈陽化工研究院有限公司生測室提供。

1.3 供試儀器

紅外光譜儀：布魯克ALPHA；索氏提取器；柱層析硅膠100～140目,產(chǎn)自青島海洋化工廠分廠，其余所有化學(xué)試劑均為市售分析純試劑。

1.4 黃粉蟲的提取和分離

1.4.1 黃粉蟲的粉碎取經(jīng)過干燥后黃粉蟲幼蟲于研缽中，加入適量液氮對其進(jìn)行急速冷卻，然后將黃粉蟲幼蟲干研碎。

1.4.2 乙醇索氏提取黃粉蟲稱取60.0 g黃粉蟲粉末，加入300 mL乙醇使用索氏提取器回流提取5 h，將上述溶液進(jìn)行減壓蒸餾濃縮，濃縮至溶液呈粘稠狀棕褐色液體，經(jīng)過常溫?fù)]發(fā)得到19.79 g提取物。

1.4.3 柱層析稱取5.0 g步驟1.4.2中的提取物加入約20 mL甲醇進(jìn)行溶解后拌入適量硅膠，常溫?fù)]干后裝柱。依次分別使用200 mL石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇和水進(jìn)行洗脫分離，收集得到分段分離物。其中石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮餾分中分離出物質(zhì)量極少，不足以進(jìn)行殺菌活性后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 活體試驗(yàn)方法

1.5.1 對小麥白粉病的活性測定準(zhǔn)備一定濃度的黃粉蟲提取物母液，按一定比例稀釋，稀釋液備用。選擇生長整齊一致的盆栽小麥幼苗（1葉1心期），按試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度進(jìn)行噴霧處理，另噴施清水作對照，盆栽幼苗經(jīng)藥劑處理后自然晾干。24 h后接種小麥白粉病病菌孢子，移至溫室中正常管理（溫室條件：溫度22～30℃，濕度40～60%），7 d后調(diào)查防效。

1.5.2 對玉米銹病的活性測定準(zhǔn)備一定濃度的黃粉蟲提取物母液，按一定比例稀釋，稀釋液備用。選擇生長整齊一致的盆栽三葉期玉米幼苗，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度進(jìn)行噴霧處理，另噴施清水作對照，盆栽幼苗經(jīng)藥劑處理后自然晾干。24 h后接種玉米銹病病菌孢子懸浮液，置于人工氣候室保濕處理8 h，移至溫室中正常管理（溫室條件：溫度22～30℃，濕度40～60%），7 d后調(diào)查防效。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 紅外試驗(yàn)結(jié)果

對1.4.3各柱層析分離物，進(jìn)行紅外吸收光譜測試，IR結(jié)果如下：

1）二氯甲烷洗脫份IR數(shù)據(jù)：2920 cm-1、2850 cm-1、1462 cm-1、1376 cm-1、719 cm-1，結(jié)構(gòu)鑒定為蠟質(zhì)油；

2）乙酸乙酯、丙酮、乙醇洗脫份IR數(shù)據(jù)基本相同：3007 cm-1、2925 cm-1、2854 cm-1、1746 cm-1、1656 cm-1、1238 cm-1、1163 cm-1、1099 cm-1、722 cm-1，結(jié)構(gòu)鑒定為不飽和脂肪（三脂肪酸甘油酯）；

3）甲醇洗脫份（軟蠟狀半固體）IR：3356 cm-1、2923 cm-1、2853 cm-1、1645 cm-1、1516 cm-1、1464 cm-1、1376 cm-1、1231 cm-1、1102 cm-1、1074 cm-1、1031 cm-1、993 cm-1、720 cm-1cm-1，主要顯示為多糖及蛋白質(zhì)譜帶的特征吸收峰。

2.2 活體試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 黃粉蟲提取物對小麥白粉病的防治效果不同方法提取的黃粉蟲提取物對小麥白粉病的防治效果見表1。

表1 黃粉蟲提取物對小麥白粉病的防治效果Table 1 The control effect of the yellow mealworm extracts against wheat powdery mildew

試驗(yàn)結(jié)果表明：研磨后的黃粉蟲用乙醇使用索氏提取器回流提取后，分別利用甲醇（黃乙-甲醇）、乙醇（黃乙-乙醇）分離的提取物在15倍、30倍、60倍、90倍、270倍稀釋的條件下，對小麥白粉病的防治效果存在差異較大。其中利用甲醇分離的提取物對小麥白粉病有較好的防治效果。在15倍稀釋的條件下，防治效果可高達(dá)60%，且在60倍稀釋的情況下防治效果也可達(dá)到50%。利用乙醇分離的提取物在15倍稀釋的情況下對小麥白粉病僅有35%左右的防治效果，當(dāng)稀釋到90倍時(shí)，幾乎沒有防治效果。當(dāng)稀釋到270倍時(shí)，兩種提取方式都沒有防治效果。

2.2.2 黃粉蟲提取物對玉米銹病的防治效果不同方法提取的提取物對玉米銹病的防治效果見表2。

表2 黃粉蟲提取物對玉米銹病的防效效果Table 2 The control effect of the yellow mealworm extracts against corn rust

試驗(yàn)結(jié)果表明：研磨后的黃粉蟲用乙醇使用索氏提取器回流提取后，分別利用甲醇、乙醇分離的提取物在15倍、30倍、60倍、90倍、270倍稀釋的條件下，對玉米銹病的防治效果存在些差異。其中利用甲醇分離的提取物對玉米銹病有較好的防治效果。甲醇分離的提取物在15倍稀釋的條件下，防治效果可達(dá)到65%。在90倍稀釋的情況下防治效果在30%左右。利用乙醇分離的提取物在15倍、30倍稀釋的情況下對玉米銹病的防治效果分別為50%和40%。在90倍稀釋的情況下為10%左右。當(dāng)稀釋到270倍時(shí)，兩種提取方式都沒有防治效果。

3 討論

本文選用了世界性的病害，小麥白粉病和玉米銹?。ù藘煞N病害在各主要產(chǎn)小麥和玉米國均有分布）來測定黃粉蟲的提取物對這兩種常見病原菌的抑制效果。結(jié)果表明:黃粉蟲經(jīng)乙醇索氏提取后，再用柱層析分離,其中甲醇提取物對小麥白粉病和玉米銹病均有較好的防治效果。在15倍稀釋的條件下，小麥白粉病和玉米銹病的防治效果可達(dá)到60%和65%。

目前，化學(xué)殺菌劑通常被認(rèn)為是最便宜且能有效控制小麥白粉病和玉米銹病的主要手段。但化學(xué)殺菌劑長期和大量使用，存在有損人類健康和環(huán)境污染等方面的問題，因此尋找一種安全有效、無公害的生物性殺菌劑是生產(chǎn)綠色食品和控制環(huán)境污染的需要。研究結(jié)果顯示黃粉蟲脂類抗菌物質(zhì)對小麥白粉病和玉米銹病有較好的防治效果，可考慮將其替代化學(xué)殺菌劑用于小麥白粉病和玉米銹病病害的生物防治。

本研究僅觀察了黃粉蟲體內(nèi)提取的抗菌物質(zhì)對小麥白粉病和玉米銹病的防治效果，對其它病害是否存在防治效果，以及其抑菌機(jī)理尚待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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Bioassay on Biological Activity of the Extract from Tenebrio molitor Linnaeus

CUI Shun-yan1,LI Dan1,LIU Yu-Sheng2,WANG Hong-qing1,SHENG Zhi1,LI Xu1,LI Xiu-ying1,CHEN Kai1*
1.Biotechnology Laboratory/Shenyang Research Institute of Chemical Industry,Shenyang 110021,China
2.College of Plant Protection/Shandong Agricultural University,Taian 271018,China

This paper extracted from the dry larva of yellow mealworm dried to a powder by microwave with soxhlet extraction and column chromatography and the extract had been used to determine on wheat powdery mildew and corn rust, and preliminarily identified the antibacterial components from the exact with the infrared method.The results showed that the control effects were 60%and 65%,respectively against wheat powdery mildew and corn rust.

Bio-pesticide;insect extracts;yellow mealworm;wheat powdery mildew;corn rust

S4

A

1000-2324(2015)03-0357-03

2014-04-01

2014-04-25

崔順艷(1984-),女,遼寧撫順人,助理工程師.研究方向:生物農(nóng)藥.E-mail:cuishunyan@sinochem.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:chenkai05@sinochem.com