殷燦,劉笛,任驥,盧希平,2,喬魯芹,2*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,山東泰安271018

2.山東省林業(yè)有害生物防控工程技術(shù)研究中心,山東泰安271018

溫度對美國白蛾核型多角體病毒活性的影響

殷燦1,劉笛1,任驥1,盧希平1,2,喬魯芹1,2*

1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,山東泰安271018

2.山東省林業(yè)有害生物防控工程技術(shù)研究中心,山東泰安271018

本文研究了不同溫度、不同處理時間對美國白蛾核型多角體病毒（Hyphantria cunea nuclear polyhedrosis virus，HcNPV）水劑和干粉活性的影響，研究結(jié)果表明：隨著溫度升高和持續(xù)時間增長，HcNPV活性降低，LT50變長；病毒干粉比病毒水劑對溫度的耐受性強(qiáng)，但其LT50會顯著延長。55℃水浴處理HcNPV水劑60 min，其活性仍有67%。在水浴100℃條件下處理15 min，其致病率僅有17.41%，病毒干粉在烘箱120℃條件下處理15 min，致病率為47.91%。

美國白蛾;核型多角體;病毒活性;溫度;LT50

美國白蛾Hyphantria cunea（Drury）（又名美國燈蛾、秋幕毛蟲）是世界性檢疫害蟲。自1979年傳入我國遼寧丹東以來，對我國的園林樹木、經(jīng)濟(jì)林、農(nóng)田防護(hù)林等造成了十分嚴(yán)重的危害。近年來，各地多采用包括人工防治、物理防治、化學(xué)防治和生物防治在內(nèi)的多種措施進(jìn)行綜合治理，其中利用美國白蛾核型多角體病毒(Hyphantria cunea nuclear polyhedrosis virus,HcNPV)防治美國白蛾低齡幼蟲具有良好效果。

溫度是影響病毒活性的主要因子，不同的病毒制劑對極端溫度的耐受性不同。小菜蛾顆粒體病毒(Plutella xylostella Granulosis Virus,PxGV)經(jīng)80℃高溫處理10 min，活性迅速降低[1]；在50～60℃條件下處理30 min，病毒失活；100℃時幾秒鐘即能喪失活性[2]。將重組桿狀病毒AcMNPV-BmKIT-Chi沸煮10 min毒力明顯下降[3]。茶尺蠖核型多角體病毒（Ectropis obliqua nuclear polyhedrosis virus, EoNPV）水懸液經(jīng)80℃（水?。┗蚋啥嘟求w經(jīng)120℃（烘箱）處理15 min多角體后，均失去活性[4]。大蠟螟核型多角體病毒（Galleria mellonella nuclear polyhedrosis virus,GmMPV）在60℃條件下處理40 min或者50℃條件下處理60 min均可完全滅活[5]。棉鈴蟲核型多角體病毒（Heliothis spp.nuclear polyhedrosis virus,HsNPV）在75℃到80℃條件下處理10 min即可失活，粉紋夜蛾核型多角體病毒（Trichoplusia ni.nuclear polyhedrosis virus,TnNPV）需要在82℃到88℃條件下處理10 min才可滅活[6]。茶尺蠖核型多角體病毒懸液經(jīng)80℃（水?。┗蚋啥嘟求w經(jīng)120℃（烘箱）處理15 min多角體可失去活性[4]。

美國白蛾核型多角體病毒是防治美國白蛾的重要生物因子，已有許多學(xué)者在其形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、毒性、安全性等方面做過研究[7-10]。近年來，劉玉書、鄭桂玲等研究了該病毒的大量增殖技術(shù)[11,12]；段彥麗等對其傳播途徑進(jìn)行了研究[13]；楊唯一、劉海明等在病毒的增效方面進(jìn)行了探索[14,15]。然而，關(guān)于美國白蛾核型多角體病毒穩(wěn)定性方面的研究鮮見報道。本研究借鑒前人的研究方法和技術(shù)，在溫度對美國白蛾核型多角體病毒活性的影響方面進(jìn)行了研究，旨在為深入探索該病毒的流行機(jī)理以及病毒制劑的研發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 病毒與試蟲

病毒：由室內(nèi)人工飼養(yǎng)的美國白蛾幼蟲復(fù)制獲得。用差速離心法分離提純，雙蒸水懸浮制成水劑，顯微計數(shù)后，置于4℃冰箱內(nèi)保存。

試蟲：室內(nèi)用人工飼料連續(xù)飼養(yǎng)10代以上的美國白蛾幼蟲，飼養(yǎng)條件為溫度25℃、濕度75%、光周期L:D=14:10。

1.2 病毒多角體水劑水浴處理

將病毒水劑分裝于10 mL離心管中，水浴加熱并測量溫度。加熱處理分成兩組：一組設(shè)置30℃、40℃、60℃、80℃、100℃共5個梯度，待加熱到相應(yīng)溫度時，維持15 min后取出自然冷卻；另一組設(shè)置0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min 6個梯度，待加熱溫度達(dá)到55℃時，保持恒溫，并在相應(yīng)時間取出病毒懸液自然冷卻。所有處理過的病毒均放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒多角體干粉烘箱處理

取病毒水懸液0.3 mL滴入?6 cm培養(yǎng)皿中攤平呈薄層，自然晾干。設(shè)40℃、60℃、80℃、100℃、120℃5個梯度。調(diào)節(jié)烘箱至相應(yīng)的溫度，待溫度穩(wěn)定后，放入盛有病毒的培養(yǎng)皿，保持恒溫15 min。取出后自然冷卻至室溫，用0.3 mL蒸餾水分?jǐn)?shù)次洗出病毒多角體。置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生物測定

稀釋病毒懸浮液濃度為8.8×105PIB/mL，取病毒水懸液接到人工飼料上（每杯飼料接入150μL病毒液），自然晾干。于杯中接入健康的美國白蛾3齡幼蟲，每處理接幼蟲30頭，重復(fù)3次，各試驗(yàn)均設(shè)置蒸餾水為空白對照。觀察幼蟲每日死亡數(shù)，計算累計死亡率、矯正死亡率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用spss16.0軟件對HcNPV的生測數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和方差分析（LSD法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 55℃水浴處理HcNPV水劑對其活性的影響

HcNPV水劑經(jīng)水浴55℃處理不同時間，對其活性的影響結(jié)果（見圖1和表1）。

從圖1可以看出，處理病毒的時間對病毒感染幼蟲的死亡率有顯著影響。從處理0 min的對照組到處理150 min的各處理組，感病幼蟲死亡率從84.45%到38.49%顯著降低。但是，處理90 min，HcNPV活性仍能達(dá)到53%。

從表1看，隨著處理時間的延長，HcNPV對宿主的致死中時間（LT50）從12.18～15.81 d逐漸延長，且各處理間差異顯著，其回歸方程為y=0.02x+12.43(P＜0.01)。

圖1 55℃水浴處理的HcNPV水懸液感染的美國白蛾幼蟲的死亡率Fig.1 The mortality rate of Hyphantria cunea larva infected by HcNPV suspension treated by water bath at 55℃

值得指出的是，盡管在55℃水浴下處理HcNPV水劑30 min和60 min，其感染美國白蛾幼蟲的死亡率和LT50較對照組的分別顯著的降低和顯著的增長。但是處理30 min，HcNPV感染宿主的死亡率仍有70%以上；處理60 min的，也仍保有65%左右。并且它們的LT50僅比對照組的晚1 d。另外，盡管本研究中處理0 min的的對照也是經(jīng)歷了從室溫加熱到55℃的處理過程，但是其活性卻依然有85%以上，與未處理的HcNPV間無顯著性差異。

表1 55℃水浴處理的HcNPV水懸液感染美國白蛾幼蟲的LT50Table 1 The LT50 of Hyphantria cunea larva infected by HcNPV suspension treated by bath at 55℃

2.2 溫度對不同劑型病毒的影響

溫度對病毒活性的影響與病毒的存在狀態(tài)有關(guān)，病毒水劑較病毒干粉受溫度影響更加明顯。由圖2可見，水浴30℃處理病毒水劑15 min和烘箱40℃處理病毒干粉15 min，幼蟲死亡率很高，且無顯著性差異，說明HcNPV在此處理下仍有較高活性。隨著溫度的升高，HcNPV的活性逐漸降低，水浴100℃處理HcNPV水劑15 min，病毒基本失活。分別比較溫度40℃、60℃、80℃和100℃處理的不同狀態(tài)的病毒，可以看到經(jīng)相同溫度處理，病毒干粉感染美國白蛾幼蟲的死亡率都顯著高于病毒水劑。HcNPV水劑各處理間感病幼蟲死亡率存在顯著差異，而病毒干粉經(jīng)40℃和60℃處理后，感病幼蟲死亡率無顯著差異；經(jīng)100℃處理的病毒干粉與經(jīng)80℃處理病毒干粉相比較，其感病幼蟲死亡率未顯著降低，而與經(jīng)120℃處理的病毒干粉的活性相比較，其感病幼蟲死亡率也未表現(xiàn)顯著差異。

圖2 不同溫度處理HcNPV15 min感染美國白蛾幼蟲的死亡率Fig.2 The mortality rate of Hyphantria cunea larva infected by HcNPV treated at different temperature for 15 min

病毒水劑和病毒干粉感染宿主的LT50值均隨著處理溫度的升高而顯著提高，其回歸方程分別為：病毒水劑y=0.05x+13.10(P＜0.05)；病毒干粉y=0.03x+11.60(P＜0.01)。結(jié)合圖2和表2、3可以看出，水浴30℃處理病毒水劑15 min與烘箱40℃、60℃處理病毒干粉15 min后，感染宿主的死亡率無顯著性差異，但后者較前者的LT50卻顯著地延長了將近2 d。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在經(jīng)水浴40℃處理病毒水劑和經(jīng)烘箱80℃處理病毒干粉的比較上。

表2 不同溫度處理HcNPV水懸液病毒15 min感染美國白蛾幼蟲的LT50Table 2 The LT50of Hyphantria cunea larva infected by HcNPV suspension treated at different temperature for 15 min

表3 不同溫度處理HcNPV干粉病毒15 min感染美國白蛾幼蟲的LT50Table 3 The LT50of Hyphantria cunea larva infected by HcNPV powder treated at different temperature for 15 min

3 討論與結(jié)論

溫度對病毒活性的影響主要表現(xiàn)在其宿主感染后的死亡率和死亡時間的變化（LT50）。隨著溫度的升高和處理時間的延長，病毒活性降低，表現(xiàn)在感病幼蟲死亡率降低和致死中時間增加。分別用水浴和干熱100℃高溫處理HcNPV水劑和干粉15 min，其感病宿主的死亡率分別為17.41%和53.91%。表明多角體水劑比多角體干粉更容易受溫度影響而失活，這與殷坤山等對茶尺蠖核型多角體病毒研究的結(jié)論一致[4]。從溫度對不同狀態(tài)病的活性影響的結(jié)果可以看出，同樣的溫度和處理時間，HcNPV干粉在致病性與HcNPV水劑無顯著差異的情況下，致死中時間卻明顯延長，這與Morris對橡木尺蠖核型多角體病毒（Lambdina fiscellarialugubrosanuclear polyhedrosis virus,LfNPV）的研究結(jié)論一致。橡木尺蠖核型多角體病毒在45℃下處理120 h，其感染宿主死亡的LT50增長，但宿主最終死亡率無顯著差異[16]。經(jīng)水浴55℃、150 min處理的HcNPV水劑和經(jīng)水浴100℃、15 min處理的HcNPV水劑仍有一定活性，說明HcNPV水劑對短時的高溫（80℃以上）和一定時間的亞高溫(40～60℃)有一定的耐受性。

作為昆蟲病原微生物，昆蟲病毒在昆蟲疾病流行中起著十分重要的作用。因其具有對宿主專一性強(qiáng)，對環(huán)境友好等特性日益為人們所重視，應(yīng)用前景十分廣闊。但作為生物制劑，昆蟲病毒也存在一定的局限性，比如微生物制劑的穩(wěn)定性較差、野外施用方法不夠規(guī)范等問題[17]。筆者建議，在美國白蛾核型多角體病毒制劑的加工和野外施用過程中，應(yīng)注意以下幾個問題：（1）在制劑加工過程中注意避免高溫環(huán)境。粉劑可忍受15 min內(nèi)60℃以下的高溫環(huán)境，但最好不要超過40℃；水劑等溶液狀態(tài)的劑型盡量避免30℃以上的高溫；（2）在低溫環(huán)境下保存病毒；（3）在使用時除注意應(yīng)在低齡幼蟲期施用外，更應(yīng)注意避免在高溫烈日下施用，夏季時可在清晨或傍晚進(jìn)行施藥。

環(huán)境中的各種生態(tài)因子，對昆蟲病毒的穩(wěn)定性有明顯影響，因此，關(guān)于昆蟲病毒穩(wěn)定性的研究是病毒生態(tài)學(xué)研究中的重要內(nèi)容[18-21]。本文僅從環(huán)境溫度的角度對美國白蛾核型多角體病毒的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，以期對昆蟲病毒流行學(xué)研究以及利用病毒制劑進(jìn)行害蟲的持續(xù)控制提供依據(jù)。

[1]朱樹勛,吳青.小菜蛾顆粒體病毒研究初報[J].微生物學(xué)通報,1980(3):99-101

[2]馮振群,程清泉,秦啟聯(lián).小菜蛾顆粒體病毒殺蟲劑研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2009(18):144-146

[3]柴寶峰,王偉,梁愛華,等.溫度和pH值對重組桿狀病毒(AcMNPV-BmK IT-Chi)的毒力影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2007,13(3):338-340

[4]殷坤山,肖強(qiáng),唐美君,等.溫度、光、pH值對茶尺蠖病毒活性的影響[J].茶葉,2004(2):85-87

[5]Gordon R S,Sheila E.Milligan.Effects of Heat on Nonoccluded Nuclear Polyhedrosis Virus(Baculovirus)from Galleria mellonella Larvae[J].Environmental Entomology,1979,8(4):756-759

[6]Gudauskas R T,And D.The effect of heat,buffer salt and H-ion concentration,and ultraviolet light on the infectivity of Heliothis and Trichoplusia nuclear-polyhedrosis viruses[J].Journal of Invertebrate Pathology,1968,12(3):405-411

[7]艾德洪,于啟文,李玉璠,等.美國白蛾核型多角體病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)和感染力測定[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),1982(6):34-37

[8]于性躍,任立新,艾德洪,等.美國白蛾核型多角體病毒對幾種脊椎動物的安全性試驗(yàn)[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),1983(4):49-51

[9]艾德洪,于啟文,李玉璠,等.美國白蛾核型多角體病毒的應(yīng)用研究[J].植物保護(hù)學(xué)報,1984(2):127-132

[10]燕長安.用美國白蛾核型多角體病毒防治美國白蛾[J].新農(nóng)業(yè),1986(14):21-27

[11]劉玉書,祁振坤,曹占明,等.美國白蛾核型多角體病毒增殖方法[J].天津農(nóng)林科技,2010(4):4-5

[12]鄭桂玲,周洪旭,耿以龍,等.美國白蛾核型多角體病毒室內(nèi)大量增殖的研究[J].中國森林病蟲,2011(5):36-38

[13]段彥麗,曲良建,王玉珠,等.美國白蛾核型多角體病毒傳播途徑及對寄主的持續(xù)作用[J].林業(yè)科學(xué),2009(6):83-86

[14]劉海明,周洪旭,李長友.熒光增白劑與增效蛋白對美國白蛾核型多角體病毒(HcNPV)的增效作用[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報,2013(2):153-158

[15]楊唯一,張永安,唐明,等.三種熒光增白劑對HcNPV增效作用研究[J].林業(yè)科學(xué)研究,2009(5):736-739

[16]Morris O N.The effect of sunlight,ultraviolet and gamma radiations,and temperature on the infectivity of a nuclear polyhedrosis virus[J].J Invertebr Pathol,1971,18(2):292-294

[17]Erlandson M.Insect Pest Control by Viruses[M].Oxford:Academic Press,2008

[18]呂鴻聲.昆蟲病毒與昆蟲病毒病[M].北京:科學(xué)出版社,1982

[19]孫新城,景建洲,陳小科.桿狀病毒的生態(tài)學(xué)和流行病學(xué)研究進(jìn)展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(10):16-18

[20]孫修煉,胡志紅,彭輝銀.桿狀病毒生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J].Virologica Sinica,2006(2):200-206

[21]James R.Fuxa.Ecology of insect nucleo polyhedro viruses[J].Agriculture,Ecosystems&Environment,2004,103(1):27-43

Effect of Temperature on Activity of Hyphantria cunea Nuclear Polyhedrosis Virus(HcNPV)

YIN Can1,LIU Di1,REN Ji1,LU Xi-ping1,2,QIAO Lu-qin1,2*
1.College of Plant Protection,Shandong Agricultural University,Tai'an 271018,China
2.Engineering Research Center of Forest Pest Management of Shandong Province,Tai'an 271018,China

We studied on temperature influencing the activity of Hyphantria cunea nuclear polyhedrosis virus(HcNPV)and the results showed that with the temperature and treated-time increasing,the activity of HcNPV reduced,and LT50elongated. The activity of HcNPV suspension was affected more than the HcNPV powder by temperature,while the LT50of HcNPV powder lengthened significantly.The activity of HcNPV suspension treated by bath at 55℃for 60 min was 67%.The activity of HcNPV suspension treated by water bath at 100℃for 15 min was only 67%,but the activity of HcNPV powder treated by oven at 120℃for 15 min was still 47.91%.

Hyphantria cunea;nuclear polyhedrosis virus(NPV);activity;temperature;LT50

S476+.13

A

1000-2324(2015)03-0353-04

2013-10-12

2013-10-26

科技部“十二五”科技支撐計劃項(xiàng)目“食品安全生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)集成與示范”(2012BAK17B 05)

殷燦(1989-),女,河北邢臺人,在讀碩士研究生.研究方向:林木昆蟲.E-mail:yincan129@163.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:lqqiao@sdau.edu.cn