賴章林,李柏林,歐杰*,嚴(yán)維凌

1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306

2.上海市食品研究所,上海200235

攪打奶油中金黃色葡萄球菌生長預(yù)測模型的建立

賴章林1,李柏林1,歐杰1*,嚴(yán)維凌2

1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306

2.上海市食品研究所,上海200235

國內(nèi)外對金黃色葡萄球菌預(yù)測模型的研究集中處于一、二級模型，且乳品方面的研究又集中在牛奶，而微生物在攪打奶油的生長模型研究基本處于空白。為了填補金黃色葡萄球菌在攪打奶油中生長行為變化的空白，為金黃色葡萄球菌的風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)支持。本文選用產(chǎn)A型腸毒素的金黃色葡萄球菌作為研究對象，測定了15℃、20℃、25℃、30℃、36℃下金黃色葡萄球菌在新鮮奶油中的生長曲線，運用Origin8.0軟件和DMFit軟件，分別使用修正的Gompertz、修正的Logistic和Baranyi三模型來擬合不同溫度下的生長模型。通過比較三種模型的擬合結(jié)果，選擇最適模型的生長動力學(xué)參數(shù)，選用平方根方程構(gòu)建金黃色葡萄球菌最大比生長速率與溫度的二級模型。結(jié)果顯示，Baranyi模型對金黃色葡萄球菌的生長曲線擬合效果最好，構(gòu)建的二級平方根模型擬合度較好：R2為0.92，準(zhǔn)確因子（Af）和偏差因子（Bf）均在1左右。所構(gòu)建的二級模型，能真實快速有效地預(yù)測15～36℃金黃色葡萄球菌的生長情況。

攪打奶油;溫度;金黃色葡萄球菌;生長模型

攪打奶油又稱稀奶油，其含有35%左右的乳脂含量，經(jīng)攪打打發(fā)后從流動狀變?yōu)榉橇鲃訝畈⒕哂锌伤苄裕w積增加數(shù)倍，是制作夾芯蛋糕、裱花蛋糕、提拉米蘇、泡芙等西式烘焙食品的重要原料。商品化的攪打奶油都是商業(yè)無菌的，但在其后的加工貯藏環(huán)節(jié)包括攪打、裱花等都涉及到大量的人工操作，長時間在空氣中暴露，而金黃色葡萄球菌作為自然界中常見的微生物，大多是依附在人的皮膚、黏膜、鼻孔、咽、胃腸道或泌尿系統(tǒng)等[1,2]，同時乳和乳制品是金黃色葡萄球菌的主要宿主，當(dāng)制作蛋糕等烘焙食品的面包房衛(wèi)生消毒措施不到位時，就有可能導(dǎo)致加工好的食品受金黃色葡萄球菌污染并導(dǎo)致食物中毒[3]。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus）可引起多種組織器官的化膿性炎癥，能導(dǎo)致很多種疾病的病原微生物，這種致病可能與其產(chǎn)生的多種外毒素和其他毒力因子有關(guān)，如毒素休克綜合癥-1，剝脫毒素和腸毒素[4,5]，腸毒素是引起金黃色葡萄球菌食物中毒的主要因子。100 ng的腸毒素即可引

起嘔吐、腹痛、腹瀉等食物中毒癥狀[6,7]，腸毒素還有著極強的耐熱特性[8]。近年來發(fā)生的金黃色葡萄球菌腸毒素感染事件如2000年日本雪印奶粉事件等[9]。

預(yù)報微生物學(xué)可以在不測的情況下即可知道待測食品的食用價值及不穩(wěn)定因素，打破傳統(tǒng)微生物檢測受時間約束而滯后的問題，在食品貨架期與食品安全檢測方面具有極高價值。通過監(jiān)測金黃色葡萄球菌在不同溫度下的攪打奶油中的生長，建立生長模型是預(yù)測攪打奶油中金黃色葡萄球菌的菌數(shù)及產(chǎn)毒情況的有效手段。

國內(nèi)外對金黃色葡萄球菌預(yù)測模型的研究集中處于一、二級模型，且乳品方面的研究又集中在牛奶，而微生物在攪打奶油的生長模型研究基本處于空白。趙鳳[10]用Gompertz模型、Logistic模型、多項式方程擬合10～36℃的原料乳中的金黃色葡萄球菌的生長模型，通過對各模型均方誤差（MSE）和實際擬合生長曲線的分析，得出10～18℃下的最適生長模型為多項式方程，20～23℃下的最適生長模型為Logistic模型，25～36℃下的最適生長模型為Gompertz模型。Hiroshi Fujikawa[11,12]等人用修正的Logistic，當(dāng)菌的數(shù)目達(dá)到了6.5 logCFU/mL時，牛奶中的毒素的產(chǎn)量將隨時間線性增長，甚至當(dāng)細(xì)菌數(shù)目達(dá)到了穩(wěn)定期時也是這樣的。雖然腸毒素的檢測方法很多[6][13,14]，但是在實際應(yīng)用中，為了省去毒素檢測的環(huán)節(jié)，模型是必需的。

針對毒素產(chǎn)生的問題，許多的學(xué)者對培養(yǎng)基中的金黃色葡萄球菌的產(chǎn)毒條件進行了研究，最終發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)金黃色葡萄球菌的數(shù)量達(dá)到了一定的濃度時才會產(chǎn)生毒素。本研究首次研究攪打奶油，簡要概述了攪打奶油以及其易受微生物感染的原因，在不同的溫度下，通過多模型對比，從而得出可以預(yù)測攪打奶油中金黃色葡萄球菌的生長狀態(tài)的模型。在現(xiàn)實生活中，為攪打奶油的食用性定性提供了理論基礎(chǔ)。監(jiān)測金黃色葡萄球菌在不同溫度下攪打奶油中的生長，建立一級模型，選擇最優(yōu)一級模型，在此基礎(chǔ)上建立二級模型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)A型腸毒素金黃色葡萄球菌（SA14966）上海市食品研究所保存，零下30℃凍藏于40%甘油溶液中；1 L裝Anchor攪打奶油新西蘭產(chǎn)（國內(nèi)市購）；Petrifilm?金黃色葡萄球菌測試片美國3M公司；營養(yǎng)肉湯上海華康科技開發(fā)有限公司。

Xiang Yi H-2050R離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司；KM020多功能食品處理機英國健伍股份有限公司；隔水式溫培養(yǎng)箱上海-恒科技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)藥設(shè)備廠；烘箱DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海-恒科技術(shù)有限公司；MJ-II霉菌培養(yǎng)箱上海-恒科技術(shù)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱上海醫(yī)療器械七廠；THZ-82A氣浴恒溫振蕩器金壇市城西天竟實驗儀器廠；電子天平PL6001-L梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 制備菌懸液

從保存的平板培養(yǎng)基中取出一環(huán)菌量，接種到250 mL盛有營養(yǎng)肉湯的三角燒瓶里，置于搖床培搖床培養(yǎng)（100 r/min，37℃，18～20 h）。

1.3 帶菌攪打奶油的制備

將1 L奶油倒入奶油攪打機中，用移液槍加入1 mL菌液，攪打5 min，攪打后，將奶油移至大燒杯中。然后置于恒溫下培養(yǎng)。

1.4 試驗方法

1.4.1 金黃色葡萄球菌的接菌、培養(yǎng)和計數(shù)本實驗采用不同的溫度，原始菌液約8 logCFU/mL，通過梯度稀釋，通過計數(shù)可以得出初始菌接菌濃度約為2～3 logCFU/mL。

實驗選定了15±1℃、20±1℃、25±1℃、30±1℃、36±1℃這5個溫度下，不同的溫度，不同時刻，稀釋梯度不同，在選定的時間，用電子天平無菌稱取10 g樣品置于裝有90 mL無菌生理鹽水的采樣杯中。再用移液槍在9 mL的無菌生理鹽水中做梯度稀釋，采用Petrifilm?金黃色葡萄球菌測試片進行計數(shù)，其他具體過程參見國標(biāo)GBT4789.10-2010[15]，測試片在37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，計數(shù)，每次做兩個平行樣。

1.4.2 建立生長模型應(yīng)用Origin8.0軟件擬合和DMFit（http://modelling.combase.cc/DMFit.aspx）來擬合生長數(shù)據(jù)，修正的Logistic[16]、修正的Gompertz[16]模型通過Origin8.0擬合，Baranyi[17]模型通過DMFit擬合。通過這三個模型擬合不同溫度下金黃色葡萄球菌隨時間生長的對比，得出最適合建立二級模型的一級模型。以下是三個模型的方程：

修正的Gompertz:

修正的Logistic:

Baranyi and Roberts:

式（1）、（2）中l(wèi)og(Nt)是t時的菌落數(shù)的對數(shù)值[log(CFU/mL)]。log(N0)是初始的菌數(shù)[log(CFU/mL)]，A是擬合參數(shù)，μm是最大比生長速率h-1，λ是滯后期h。式（3）中y0和ymax分別是細(xì)菌的初始菌量和最大菌量，tlag是滯后期。

溫度對生長速率的影響用平方根方程[18]來擬合，方程如下：

式中a，Tmin是擬合參數(shù)，a是回歸系數(shù)，Tmin表示細(xì)菌理論的最低生長溫度，是最大比生長速率h-1，T是溫度℃。通過對比三個一級模型，得出最佳的一級模型，從而得出對應(yīng)的比生長速率和對應(yīng)的溫度，將其代入式（4）中，同過Origin8.0擬合，從而得出Tmin和a的值。

1.4.3 模型的檢驗通過一級模型得出的R2和最大比生長速率μm來判斷一級模型是否適合建立二級模型，二級模型的驗證則是通過比較均方根誤差（Root Mean Square Error,RMSE）[19]、殘差平方和(RSS)、偏差度（Bias Factor,Bf）以及準(zhǔn)確度（Accuracy Factor,Af）[20]，進而了解所構(gòu)建模型所得到的預(yù)測值與實驗所得真實值之間的差異。

式中μp，μd是最大比生長速率的預(yù)測值和實驗值，其中實驗的次數(shù)n為5。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌的一級模型的建立

用Origin8.0分別用修正的Gompertz和修正的Logistic擬合15±1℃、20±1℃、25±1℃、30±1℃、36±1℃條件下的金黃色葡萄球菌的生長，得出參數(shù)如下：

表1 修正的Gompertz模型參數(shù)Table 1 Statistic analysis of growth parameters of modified Gompertz

表2 修正的Logistic模型參數(shù)Table 2 Statistic analysis of growth parameters of modified Logistic

用DMFit軟件中的Baranyi模型來擬合不同溫度下的金黃色葡萄球菌的生長，得到的生長參數(shù)如下：

表3 Baranyi模型參數(shù)Table 3 Statistic analysis of growth parameters of Baranyi

從實驗結(jié)果可以看出，三個模型分別在5個溫度下的擬合R2都超過了0.9，說明三個模型都能擬合，但是在30℃時，修正的Logistic模型和修正的Gompertz模型擬合得到的μm都不合理，所以最適合用Baranyi模型得到的參數(shù)來建立二級模型。

以下是以log(Nt)為縱坐標(biāo)，時間t為橫坐標(biāo)建立的Baranyi模型：如圖1。

圖1 是(a)15℃、(b)20℃、(c)25℃、(d)30℃、(e)36℃條件下奶油中的金黃色葡萄球菌的一級生長模型Fig.1 The primary growth model for Staphylococcus aureus in cream at(a)15℃,(b)20℃,(c)25℃,(d)30℃,(e)36℃

2.2 建立金黃色葡萄球菌的二級生長模型

通過Baranyi模型得到了不同溫度的最大比生長速率μm代入平方根方程，得到了最大比生長速率與溫度的二級模型，擬合曲線如圖2。

圖2 最大比生長速率與溫度的二級模型擬合曲線圖Fig.2 Fitted μmand temperature of the secondary model

得到了擬合方程：

從圖2可以看出，在15～36℃這一溫度范圍內(nèi)，最大比生長速率隨溫度的升高而增大，呈良好線性關(guān)系。方程擬合的決定系數(shù)R2為0.911。得出的理論最低生長溫度為2.4℃，實驗監(jiān)測了5℃下的奶油中的金黃色葡萄球菌的生長，基本處于不增長或是負(fù)增長狀態(tài)，所以這個理論最低生長溫度是有一定的參考意義。

2.3 模型的驗證

表4是，比生長速率的預(yù)測值與實測值的殘差平方和(RSS)、平方根誤差(RMSE)、準(zhǔn)確性因子(Af)、偏差因子(Bf)。

表4 比生長速率的預(yù)測值與觀測值的統(tǒng)計學(xué)分析Table 4 Statistic analysis of μmbetween predicted value and observed value

通過表4可以得出，二級模型R2值大于0.92，同時殘差平方和值只有0.001，這就表明平方根模型可以很好的擬合溫度對最大比生長速率的影響，通過比較最大比生長速率的預(yù)測值和觀測值，得出Af、Bf的值都很接近1，說明擬合值和觀測值都很接近，該模型的擬合度較好，適合預(yù)測奶油中的金黃色葡萄球菌的生長。

在15～36℃這溫度范圍內(nèi)，分別取了28℃和33℃，在將溫度代入平方根方程中，得到的最大比生長速率與實驗測得最大比生長速率很接近。在28℃溫度條件下μm預(yù)測值為0.131，實測值為0.123；在33℃溫度條件下μm預(yù)測值為0.189，實測值為0.191?？梢钥闯鲱A(yù)測值與實測值非常的接近，因此這個模型是值得信賴的。

3 討論

用于建立微生物模型的數(shù)據(jù)收集方式主要有三種[21,22]：一是實驗室的肉湯液體培養(yǎng)基上接種、培養(yǎng)、測定。目前，大部分的模型都是基于肉湯液體培養(yǎng)基上建立起來的，例如PMP（Pathogen modeling program）[23]中所有的模型都是基于液體培養(yǎng)基，用液體培養(yǎng)基建立模型，雖然方便、快捷、測定數(shù)值精確。但是不同食品的營養(yǎng)成分、組成成分不同，所以生長情況不同，預(yù)測結(jié)果與實際結(jié)果會有很大的誤差，因此基于肉湯培養(yǎng)基建立的金黃色葡萄球菌的生長模型不能很好的描述攪打奶油中金黃色葡萄球菌的生長；二是通過測定自然污染的原料食品的菌數(shù)變化來建立模型。自然污染的食品所受污染的微生物種類不固定，微生物初始菌不易控制，菌間的相互作用就更復(fù)雜；三是向原料食品上接種特定微生物來獲得數(shù)據(jù)從而建立模型，這種方法雖然操作繁瑣，菌數(shù)測定精確度不如液體培養(yǎng)基，但可以考察食品原料組織對特定微生物生長的影響，所以建立的模型能很好的預(yù)測特定微生物在實際食品上的生長。本研究采用了第三種方法，向無菌攪打奶油中直接接種活化好的金黃色葡萄球菌，在密封的大燒杯中進行培養(yǎng)和測定，并驗證該數(shù)學(xué)模型用于預(yù)測金黃色葡萄球菌在攪打奶油中生長的有效性。

4 結(jié)論

影響微生物生長的因素很多，如pH，Aw以及生物保鮮劑等，但是對于攪打奶油中的金黃色葡萄球菌來說，溫度是最大的影響因素，因此本課題選擇溫度作為主要因素來研究。本實驗研究了攪打奶油中金黃色葡萄球菌在不同溫度下的生長規(guī)律，實驗選定15±1℃、20±1℃、25±1℃、30±1℃、36±1℃這5個溫度。分別以修正的Logistic、修正的Gompertz、和Baranyi模型建立了金黃色葡萄球菌在不同溫度下的一級模型，通過比較三個模型的R2和μm，得出Baranyi模型的擬合效果更好，通過Baranyi生長曲線可以得出，在15～36℃內(nèi)，最大比生長速率隨著溫度的升高而增大。通過15～36℃恒溫下的攪打奶油中金黃色葡萄球菌的Baranyi生長動力學(xué)模型，建立了在15～36℃恒溫儲藏條件下攪打奶油中金黃色葡萄球菌最大比生長速率與溫度關(guān)系的有效二級模型，為使用者提供能精確預(yù)測金黃色葡萄球菌在攪打奶油流通或食用過程中的生長動態(tài)工具。

[1]MEDVEDOVA A,VALIK L,SIROTNA Z,et al.Growth characterization of Staphylococcus aureus in milk:a quantitative approach[J].Czech J.Food Sci.,2009,27(6):443-453

[2]索玉娟,于宏偉,凌巍,等.金黃色葡萄球菌污染狀況研究[J].中國食品學(xué)報,2008,68(3):88-92

[3]王彤,林露,嚴(yán)維凌,等.溫度和接種量對攪打奶油中金黃色葡萄球菌生長及產(chǎn)腸毒素的影響[J].食品科學(xué),2014,35(23):210-214

[4]劉偉,王菊光,孫曉華,等.日常食品及食物中毒樣本中金黃色葡萄球菌腸毒素的分型檢測分析[J].中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2013,14(8):608-611

[5]BOYNUKARA B,GULHAN T,ALISARLI M,et al.Classical enterotoxinogenic characteristics of Staphylococcus aureus strainsisolatedformbovinesubclinicalmastitisinVan,Turkey[J].InternationalJournalofFoodMicrobiology,2008,125:209-211

[6]云盛,索曉敏,徐正挺,等.金黃色葡萄球菌腸毒素檢測的研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2012,12(19):3756-3758

[7]柳旭偉,葛文霞.金黃色葡萄球菌腸毒素[J].微生物學(xué)雜志,2008,28(5):86-90

[8]許振偉,韓奕奕,孟瑾,等.熟食肉制品中金黃色葡萄球菌風(fēng)險評估基礎(chǔ)研究[J].包裝與食品機械,2012,30(5):40-43

[9]徐振波,劉曉晨,李琳,等.金黃色葡萄球菌腸毒素在食源性微生物中的研究進展[J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(9):2317-2324

[10]趙鳳,曲行光,呂學(xué)娜.原料乳中金黃色葡萄球菌生長模型的建立[J].質(zhì)量安全,2009:242-244

[11]FUJIKAWA H,MOROZUMI S.Modeling Staphylococcus aureus growth and enterotoxin production in milk[J].Food Microbiology,2006(23):260-267

[12]FUJIKAWAH.Developmentofanewlogisticmodelformicrobialgrowthinfoods[J].Biocontrol Science,2010,15(3):75-80

[13]曾湘淼.金黃色葡萄球菌的檢測與清除[J].生物信息學(xué),2012,10(4):301-306

[14]陸貞玉.食品中金黃色葡萄球菌及檢測方法現(xiàn)況[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志,2010,26(11):892-894

[15]中華人民共和國衛(wèi)生部中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GBT4789.10-2010食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌計數(shù)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010:1-16

[16]ZWIETERING MH,JONGENBURGER I,ROMBOUTS FM,et al.Modeling of the Bacterial Growth Curve[J].Appl. Environ.Microbiol,1990,56(6):1875-1881

[17]GARICAD,RAMOSAJ,SANCHIV,etal.Predictingmycotoxinsinfoods:Areview[J].FoodMicrobiology,2009(26):757-769

[18]LEMARC Y,VALIK L,MEDVEDOVAA.Modelling the effect of the starter culture on the growth of Staphylococcus aureus in milk[J].International Journal of Food Microbiology,2009(129):306-311

[19]DING T,SHIM YH,KIM HN,et al.Development of Predictive Model for the Growth of Staphylococcus aureus in Kimbab[J].Food Sci.Bioltechnol,2011,20(2):471-476

[20]DING T,SHIM YH,CHOI NJ,et al.Mathematical Modeling on the Growth of Staphylococcus aureus in Sandwich[J].Food Sci.Biotechnol,2010,19(3):736-768

[21]姜英杰,鄒曉葵,彭增起,等.大腸桿菌在豬背最長肌上生長預(yù)測模型的建立[J].食品可學(xué),2008,29(12):115-119

[22]董慶利,曾靜,熊成,等.不同儲藏溫度下冷卻豬肉貨架期預(yù)測模型的構(gòu)建[J].食品科學(xué),2012,33(20):304-308

[23]BARANYI J,ROSS T,ROBERTS TA,et al.The effects of parameterisation on the performance of empirical models used in predictive microbiology[J].Food Microbiology,1996,13:89-91

Establishment of Growth Model of Staphylococcus aureus in Whipping Cream

LAI Zhang-lin1,LI Bai-lin1,OU Jie1*,YAN Wei-ling2
1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China
2.Shanghai Food Research Institute,Shanghai 200235,China

In dairy research many study about primary and secondary models of Staphylococcus aureus growth focus on the milk,but very few report related with the S.aureus growth on whipping cream.In order to well understand the S.aureus growth in whipping cream and provide data support for the risk assessment of S.aureus,a S.aureus strain produce enterotoxin A was chosen in this study and S.aureus growth curves in whipping cream at 15℃,20℃,25℃,30℃and 36℃were obtained.The modified Gompertz,modified Logistic and Baranyi models were applied to fit the growth curves as primary models by Origin 8.0 software and DMFit software.The root-squaring model was used to fit secondary model which describing the relationship between the maximum growth rate with temperature.The results showed that the Baranyi model was the best to fit the S.aureus growth in whipping cream as primary model and the values from the Baranyi model could build the root-squaring model with R2as 0.92,the accurate factor(Af)and the deviation factor(Bf)were around 1.This secondary model from this study can be used to predict the growth of S.aureus in whipping cream under 15℃～36℃.

Whipping cream;temperature;Staphylococcus aureus;growth model

TS252.52

A

1000-2324(2015)03-0341-06

2013-05-01

2013-05-11

上海市科委應(yīng)用技術(shù)開發(fā)專項資金(2013-116）、(2014-110)

賴章林(1990-),男,碩士研究生,研究方向為食品微生物學(xué).E-mail:974897861@qq.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:jou@shou.edu.cn