晏華春，馬曉燕，依明·蘇來曼，劉紅嬌，韓煜茹，劉婷婷（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

和田羊KRT31基因遺傳多態(tài)性相關(guān)分析

晏華春，馬曉燕，依明·蘇來曼，劉紅嬌，韓煜茹，劉婷婷
（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

為探討KRT31基因是否是影響和田羊羊毛細(xì)度的候選基因，試驗(yàn)以隨機(jī)采集的400只和田羊個(gè)體的血樣為材料，利用PCR-SSCP、DNA測(cè)序等技術(shù)研究了和田羊KRT31基因的多態(tài)性及其與羊毛細(xì)度的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明：和田羊KRT31基因具有多態(tài)性，存在3種基因型：EE、EF和FF，且處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），多態(tài)信息含量（PIC）為0.369 8，屬于中度多態(tài)（0.5＞PIC＞0.25）。KRT31基因編碼區(qū)片段在堿基序列52bp（C→T）處發(fā)生突變。關(guān)聯(lián)分析表明：和田羊不同基因型之間的羊毛細(xì)度差異均不顯著（P＞0.05）。

和田羊；KRT31；多態(tài)性；羊毛細(xì)度

和田羊產(chǎn)于新疆南疆和田地區(qū)，是一個(gè)歷史悠久的地方性綿羊品種，其羊毛是和田地毯的最佳原料。毛纖維具有高度的結(jié)構(gòu)組織，角蛋白中間絲蛋白（KRT-IF）和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（KAPs）占羊毛纖維的90％［1-2］。羊毛皮質(zhì)內(nèi)的角蛋白及其關(guān)聯(lián)蛋白，是毛纖維的重要組成成分。有研究表明，在新疆美利奴羊中，KAP1.1、KAP1.3等KAPs基因?qū)ρ蛎誀詈推焚|(zhì)有較大影響［3］，KAP1-4基因?qū)ρ蛎誀钜灿杏绊懀?］，KRT27、KRT85、KRT35、KRT31、KRT38等對(duì)毛囊分裂和毛囊結(jié)構(gòu)有影響［5］。遺傳因素是影響綿羊經(jīng)濟(jì)性狀的基本因素［6］，很多學(xué)者通過基因方面的研究，普遍認(rèn)為多基因?qū)γq性狀影響較大，可能存在主效基因，因此當(dāng)前的研究熱點(diǎn)主要是毛絨纖維的角蛋白中間絲和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白相關(guān)基因的研究。KRT31基因是角蛋白中間絲蛋白家族之一，因此，本試驗(yàn)選擇優(yōu)良的異質(zhì)半粗毛短脂尾和田羊作為研究對(duì)象，采用PCR、DNA測(cè)序等技術(shù)對(duì)和田羊KRT31基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，并和其對(duì)應(yīng)的羊毛細(xì)度進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，主要為找到改善其羊毛細(xì)度的分子標(biāo)記位點(diǎn)，以便為新疆和田羊經(jīng)濟(jì)性狀的選育、品種資源的保存提供一定的遺傳學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣本 本試驗(yàn)選擇年齡、體重相近，健康無病的新疆和田羊400只作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。頸部靜脈采集血樣5mL，用枸櫞酸鈉抗凝，置于-20℃長(zhǎng)期凍存。

1.1.2 主要藥品和試劑 Marker，Tris平衡酚，6×Loading Buffer，（NH4）2S2O8，10×PCR Buffer，冰無水乙醇，EDTA，NaCl，Tris·HCl，SDS，EB（H3BO3），四溴苯酚磺酞，瓊脂糖粉，聚丙烯酰胺（PAM），蒸餾水。

1.1.3 主要試驗(yàn)儀器 移液器，ZHJH C1112B型超凈工作臺(tái)，BIOFUGE PRIMOR型低溫離心機(jī)，IKA MS3型圓周振蕩器，JY04S型凝膠成像儀，Mini-6K型微型離心機(jī)，PCR儀，DYCP-31CN型瓊脂糖水平電泳槽，PowerPac Basic型電泳儀。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?.5％的瓊脂糖對(duì)提取的基因組DNA檢測(cè)，看其結(jié)果。用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物（KRT31 F：CTGTTGTCTTGCCTCTTT；R：TCTACACTGgATGGGATT），發(fā)送到上海生工進(jìn)行合成。

1.2.1 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系：PCRgreen Mixture 10μL，上游引物（10pmol/μL）0.6μL，下游引物（10pmol/μL）0.6μL，模板DNA（50ng/μL）1.5μL，超純水7.3μL，總體積20μL。

PCR反應(yīng)溫度及時(shí)間：95℃預(yù)變性3min，35個(gè)循環(huán)（94℃變性30s，52.1℃40s，72℃延伸60s），72℃延伸10min，4℃保存。

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：取10μL PCR產(chǎn)物和7μL變性劑98℃變性10min，立刻取出冰浴30min。用8％的非變性聚丙烯酰胺制膠。電泳條件300V50mA空跑30min，點(diǎn)完樣后預(yù)跑10min，降低電壓到180V電泳15h后銀染顯色，看其基因型。

1.2.2 測(cè)序 選取不同基因型的樣品各6個(gè)，對(duì)其擴(kuò)增，然后瓊脂糖檢測(cè)，選擇較亮的進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng) EXCEL軟件初步處理，并用SPSS 17.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行One-wayANOVA對(duì)不同處理間的處理效應(yīng)進(jìn)行方差分析。測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

桑葉蛋白多糖中的多糖部分由D-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-葡萄糖和D-半乳糖組成，它們之間的摩爾比為8.91∶2.71∶1.00∶3.75∶6.04。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取DNA結(jié)果檢測(cè)

本試驗(yàn)從和田羊血樣中提取基因組DNA。圖1是提取的DNA在1.5％的瓊脂糖凝膠中的檢測(cè)結(jié)果，各泳道條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象。

圖1 和田羊基因組DNA檢測(cè)

2.2 PCR擴(kuò)增

按照PCR擴(kuò)增體系，以和田羊血液中提取的DNA作為模板，在PCR儀中擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，然后經(jīng)1％瓊脂糖凝膠檢測(cè)。如圖2，條帶清晰無雜帶。

圖2 和田羊KRT31的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 KRT31基因的SSCP檢測(cè)

用條帶清晰的PCR產(chǎn)物變性后通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行SSCP檢測(cè)后，具有多態(tài)性，命名3種基因型：EE、FF和EF。如圖3所示。

圖3 和田羊KRT31的SSCP檢測(cè)結(jié)果

2.4 不同基因型序列測(cè)定

挑選EE型、FF型和EF型的樣品各幾個(gè)進(jìn)行測(cè)序，不同基因型的測(cè)序峰圖與原序列比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KRT31基因堿基序列在52bp（C→T）處發(fā)生突變。如圖4。

圖4 和田羊KRT31基因序列比對(duì)

2.5.1 KRT31基因的基因頻率和基因型頻率 KRT31基因存在EE、EF和FF三種基因型，基因型的頻率分別為0.200、0.457和0.343。等位基因E、F的頻率分別為0.429和0.571。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，和田羊群體在該位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.5.2 KRT31基因的遺傳參數(shù)值 試驗(yàn)中和田羊KRT31基因的純合度0.510，雜合度0.490，有效等位基因數(shù)1.960。根據(jù)確定位點(diǎn)多態(tài)性的標(biāo)準(zhǔn)，KRT31基因的PIC為0.369 8，屬于中度多態(tài)位點(diǎn)。因此，優(yōu)質(zhì)毛群體遺傳變異處于中等水平，同時(shí)此突變位點(diǎn)可作為和田羊遺傳多態(tài)性的有效遺傳標(biāo)記。

2.6 不同基因型與羊毛細(xì)度的關(guān)聯(lián)分析

用SPSS軟件對(duì)和田羊KRT31不同基因型與羊毛細(xì)度進(jìn)行分析，從分析結(jié)果（表1）可知，EE、FF和EF三種基因型的羊毛細(xì)度均差異不顯著（P＞0.05）。

表1 不同基因型與羊毛細(xì)度關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 μm

3 討論

等位基因頻率是用來表示一個(gè)種群中基因多樣性情況的指標(biāo)，它是估計(jì)種群內(nèi)和種群間遺傳關(guān)系的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)中，KRT31基因純合度為0.510，雜合度0.490，有效等位基因數(shù)1.960。多態(tài)信息含量0.369 8，屬于中度多態(tài)位點(diǎn)的范疇。對(duì)于一個(gè)群體來說，多態(tài)信息含量、等位基因數(shù)目和雜合度是能夠決定群體遺傳變異程度的，遺傳變異性越高，選擇潛力就越大。本試驗(yàn)KRT31基因處于中等遺傳變異，該突變位點(diǎn)有可能可以作為和田羊遺傳多樣性的有效遺傳標(biāo)記。

通過對(duì)KRT31基因PCR-SSCP分析和測(cè)序發(fā)現(xiàn)，KRT31基因堿基序列在52bp（C→T）處發(fā)生突變，把含有不同基因型的和田羊羊毛細(xì)度數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從分析結(jié)果可知，EE、FF和EF三種基因型的羊毛細(xì)度差異均不顯著（P＞0.05）。劉桂芬等［7］將KAP1.1、KAP1.3的部分序列、KAP6-1的外顯子區(qū)作為候選基因，并與羊毛細(xì)度的性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得出KAP1.1、KAP1.3中位點(diǎn)W08667與羊毛細(xì)度有顯著的相關(guān)性（P＜0.05），KAP6-1外顯子W06933與羊毛細(xì)度之間也有顯著的相關(guān)性（P＜0.05）。Parsons等［8］在美利奴羊中指出毛中含蛋白（KAP6，7，8）較多，并推測(cè)影響羊毛纖維直徑的基因和這些蛋白可能存在同一染色體上。王麗萍等［9］研究了甘肅高山型細(xì)羊毛KRT35基因的多態(tài)性，并與羊毛彎曲度進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果表明優(yōu)質(zhì)毛品系不同基因型之間羊毛彎曲度均差異不顯著（P＞0.05）。

4 結(jié)論

（1）試驗(yàn)中和田羊KRT31基因的多態(tài)信息含量是0.369 8，屬于中度多態(tài)位點(diǎn)。因此，該群體遺傳變異處于中等水平，具有較大的選擇潛力。

（2）本試驗(yàn)通過KRT31基因PCR-SSCP分析和測(cè)序發(fā)現(xiàn)，堿基序列在52bp（C→T）處發(fā)生突變，并把毛性狀（細(xì)度）與基因位點(diǎn)進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果EE、FF和EF三種基因型的羊毛細(xì)度均差異不顯著（P＞0.05）。

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Polymorphism of KRT31 Gene and Its Correlation with the Wool Fineness in Hetian Sheep

Yan Huachun，Ma Xiaoyan，Yiming·Sulaiman，et al
（Animal Nutrition LaboratoryofCollege ofAnimal Sciences，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

In order toexplore ifKRT31 gene is a candidate gene affectingthe wool fineness ofHetian sheep，400 individual blood samples were collected and analyzed for the information of its polymorphism and its correlation with the wool fineness by PCR-SS-CP analysis and DNA sequencing technology.The results showed that there was a polymorphism in KRT31 gene；the KRT31 gene had three genetypes（EE，EF，F(xiàn)F）and was in the Hardy-Weinbergequilibrium state（P＞0.05），the polymorphism information content（PIC）was 0.369 8，belongingtomoderate polymorphism（0.25＜PIC＜0.5）.The sequencingresult indicated that the Aallele had C-Tmutation at the CDSpartial sequence in 52 bp.The correlation analysis showed that the wool fineness had nosignificant difference amongdifferent genotypes（P＞0.05）.

Hetian sheep；KRT31；polymorphism；wool fineness

S826.2

A

2095-3887（2015）05-0008-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.05.003

2015-04-04

新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（XJEDU2013I17）

晏華春（1988-），男，碩士研究生。

依明·蘇來曼（1971-），男，維吾爾族，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：動(dòng)物遺傳育種。