荊丹清 陳玉靜 尹士男 賈 喆

解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100048

三種方法測(cè)定糖化血紅蛋白的一致性和可靠性分析

荊丹清 陳玉靜 尹士男 賈 喆

解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100048

目的探討微粒色譜法、親和層析法與高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定糖化血紅蛋白（GHb）的一致性和可靠性。 方法 選取2014年6～9月在解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院門診及住院治療的137例糖尿病患者為研究對(duì)象，空腹抽取雙份全血標(biāo)本。利用微粒色譜法、親和層析法及HPLC法分別測(cè)定糖化血紅蛋白A1（HbA1c），每份標(biāo)本測(cè)定2次。將入組的137例糖尿病患者參照HPLC法測(cè)定的HbA1c為金標(biāo)準(zhǔn)分為3組：第1組HbA1c含量 ≤6.5%；第2組6.5%＜HbA1c含量 ＜7.5%；第3組HbA1c含量≥7.5%，分析各組人群采用的3種不同檢測(cè)方法組間差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以Bio-Rad D10 HPLC測(cè)定的GHb為目標(biāo)系統(tǒng)，以微粒色譜法和親和層析法為試驗(yàn)系統(tǒng)，建立回歸方程，分析試驗(yàn)系統(tǒng)與目標(biāo)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的偏差程度。 結(jié)果3種方法測(cè)定HbA1c值組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；回歸分析顯示，微粒色譜法與HPLC法所測(cè)的HbA1c值呈良好的線性關(guān)系，Y=1.006 X +0.213，相關(guān)指數(shù)r2=0.885；層析法與HPLC法測(cè)定結(jié)果亦呈良好的線性關(guān)系，Y=0.923 X+0.338，相關(guān)指數(shù)r2= 0.917；對(duì)于不同的糖尿病人群，3種方法檢測(cè)結(jié)果亦呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。 結(jié)論微粒色譜法和親和層析法均能為臨床提供與HPLC法所測(cè)糖化血紅蛋白偏差較小的可靠數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)結(jié)果可被臨床接受。微粒色譜法操作簡(jiǎn)單、快速，可為臨床快速診斷提供方便。

糖化血紅蛋白；離子交換高效液相色譜法；微粒色譜法；親和層析法

糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，GHb）是血紅蛋白與糖類非酶促結(jié)合的產(chǎn)物，它的合成緩慢而且是不可逆的。它反映3個(gè)月左右的平均血糖水平，克服了飲食時(shí)間、空腹時(shí)間、服藥時(shí)間的干擾，在患者血糖或尿糖波動(dòng)較大時(shí)有特殊意義[1]。糖化血紅蛋白A1（HbA1c）在糖尿病的篩選、制訂糖尿病患者的治療方案及對(duì)血糖控制水平的評(píng)價(jià)上有很高的臨床價(jià)值[2-3]。HbA1c的檢測(cè)方法很多，目前，臨床上通用的HbA1c檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)是非多孔陽離子交換柱的高壓液相層析法，但因儀器價(jià)格昂貴基層醫(yī)院不能普及，而且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，操作復(fù)雜，不能滿足門、急診患者的要求。尋找更加方便、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)HbA1c的方法就顯得尤為重要。本研究對(duì)137例糖尿病患者分別采用3種方法測(cè)定HbA1c（親和層析法測(cè)定的是糖化血紅蛋白總量），旨在比較3種檢測(cè)方法所測(cè)HbA1c的可靠性、操作的方便性及快捷性。本組數(shù)據(jù)顯示，NycoCard readerⅡ床旁HbA1c分析儀采用微粒色譜法（小旋風(fēng)）以及用親和層析法與傳統(tǒng)的高效液相色譜（HPLC）法所測(cè)數(shù)據(jù)均有良好的相關(guān)性，且微粒色譜法的優(yōu)勢(shì)是較親和層析法操作簡(jiǎn)單、快捷，適合床旁患者快速檢測(cè)，現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年6～9月于解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）內(nèi)分泌門診及內(nèi)分泌科住院治療的137例糖尿病患者為研究對(duì)象，其中男71例，女66例，年齡23～87歲，平均（57.3±28.9）歲，患者糖尿病史0.5～51年。檢測(cè)前經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并由患者簽訂知情同意書。

1.2 儀器與試劑

目標(biāo)系統(tǒng)檢測(cè)方法為離子交換HPLC法，利用Bio-Rad D10糖化血紅蛋白測(cè)定儀（北京市衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心質(zhì)檢合格）測(cè)定HbA1c；試驗(yàn)系統(tǒng)為微粒色譜法和親和層析法，微粒色譜法利用 NycoCard READERⅡ特種蛋白金標(biāo)檢測(cè)儀（小旋風(fēng)），親和層析法利用Premier Hb9210糖化血紅蛋白測(cè)定儀測(cè)定糖化血紅蛋白，對(duì)比其差異結(jié)果。試劑為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)的檢測(cè)試劑，經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)有良好的穩(wěn)定性。

1.3 檢測(cè)方法

137例患者清晨抽取靜脈血2 mL各2份，EDTA-K2抗凝。由3名技師分別負(fù)責(zé)3種儀器對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法嚴(yán)格按照檢測(cè)程序說明進(jìn)行。全組中根據(jù)Bio-Rad D10測(cè)定的糖化血紅蛋白值將患者分為3組：HbA1c含量≤ 6.5%、6.5%＜HbA1c含量＜7.5%、HbA1c含量≥7.5%，分析各組人群采用的3種不同檢測(cè)方法組間差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以Bio-Rad D10糖化血紅蛋白測(cè)定儀測(cè)定的糖化血紅蛋白為目標(biāo)系統(tǒng)（臨床檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)），以微粒色譜法和親和層析法為試驗(yàn)系統(tǒng)，建立回歸方程，分析試驗(yàn)系統(tǒng)與目標(biāo)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果的偏差程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間及組內(nèi)比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組檢測(cè)標(biāo)本數(shù)量

全組3種儀器各檢測(cè)274例標(biāo)本（每例抽取2份等量全血，抗凝），HbA1c含量為4.3%～12.8%，其中3例微粒色譜法檢測(cè)HbA1c無讀取結(jié)果（親和層析法顯示糖化血紅蛋白總量＞19%），其他數(shù)據(jù)均在儀器可讀范圍之內(nèi)，故3例標(biāo)本作廢。實(shí)際檢測(cè)患者例數(shù)為134例，其中 HbA1c≤ 6.5%的患者38例，6.5% ＜HbA1c含量＜7.5%的患者45例，HbA1c含量≥7.5%的患者51例。

2.2 HbA1c濃度測(cè)定結(jié)果

采用3種不同的方法在HbA1c含量≤6.5%的人群、6.5%＜HbA1c含量＜7.5%的人群、HbA1c≥7.5%的人群中檢測(cè)HbA1c的濃度，經(jīng)方差分析組內(nèi)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3種方法測(cè)定HbA1c含量組內(nèi)比較（%）

2.3 3種不同方法測(cè)定HbA1c之間的相關(guān)性

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件將HPLC法所測(cè)HbA1c含量為目標(biāo)值與微粒色譜法、層析法所測(cè)HbA1c含量為試驗(yàn)值進(jìn)行一元線性回歸后，微粒色譜法與HPLC法數(shù)據(jù)分析的相關(guān)回歸方程為Y=1.006 X+0.213，相關(guān)指數(shù)r2=0.885；層析法與HPLC法數(shù)據(jù)分析的回歸方程Y=0.923 X+0.338，相關(guān)指數(shù)r2=0.917。微粒色譜法、層析法與HPLC法所測(cè)數(shù)據(jù)存在良好的相關(guān)性。見圖1。

圖1 3種方法測(cè)定HbA1c的相關(guān)性比較

2.4 HbA1c回歸分析

在3組不同HbA1c含量≤6.5%、6.5%＜HbA1c含量＜7.5%、HbA1c含量≥7.5%人群中，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件將HPLC法所測(cè)HbA1c含量為目標(biāo)值，與微粒色譜法、層析法所測(cè)數(shù)據(jù)為試驗(yàn)值分別進(jìn)行一元線性回歸后，數(shù)據(jù)顯示對(duì)不同的糖尿病人群，3種方法檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)良好的相關(guān)性?；貧w方程見表2?；貧w散點(diǎn)圖見圖2～4。

3 討論

糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。血糖易受飲食、運(yùn)動(dòng)、時(shí)間、情緒的影響，而且只能反映患者即時(shí)的血糖水平和當(dāng)時(shí)的身體狀況。因此，臨床上血糖不作為評(píng)價(jià)疾病控制程度的標(biāo)準(zhǔn)。GHb是血紅蛋白與葡萄糖結(jié)合后的產(chǎn)物占全部血紅蛋白的比例，HbA1c是紅細(xì)胞中血紅蛋白與葡萄糖緩慢、持續(xù)且不可逆進(jìn)行非酶促蛋白糖化反應(yīng)的產(chǎn)物[4]。HbA1c的最大優(yōu)勢(shì)在于其不受血糖濃度即時(shí)波動(dòng)的影響，根據(jù)HbA1c含量可推算出測(cè)定前8～12周的平均血糖水平[5-6]。2010年，在美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)發(fā)布的《糖尿病診療指南》中，已將HbA1c含量＞6.5%優(yōu)先作為診斷糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)[7]。因此，國(guó)內(nèi)學(xué)者也逐漸將HbA1c的檢測(cè)作為篩選、診斷、監(jiān)控糖尿病人群的有效指標(biāo)[8-9]。

表2 不同人群用3種方法測(cè)定HbA1c含量的回歸分析

圖2 HbA1c含量≤6.5%人群用3種方法測(cè)定HbA1c含量的相關(guān)性比較

圖3 6.5%＜HbA1c含量＜7.5%人群用3種方法測(cè)定HbA1c含量的相關(guān)性比較

圖4 HbA1c含量＞7.5%人群用3種方法測(cè)定HbA1c含量的相關(guān)性比較

本研究隨機(jī)選取了我院內(nèi)分泌門診和在內(nèi)分泌病區(qū)住院的137例2型糖尿病患者為研究對(duì)象，為了保證試驗(yàn)的合理性、減少誤差以及獲得更多檢測(cè)的樣本，共獲得274份標(biāo)本（每例抽取2份等量全血，EDTA-K2抗凝），涵蓋了＞23歲各年齡段的人群，病史包括初發(fā)糖尿病患者，又有糖尿病病史長(zhǎng)達(dá)51年的患者。僅3例患者血清采用NycoCard readerⅡ床旁HbA1c分析儀（微粒色譜法）的數(shù)據(jù)無法讀取，超過了該系統(tǒng)測(cè)量線性范圍的3%～18%。其他標(biāo)本均被儀器接受，將3對(duì)標(biāo)本移除后有效標(biāo)本為268例。根據(jù)HPLC法測(cè)定的糖化血紅蛋白值將患者分為3組：HbA1c含量≤6.5%的患者38例；6.5%＜HbA1c含量＜7.5%的患者45例；HbA1c含量≥7.5%的患者51例，分組的標(biāo)準(zhǔn)是基于2010年美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)將HbA1c作為診斷糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)，診斷切點(diǎn)確定為6.5%[8，10]。研究結(jié)果顯示：①各組人群采用3種不同的檢測(cè)手段，所得數(shù)據(jù)組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），3種檢測(cè)方法所測(cè)結(jié)果一致、可靠。②全組利用微粒色譜法所測(cè)HbA1c數(shù)據(jù)與HPLC法有良好的相關(guān)性，Y= 1.006 X+0.213，相關(guān)指數(shù)r2=0.885。親和層析法與HPLC法測(cè)定結(jié)果亦呈良好的線性關(guān)系Y=0.923 X+ 0.338，相關(guān)指數(shù)r2=0.917，說明本試驗(yàn)從對(duì)象的篩選、血標(biāo)本的采集、血標(biāo)本的儲(chǔ)存、血漿的分離以及整個(gè)檢驗(yàn)過程合理、可信。③在不同HbA1c含量的人群中，3種方法檢測(cè)結(jié)果之間呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。當(dāng)然，3種檢測(cè)方法亦存在微小偏差（相關(guān)指數(shù)達(dá)到0.999以上為完全相關(guān)），但仍顯示相關(guān)良好，可被臨床接受，證實(shí)糖化血紅蛋白的濃度大小不影響3種儀器的檢測(cè)結(jié)果。

3種檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)：①臨床上普遍認(rèn)為HPLC法測(cè)定HbA1c準(zhǔn)確、可靠，是檢測(cè)HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)的儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，基層醫(yī)院普及困難。而且HPLC法操作復(fù)雜、成本高、測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，需將標(biāo)本收集起來成批檢測(cè)，醫(yī)生和患者無法得到即時(shí)的檢測(cè)報(bào)告，不利于門急診及臨床科室危急患者病情的監(jiān)測(cè)[11]。②新型的 NycoCard readerII床旁 HbA1c分析儀檢測(cè)儀已通過歐洲糖化血紅蛋白參比實(shí)驗(yàn)室（ERL）的鑒定和美國(guó)FDA的認(rèn)證，儀器價(jià)格低廉。其采用微粒色譜法，操作簡(jiǎn)便、全血量5 μL、檢測(cè)速度僅需4～5 min，能滿足基層醫(yī)院門急診或臨床科室的使用。從本組的測(cè)量結(jié)果看，與HPLC法的檢測(cè)結(jié)果一致，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③親和層析法檢測(cè)的是糖化血紅蛋白總量，亦需成批檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與HPLC法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，亦可作為糖尿病監(jiān)測(cè)的理想方法[12-13]。

研究顯示，血糖與HbA1c呈正相關(guān)，HbA1c越高表明血糖與血紅蛋白結(jié)合的就越多，病情沒有得到很好的控制[14-16]。HbA1c雖然反映了一個(gè)階段的平均血糖水平，但它并不能代替每日飲食前后的血糖監(jiān)測(cè)，醫(yī)生根據(jù)患者的病史、飲食、運(yùn)動(dòng)等情況結(jié)合即時(shí)的血糖水平調(diào)整藥物，HbA1c結(jié)合血糖的監(jiān)測(cè)，可以為糖尿病患者指導(dǎo)更加適合的診療方案并給出個(gè)體化的健康指導(dǎo)。如果單純地將HbA1c作為診斷糖尿病的診斷依據(jù)仍有明顯的不足[17]，血液透析、慢性溶血性貧血、脾功能亢進(jìn)的患者則不能單用HbA1c的檢測(cè)結(jié)果判定是否診斷為糖尿病。所以，HbA1c檢測(cè)時(shí)需詢問病史，排除慢性疾病的影響。有學(xué)者建議，如果糖尿病患者血糖近期控制得很好，血糖平穩(wěn)在5.5～6.5 mmol/L，那么每年可檢測(cè)2～3次HbA1c；而對(duì)于那些正在進(jìn)行胰島素治療的患者或近期血糖控制不穩(wěn)定的患者，建議3～4個(gè)月進(jìn)行一次HbA1c檢測(cè)[18]。

本研究證實(shí)了新型的床旁HbA1c分析儀測(cè)定HbA1c的可靠性，微粒色譜法、親和層析法可作為高效液相色譜測(cè)定HbA1c的有效補(bǔ)充。其操作簡(jiǎn)單、快捷，適合門、急診及床旁患者快速檢測(cè)。

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Analysis on the consistency and reliability of glycated hemoglobin tested by three different methods

JING Danqing CHEN Yujing YIN Shinan JIA Zhe
Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital of PLA General Hospital,Beijing 100048,China

Objective To discuss the consistency and reliability of Glycated hemoglobin determined by particles of chromatography,affinity chromatography and high performance liquid chromatography (HPLC)method.Methods 137 diabetics received ambulatory treatment or hospitalized in the First Affiliated Hospital of PLA General Hospital from June 2014 to September 2014 were selected as research objects,they were drew fasting double whole blood sample. Particles of chromatography,affinity chromatography and HPLC method was separately used to determine glycated hemoglobin A1(HbA1c).Each specimen was measured twice.Taking HbA1ctest by HPLC as gold standard,137 diabetics were divided into three groups:group one(HbA1clevel≤6.5%),group two(6.5%＜HbA1clevel＜7.5%)and group three (HbA1clevel≥ 7.5%).Whether there was statistical difference among three groups was analysed.Taking HbA1ctest by Bio-Rad D10 HPLC method as target system,particles of chromatography and affinity chromatography as testing systems,regression equation was established,the degree of deviation between the results of target system and testing system was analysed.Results There was no significant difference in results of HbA1c among 3 methods(P＞0.05).Regression analysis showed that two methods had a good linear relationship between particles of chromatography and HPLC method,Y=1.006 X+0.213,r2=0.885;There was also a good linear relationship between affinity chromatography and HPLC method,Y=0.923 X+0.338,r2=0.917.The results of three methods showed good correlation to different diabetics.Conclusion Both particles of chromatography and affinity chromatography can offer reliable data of small deviation for clinic,compared to HPLC method.The results can be accepted by clinic.Particles of chromatography is simple and fast to operate,which can provide convenience for clinical rapid diagnosis.

Glycated hemoglobin;Ionic exchange high performance liquid chromatography;Particles of chromatography;Affinity chromatography

R331.1+41

A

1673-7210（2015）11（c）-0091-04

2015-08-06本文編輯：趙魯楓）

解放軍總醫(yī)院科研課題項(xiàng)目（201405）。

荊丹清（1971-），女，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，主要從事糖尿病、甲亢、骨質(zhì)疏松等內(nèi)分泌疾病的診治。