孫玉紅

安徽省阜陽市人民醫(yī)院藥劑科，安徽阜陽 236300

螺旋藻提取物對S180荷瘤小鼠抑瘤作用的研究

孫玉紅

安徽省阜陽市人民醫(yī)院藥劑科，安徽阜陽 236300

目的 研究螺旋藻提取物對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用以及對荷瘤小鼠胸腺脾臟重量的影響。 方法將腋下移植了S180腹水瘤的昆明種小鼠根據(jù)性別分別分成模型組（生理鹽水組）、環(huán)磷酰胺組（30 mg/kg）、螺旋藻提取物（80、40、20、10、5 mg/kg）組，每組10只，連續(xù)灌胃給藥10 d。第11天小鼠稱重，脫臼處死，摘取瘤塊，分離，稱重，計算抑瘤率。摘取胸腺、脾臟，稱量濕重，計算胸腺脾臟指數(shù)。 結(jié)果環(huán)磷酰胺組瘤重較模型組低（P＜0.05），螺旋藻提取物高濃度（80 mg/kg）組瘤重與模型組無差異（P＞0.05），螺旋藻提取物低濃度（40、20、10、5 mg/kg）組瘤重較模型組低（P＜0.05），但仍比環(huán)磷酰胺組高（P＜0.05）。螺旋藻提取物低濃度組（10、20、10、5 mg/kg）抑瘤率明顯高于高濃度（80 mg/kg）組（P＜0.05），但仍低于環(huán)磷酰胺組（P＜0.05）。 結(jié)論螺旋藻提取物的抑瘤作用與濃度有關(guān)，低濃度的抑瘤作用比高濃度顯著，其直接治療效果雖不如環(huán)磷酰胺明顯，但其能很好的提高機體免疫器官的重量，促進機體免疫器官的發(fā)育。

螺旋藻；S180荷瘤小鼠；抑瘤作用

螺旋藻 （Spirulina）是一類沒有細(xì)胞核的低等植物，屬于藍(lán)藻（Cyanophyta）、顫藻科（Oscillatoraceae）、螺旋藻屬。螺旋藻是目前地球上人類已知的營養(yǎng)成分最豐富均衡的生物，含有大量蛋白質(zhì)、纖維素、必需氨基酸和礦物質(zhì)等豐富均衡的營養(yǎng)成分和多種活性物質(zhì)，具有蛋白質(zhì)含量高、繁殖速度快等特點，是一種很好的純天然食品[1]。螺旋藻含有藻藍(lán)蛋白、多糖、β-胡蘿卜素、γ-亞麻酸等多種生物活性物質(zhì)，這些物質(zhì)以其特有的營養(yǎng)和保健價值受到廣泛的重視。而在這眾多的活性物質(zhì)中，藻藍(lán)蛋白和多糖是目前研究的熱點。藻藍(lán)蛋白具有一定的醫(yī)療價值，美國哈佛醫(yī)院Schwartz等[2]發(fā)現(xiàn)螺旋藻藻藍(lán)蛋白對癌細(xì)胞有抑制作用。蔡心涵等[3]研究了螺旋藻藻藍(lán)蛋白對激光療法的增敏作用。近年來大量研究結(jié)果已經(jīng)表明，螺旋藻多糖具有抗輻射和抗腫瘤作用，此外還有提高核酸內(nèi)切酶的活性、促進修復(fù)和提高機體免疫力的功效。劉力生等[4]報道了螺旋藻多糖具有明顯的體外抑瘤作用。吳潔等[5]研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻多糖能顯著提高免疫功能低下小鼠NK細(xì)胞殺傷力，并能明顯刺激ConA誘導(dǎo)的體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。大量文獻綜述以及實驗證明，螺旋藻具有很好的抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、保肝、促進細(xì)胞生長、清除自由基等多種生理活性[6-11]。究竟是哪種成分起到主要作用還有待進一步的實驗驗證。我國對螺旋藻的利用僅處于其保健作用，作為藥物使用的研究極少。本實驗以S180荷瘤小鼠為實驗?zāi)Ｐ?，通過計算其抑瘤率證明了螺旋藻提取物具有明顯的抗腫瘤作用，通過螺旋藻提取物抗腫瘤藥效學(xué)動物實驗探究螺旋藻提取物對S180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用，從而對大規(guī)模生產(chǎn)的螺旋藻提取物的藥效學(xué)給予驗證。通過測定其胸腺脾臟的重量證明螺旋藻提取物對免疫器官的增長具有一定的促進作用，為螺旋藻的臨床應(yīng)用提供了一定的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

動物和瘤株:選擇10周齡左右健康昆明小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由山東綠葉制藥有限公司提供，合格證編號：SCXK(魯)20140009。S180瘤株由煙臺大學(xué)生命科學(xué)院提供。

試劑及藥品：螺旋藻提取物為筆者實驗制備，依據(jù)相關(guān)文獻[12]，通過高速離心、超濾、噴霧干燥后得到粗提取物。環(huán)磷酰胺為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)（批號:14021525），是一種烷化劑，主要用于腫瘤免疫，對多種腫瘤有明顯的抑制作用，為本研究的陽性對照藥。實驗中用生理鹽水配成0.2 mg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞的復(fù)蘇 從液氮中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動，盡快融化。從37℃水浴中取出凍存管，取出細(xì)胞懸液，加到離心管并加入10倍以上細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻，以1000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度。接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.2 S180腹水瘤傳代細(xì)胞的制備 取腫瘤細(xì)胞按1∶2的比例稀釋，抽取0.3 mL注射到健康小鼠腹腔。每隔7 d進行1次腹水傳代，傳代4～5次后腫瘤細(xì)胞趨于穩(wěn)定。

1.2.3 制備S180腫瘤動物模型 小鼠肉瘤S180瘤株腹腔接種傳代，待腹水生長旺盛時，無菌條件下抽取腹水，用滅菌的生理鹽水按腹水∶生理鹽水=1∶7稀釋。采用臺盼藍(lán)染色法，取0.2 mL細(xì)胞懸液加等量0.4%臺盼藍(lán)溶液，充分混勻，立即取少許于載玻片上，覆于蓋玻片，用低倍鏡計數(shù)至少200個細(xì)胞，計算細(xì)胞活力=(總細(xì)胞數(shù)-著色細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100%。本實驗抽取適用的小鼠腹水細(xì)胞活力約為1.05×107個/mL。無菌條件下取細(xì)胞計數(shù)為1.05×107個/mL的S180腹腔積液混懸液，每只小鼠右前肢腋窩皮下接種0.2 mL。整個操作過程30 min內(nèi)完成，24 h后隨機分組。

1.2.4 動物分組及給藥 接種后24 h，隨機分成14組，雌性7組，雄性7組，每組10只，分開放置，分別編號為 A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、E1、E2、F1、F2、G1、G2，其中1為雌性，2為雄性。A組為模型組（生理鹽水組）每天給予生理鹽水0.5 mL灌胃；B、C、D、E、F組為螺旋藻提取物各劑量組，分別按每日5、10、20、40、80 mg/kg灌胃；G組為環(huán)磷酰胺陽性對照組，每日給予30 mg/kg環(huán)磷酰胺生理鹽水溶液3 mL灌胃。連續(xù)給藥10 d。

1.3 指標(biāo)檢測

末次給藥24 h后，小鼠稱重，脫臼處死，摘取瘤塊，分離，稱重，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重）/模型組平均瘤重×100%。摘取胸腺、脾臟，電子天平稱量濕重，計算胸腺、脾臟指數(shù)。小鼠胸腺（脾臟）指數(shù)=小鼠胸腺（脾臟）重量/小鼠體重×10。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況

實驗過程中小鼠活動正常，精神狀態(tài)良好，毛色有光澤，其中，螺旋藻提取物10、20 mg/kg劑量組小鼠明顯比較活躍；螺旋藻提取物80 mg/kg劑量組小鼠雌性組意外死亡2只，且未死亡的小鼠精神狀態(tài)不佳，消瘦，腫瘤較大，抑制其行動，表現(xiàn)出異常；環(huán)磷酰胺組小鼠精神狀態(tài)最佳，腫瘤與其他組比較明顯較小，小鼠正?；顒?，且小鼠比較活躍；生理鹽水組小鼠出現(xiàn)活動減少、消瘦、精神萎靡、毛色不清潔，且小鼠腫瘤生長最大，有向腹部、頭部轉(zhuǎn)移的趨勢，小鼠開始出現(xiàn)張口呼吸的狀態(tài)。

2.2 各組小鼠腫瘤重量比較

從實驗數(shù)據(jù)可知，螺旋藻提取物各劑量組與環(huán)磷酰胺組平均瘤重均小于生理鹽水組，除螺旋藻提取物80 mg/kg組外，其他組瘤重與生理鹽水組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且環(huán)磷酰胺組瘤重最低（P＜0.05）。提示螺旋藻提取物各劑量組均有很好的抑瘤作用，但其抑瘤作用弱于環(huán)磷酰胺。在雌雄小鼠間瘤重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1 雌雄各組小鼠腫瘤重量比較（g，）

表1 雌雄各組小鼠腫瘤重量比較（g，）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05;與環(huán)磷酰胺組比較，#P＜0.05

組別 雄性瘤重 雌性瘤重生理鹽水組螺旋藻提取物5 mg/kg組螺旋藻提取物10 mg/kg組螺旋藻提取物20 mg/kg組螺旋藻提取物40 mg/kg組螺旋藻提取物80 mg/kg組環(huán)磷酰胺組2.3695±0.0972 1.3566±0.0632*#1.1004±0.0872*#1.1602±0.0542*#1.1126±0.0672*#1.4590±0.0773#0.7896±0.0425*2.1253±0.0863 1.1899±0.0873*#1.0940±0.0643*#1.034±0.0538*#1.1796±0.0584*#1.7700±0.0483#0.7627±0.386*

圖1 雌雄小鼠腫瘤重量比較

2.3 各組小鼠抑瘤率比較

由結(jié)果可知，與環(huán)磷酰胺相比螺旋藻提取物的抑瘤率較低（P＜0.05）。當(dāng)螺旋藻提取物濃度為5、10、20、40 mg/kg時其抑瘤效果較好，且雌雄小鼠差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)螺旋藻提取物濃度達80 mg/kg時，其對腫瘤的抑制作用有明顯下降的趨勢，實驗中螺旋藻提取物80 mg/kg雌性組有2只小鼠死亡且剩余未死亡雌性小鼠和雄性小鼠精神狀態(tài)都不佳，且腫瘤較大。推測與螺旋藻提取物對實驗小鼠的腫瘤抑制作用下降有關(guān)。由抑瘤率結(jié)果可見，當(dāng)螺旋藻提取物濃度處于5～40 mg/kg時，其對腫瘤的抑制作用略有上升，當(dāng)螺旋藻提取物濃度繼續(xù)增大時，其抑瘤率有下降的趨勢。見表2、圖2。

2.4 各組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)比較

從實驗結(jié)果可知，在雌性和雄性小鼠中，螺旋藻提取物5、10、20、40 mg/kg劑量組對小鼠的免疫器官均有一定的促進作用，與生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；環(huán)磷酰胺組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)低于螺旋藻提取物各劑量組（P＜0.05），小鼠性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在雌性小鼠80 mg/kg劑量組中，小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均有降低的趨勢，這與實驗中雌性小鼠80 mg/kg劑量組死亡的現(xiàn)象有一定的關(guān)系。見表3、圖3、4。

表2 各組小鼠抑瘤率比較（%）

圖2 各組小鼠抑瘤率比較

表3 各組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)比較（mg/g，）

表3 各組小鼠胸腺及脾臟指數(shù)比較（mg/g，）

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05;與環(huán)磷酰胺組比較，#P＜0.05

組別 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)生理鹽水組雌性雄性螺旋藻提取物5mg/kg組雌性雄性螺旋藻提取物10 mg/kg組雌性雄性螺旋藻提取物20 mg/kg組雌性雄性螺旋藻提取物40 mg/kg組雌性雄性螺旋藻提取物80 mg/kg組雌性雄性環(huán)磷酰胺組雌性雄性85.4972±18.8129 66.9745±11.4376 166.6436±24.3421 141.6234±12.8754 95.0561±12.2915*#79.6508±15.1418*#159.9229±23.6034*#169.8730±18.9987*#90.8821±13.7692*#87.5270±15.6512*#204.9045±21.9872*#197.2603±16.9532*#90.7725±17.4361*#81.5509±10.1915*#172.3534±19.1346*#164.2902±20.7397*#94.6752±19.9408*#76.6238±12.3421*#156.1956±15.9703*#158.6817±23.2542*#93.9858±17.9385#75.3190±13.3163#165.0890±11.9776#153.4392±15.6632#64.8279±14.3342*48.4844±14.5741*145.1561±22.7761*143.5057±19.6555*

圖3 各組小鼠胸腺指數(shù)比較

圖4 各組小鼠脾臟指數(shù)比較

3 討論

在螺旋藻提取物濃度處于5～40 mg/kg時，其對腫瘤的抑制作用是逐漸上升的，且螺旋藻提取物劑量組對小鼠胸腺、脾臟等免疫器官均有良好的促進作用；當(dāng)螺旋藻提取物濃度繼續(xù)增大時，其抑瘤率下降。在本實驗中對雌性和雄性小鼠進行了分組，目的是研究螺旋藻提取物對不同性別小鼠的作用是否有差別，通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)螺旋藻提取物濃度處于5～40 mg/kg時，對不同性別小鼠的抗腫瘤作用沒有明顯差異。當(dāng)螺旋藻提取物濃度為80 mg/kg時，雌性小鼠有死亡現(xiàn)象，雄性小鼠雖未死亡但是有明顯的消瘦和精神不振的現(xiàn)象，后期實驗數(shù)據(jù)顯示其對不同性別小鼠免疫器官的影響無明顯差別。實驗中螺旋藻提取物濃度過高時其抑制腫瘤的作用明顯下降且有一定的毒性。由此推測高劑量的螺旋藻提取物能夠產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性作用，引發(fā)機體免疫功能下降，由此引發(fā)小鼠的死亡。這為繼續(xù)探究螺旋藻提取物抗腫瘤藥效劑量有重要的意義。對以后螺旋藻提取物抗腫瘤作用最佳劑量的繼續(xù)探究有很好的參考價值。

螺旋藻中主要的抗腫瘤活性物質(zhì)是藻藍(lán)蛋白和多糖，研究表明，螺旋藻多糖、藻藍(lán)蛋白在減輕對肺癌的化療、放療副作用、升高白細(xì)胞方面均有確切效果[13]。于虹等[14]及杜玲等[15]報道螺旋藻多糖在一定濃度范圍內(nèi)對S180荷瘤具有一定的抑制作用，螺旋藻多糖能增加脾臟和胸腺的重量，并通過全面調(diào)節(jié)機體的免疫功能，刺激T細(xì)胞、NK細(xì)胞等功能來達到控制和殺滅腫瘤細(xì)胞的目的。劉永舉等[16]研究也表明，螺旋藻多糖能通過提高小鼠的免疫功能來抑制腫瘤的生長。大量文獻綜述以及實驗證明，螺旋藻藻藍(lán)蛋白具有很好的抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、降血糖、血脂、免疫調(diào)節(jié)、保肝、促進細(xì)胞生長、清除自由基等多種生理活性[6-11，17-19]。在藻藍(lán)蛋白的抗腫瘤實驗中，大量的體外抗腫瘤實驗證明，藻藍(lán)蛋白對Hela細(xì)胞、肝癌細(xì)胞SMMC-7721等都有很好的抑制作用[20]。在藻藍(lán)蛋白的體內(nèi)抗腫瘤實驗中，李冰等[21]通過實驗探究了藻藍(lán)蛋白以及多糖對小鼠腫瘤的抑制作用。實驗以S180荷瘤小鼠為實驗?zāi)Ｐ?，通過計算其抑瘤率證明螺旋藻提取物具有明顯的抗腫瘤作用。本研究顯示，通過螺旋藻提取物劑量組與環(huán)磷酰胺組比較發(fā)現(xiàn)，螺旋藻提取物能夠很好地提升胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，提高機體免疫器官的重量，促進機體免疫器官的發(fā)育，從而增強機體免疫機能，而環(huán)磷酰胺組胸腺脾臟指數(shù)均有下降的趨勢，說明環(huán)磷酰胺對免疫器官有損傷，螺旋藻提取物很好地避免化學(xué)藥品對機體免疫器官損傷的現(xiàn)象，具有良好的開發(fā)前景。

本實驗提示螺旋藻提取物主要是通過增強和恢復(fù)機體的免疫網(wǎng)絡(luò)功能來達到抑制腫瘤細(xì)胞的作用，但具體是藻藍(lán)蛋白還是螺旋藻多糖發(fā)揮作用還需要進一步的實驗驗證。螺旋藻提取物在免疫化療中具有相當(dāng)好的應(yīng)用前景。螺旋藻抑制腫瘤細(xì)胞生長的有關(guān)機制目前正在研究，其作為天然植物在我國資源豐富，但我國對螺旋藻的利用僅處于其保健作用，作為藥物使用的研究極少。目前隨著螺旋藻的提取純度提高，其臨床研究及應(yīng)用將會進一步深入。

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Antitumor role of the extraction from spirulina in S180-tumor bearing mice

SUN Yuhong
Department of Pharmacy,Fuyang People's Hospital,Anhui Province,Fuyang 236300,China

Objective To study the antitumor activity and its influence of the spirulina extraction on the weight of thymus and spleen of S180 tumor-bearing mice.Methods S180-tumor bearing mice were established and randomly divided into model group,Cyclophosphamide and spirulina extraction(80,40,20,10,5 mg/kg)groups,according to the gender,each of which contained 10 mice.Mice from each group were administrated daily via gavage with normal saline, Cyclophosphamide(30 mg/kg)or the extraction from spirulina(80,40,20,10,5 mg/kg)respectively for 10 days.At day 11,mice were decapitated after recording the weight,then the tumor tissues were detached and weighted for the weight as well as the tumor inhibition rates were recorded.Moreover,the wet weight of thymus and spleen of each mouse was recorded for thymus index calculation.Results The average tumor weight of Cyclophosphamide group was significantly lower than that of model group (P＜0.05),and there was no obvious change of average tumor weight between the spirulina extract group(80 mg/kg)and model group(P＞0.05).Besides,the tumor weight of spirulina extract group(40,20, 10,5 mg/kg)was lower than that of model group(P＜0.05),but still higher than that of Cyclophosphamide group(P＜0.05).The tumor inhibition rates of the spirulina extract(40,20,10,5 mg/kg)group was significantly higher than that of corresponding high concentration(80 mg/kg)group(P＜0.05),but still lower than that of Cyclophosphamide group(P＜0.05).Conclusion The anti-tumor effect of spirulina extraction in tumor mice model is determined by the concentration.Low-concentration spirulina extraction shows better anti-tumor effect than high-concentration spirulina extraction. Though low-concentration spirulina extraction exhibit less direct anti-tumor effect than that of Cyclophosphamide,it can promote the growth of immune organs and further indirectly improve the function of immunological system of mice bearing with cancer.

Spirulina;S180-tumor bearing mice;Antitumor

R282.77

A

1673-7210（2015）11（c）-0043-05

2015-08-20本文編輯：程 銘）