劉 曄 邢文婧 李思佳

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，黑龍江哈爾濱 150081

下調(diào)15-LOX-2表達對缺氧狀態(tài)下肺動脈平滑肌細胞的影響

劉 曄 邢文婧 李思佳

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室，黑龍江哈爾濱 150081

目的 探討下調(diào)15脂氧酶-2（15-LOX-2）對缺氧狀態(tài)下肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）的影響。方法 將PASMCs隨機分為四組：正常對照組、缺氧組、scramble組、15-LOX-2 siRNA組。實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（Real time PCR）檢測15-LOX-2表達；噻唑藍比色法（MTT）檢測PASMCs增殖情況；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測15-羥基-二十碳四烯酸（15-HETE）；分析活性氧（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）的表達變化。 結(jié)果缺氧增加15-LOX-2、15-HETE和ROS的產(chǎn)生，促進PASMCs增殖，減少SOD活性，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。缺氧下轉(zhuǎn)染15-LOX-2 siRNA可減少15-LOX-2、15-HETE和ROS的產(chǎn)生，抑制PASMCs增殖，增加SOD活性，與缺氧組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論15-LOX-2下調(diào)可通過減少15-HETE產(chǎn)生、調(diào)節(jié)氧化/抗氧化平衡、調(diào)控PASMCs的異常增殖，從而延緩缺氧性肺血管收縮的病理進程。

15-脂氧酶-2；肺動脈平滑肌細胞；15-羥基-二十碳四烯酸；氧化/抗氧化

缺氧可誘導(dǎo)缺氧性肺血管收縮（HPV）發(fā)生[1]。哺乳動物由于適應(yīng)環(huán)境而出現(xiàn)HPV。通常一系列肺部疾病如高山病，外科手術(shù)如肺移植、單肺麻醉、應(yīng)激狀態(tài)等創(chuàng)傷可誘發(fā)HPV[2]。HPV是導(dǎo)致肺動脈高壓乃至肺源性心臟病甚至誘發(fā)多臟器衰竭的重要原因[3-4]。研究提示缺氧可促進15脂氧酶-2（15-LOX-2）表達，其產(chǎn)物15-羥基-二十碳四烯酸（15-HETE）可促進缺氧肺動脈環(huán)發(fā)生收縮反應(yīng)，提示15-LOX-2與HPV關(guān)系密切[5-6]。本研究自2011年1月～2014年12月深入探討了下調(diào)15-LOX-2對缺氧狀態(tài)下肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

15-HETE酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自美國Roche公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國invitrogen公司；細胞培養(yǎng)試劑購自美國Hyclone公司；siRNA引物由美國QIAGEN公司合成，引物合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成；siRNA沉默構(gòu)建試劑盒購自美國Amaxa Biosystems Technology公司。

1.2 實驗動物

選取健康雄性Wistar大鼠，月齡2個月，SPF級，體重（250±20）g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院實驗動物中心（合格證號2001024）。本研究遵循本單位實驗動物保護和使用指南，并經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)進行。

1.3 方法

1.3.1 肺動脈平滑肌細胞培養(yǎng)和分組 取出大鼠肺動脈，進行PASMCs體外原代培養(yǎng)[7]。取3～8代對數(shù)生長期PASMCs細胞用于實驗，隨機分為4組，分別為正常對照組、缺氧組、scramble組和15-LOX-2 siRNA組。缺氧組細胞置于細胞乏氧箱中，通入含92%N2、3% O2、5%CO2的混合氣體，37℃條件下培養(yǎng)24 h。

1.3.2 轉(zhuǎn)染15-LOX-2 siRNA 15-LOX-2 siRNA引物序列：5'-ATA TCT GCC AAC GTG CTA CGT-3'，siRNA陰性對照引物序列：5'-ACT TCC GTA ATG GAC CTA CGT-3'，轉(zhuǎn)染步驟依照試劑盒說明進行。轉(zhuǎn)染后放入細胞乏氧箱中培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)試驗。

1.3.3 實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（Real time PCR）檢測15-LOX-2 mRNA的表達 用Trizol試劑提取各組PASMCs細胞，進行Real-time PCR檢測。引物序列見表1。反應(yīng)條件：55℃1 min，循環(huán)條件為92℃30 s，50℃45 s，72℃35 s，共進行35個循環(huán)。進行數(shù)據(jù)收集，利用PCR反應(yīng)儀軟件，將磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為參照，根據(jù)熒光定量，計算出所有樣品以及標(biāo)準(zhǔn)品的起始循環(huán)數(shù)（CT），以標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為依據(jù)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)2-△Ct法進行半定量分析。

表1 引物序列

1.3.4 15-HETE和氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 利用ELISA法檢測15-LOX-2產(chǎn)物15-HETE表達。分光光度法檢測各組SOD活性和活性氧（ROS）含量變化。

3月16日，福建省食品安全委員會辦公室和省食品藥品監(jiān)管局下發(fā)《福建省2018年食品生產(chǎn)加工小作坊示范點創(chuàng)建及考核驗收工作方案》?！斗桨浮诽岢?，在鞏固提升2017年小作坊示范點創(chuàng)建成果的基礎(chǔ)上，到2018年底，全省新建成100家小作坊示范點，通過示范點創(chuàng)建，打造一批生產(chǎn)過程管控嚴(yán)格、食品安全有效保障的標(biāo)桿單位，形成可復(fù)制、可推廣的小作坊示范典型，基本形成一點帶一片的良好示范帶動格局，引導(dǎo)和推動福建省小作坊規(guī)范生產(chǎn)、健康發(fā)展。此外，福建省從2018年省級食品安全專項資金中安排200萬元，通過以獎代補的方式對評選確定為示范點的小作坊（不含廈門）給予補助，補助標(biāo)準(zhǔn)為2萬元/家。

1.3.5 噻唑藍比色法（MTT）法檢測PASMCs增殖變化

利用MTT法檢測各組PASMCs增殖的變化。收集對數(shù)生長期PASMCs細胞，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液以5×103個的細胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄去上清，隨機分為4組：正常對照組、缺氧組、scramble組、15-LOX-2 siRNA組，處理方法同上。24 h后待測孔中加入20 μL無菌MTT，每個時間點設(shè)3個復(fù)孔；繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，徹底去除上清，加入DMSO 150 μL/孔，搖床振蕩10 min，至紫色結(jié)晶充分溶解后，置酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定其吸光度（A）值，計算各組增殖率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組樣本均數(shù)的比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組15-LOX-2 mRNA的表達變化

缺氧可上調(diào)PASMCs中15-LOX-2 mRNA表達，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。15-LOX-2 siRNA可降低缺氧PASMCs中15-LOX-2，與缺氧組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組15-LOX-2 mRNA的表達變化

缺氧可增加PASMCs中15-HETE生成，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。下調(diào)15-LOX-2后，可降低缺氧PASMCs中15-HETE生成，與缺氧組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組15-HETE的生成情況

2.3 下調(diào)15-LOX-2對缺氧狀態(tài)下PASMCs增殖的影響

缺氧可促進PASMCs顯著增殖，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。下調(diào)15-LOX-2可減少缺氧PASMCs的增殖，與缺氧組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 下調(diào)15-LOX-2對缺氧狀態(tài)下PASMCs增殖的影響

2.4 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)分析

缺氧可促進PASMCs中ROS產(chǎn)生，降低SOD含量，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。下調(diào)15-LOX-2可抑制ROS的產(chǎn)生，增加SOD含量，與缺氧組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)分析（）

表2 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)分析（）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與缺氧組比較，#P＜0.05；15-LOX-2：15脂氧酶-2；ROS：活性氧；SOD：超氧化物歧化酶

組別 ROS SOD正常對照組缺氧組Scramble組15-LOX-2 siRNA組107.5±35.6 291.9±27.5*286.5±31.2*128.6±41.7#117.3±11.6 47.6±6.1*52.3±5.3*99.5±15.2#

3 討論

缺氧指組織供氧不足或用氧障礙，從而引起其代謝、功能以致形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的病理過程。缺氧時機體的功能代謝發(fā)生變化，呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、腦中樞、組織細胞都發(fā)生代償性反應(yīng)甚至功能障礙。缺氧可以通過直接作用于PASMC膜，也可以直接促進PASMCs增生，引起機體血管緊張素、一氧化氮、細胞因子以及離子濃度的變化，促進HPV發(fā)生，各器官代謝、功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化，可誘發(fā)肺動脈高壓、心力衰竭[8-10]。

15-LOX-2是20世紀(jì)90年代被新鑒定出的同工酶[11]，與其另外一種同工酶15-LOX-1在分布以及生物學(xué)特性存在不同，15-LOX-1廣泛分布于身體各組織不同，15-LOX-2組織分布局限，僅在mRNA水平探查到存在于前列腺、皮膚、角膜等處[12]。而在前期研究中證實15-LOX-2在正常肺組織中不表達，但在HPV中表達顯著增加[4]。15-LOX-2主要作用于花生四烯酸生成15-HETE[13]。15-LOX-2和其作用產(chǎn)物在炎癥過程中起著重要的作用。它們不僅可以調(diào)控白三烯的形成還可以抑制白三烯的生理功能[14-16]。它可以調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)引起的中性粒細胞的趨化作用[13]，其催化生成的產(chǎn)物15-HETE不僅可以作為脂氧素的底物，還可以抑制人類中性粒細胞超氧陰離子的產(chǎn)生[17-18]。因此本研究通過成組設(shè)計分析下調(diào)15-LOX-2對缺氧PASMCs的作用和機制。本研究證實利用siRNA技術(shù)干擾15-LOX-2的表達，可顯著下調(diào)15-LOX-2，同時可抑制其產(chǎn)物15-HETE的產(chǎn)生，而通過調(diào)控15-LOX-2和其產(chǎn)物的表達，可以抑制PASMCs的異常增殖。研究表明，15-HETE是HPV的中間環(huán)節(jié)，同時研究提示缺氧時肺動脈內(nèi)生成的15-HETE主要來源于15-LOX-2途徑，上述研究說明15-LOX-2在HPV中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19-20]。因此本研究結(jié)果提示15-LOX-2在HPV中主要通過作用花生四烯酸產(chǎn)生產(chǎn)物15-HETE，影響缺氧條件下PASMCs的增殖，從而調(diào)控HPV。

研究報道提示，缺氧還可引起機體氧化還原平衡紊亂，降低SOD等抗氧化酶的活性，增加活性氧族的生成，如ROS等氧自由基大量生產(chǎn)，進而促進HPV發(fā)生[21-23]。因此本研究進一步深入探討下調(diào)15-LOX-2對缺氧條件下PASMC中氧化還原平衡的影響，結(jié)果顯示，通過下調(diào)15-LOX-2在HPV中的表達，可促進SOD活性恢復(fù)，并抑制ROS氧自由基的產(chǎn)生，進而調(diào)控氧化/抗氧化環(huán)節(jié)，促進氧化還原平衡恢復(fù)，有助于延緩HPV的病理進程。

本研究提示15-LOX-2在HPV調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可以為臨床防控HPV治療靶點選擇提供參考和理論依據(jù)，并有助于闡釋HPV發(fā)生機制的研究。

[1]Kholdani C，F(xiàn)ares WH，Mohsenin V.Pulmonary hypertension in obstructive sleep apnea：is it clinically significant? A critical analysis of the association and pathophysiology[J]. Pulm Circ，2015，5（2）：220-227.

[2]García-de-la-Asunción J，García-Del-Olmo E，Perez-Griera J，et al.Oxidative lung injury correlates with onelung ventilation time during pulmonary lobectomy：a study of exhaled breath condensate and blood[J].Eur J Cardiothorac Surg，2015，48（3）：e37-e44.

[3]Huetsch J，Shimoda LA.Na（+）/H（+）exchange and hypoxic pulmonary hypertension[J].Pulm Circ，2015，5（2）：228-243.

[4]Liu Y，Tang X，Lu C，et al.Expression of 15-lipoxygenases in pulmonary arteries after hypoxia [J].Pathology，2009，41（5）：476-483.

[5]Guo L，Tang X，Tian H，et al.Subacute hypoxia suppresses Kv3.4 channel expression and whole-cell K+currents through endogenous 15-hydroxyeicosatetraenoic acid in pulmonary arterial smooth muscle cells[J].Eur J Pharmacol，2008，587（1-3）：187-195.

[6]Savai R，Al-Tamari HM，Sedding D，et al.Pro-proliferative and inflammatory signaling converge on FoxO1 transcription factor in pulmonary hypertension [J].Nat Med，2014，20（11）：1289-1300.

[7]Ketabchi F，Mansoori S，Moosavi SM.The role of anion exchanger on pulmonary vascular response to sustained alveolar hypoxia in the isolated perfused rabbit lung[J].I-ran J Med Sci，2015，40（3）：256-263.

[8]Green DE，Murphy TC，Kang BY，et al.pparγ ligands attenuate hypoxia-induced proliferation in human pulmonary artery smooth muscle cells through modulation of microRNA-21[J].PLoS One，2015，10（7）：e0133391.

[9]Patel D，Alhawaj R，Wolin MS.Exposure of mice to chronic hypoxia attenuates pulmonary arterial contractile responses to acute hypoxia by increases in extracellular hydrogen peroxide [J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2014，307（4）：R426-R433.

[10]Cahill E，Rowan SC，Sands M，et al.The pathophysiological basis of chronic hypoxic pulmonary hypertension in the mouse：vasoconstrictor and structural mechanisms contribute equally [J].Exp Physiol，2012，97（6）：796-806.

[11]Schewe T，Kuhn H.Do 15-lipoxygenases have a common biological role? [J].Trends Biochem Sci，1991，16（10）：369-373.

[12]Kuhn H，Walther M，Kuban RJ.Mammalian arachidonate 15-lipoxygenases structure，function，and biological implications[J].Prostaglandins Other Lipid Mediat，2002，68-69：263-290.

[13]Brash AR，Jisaka M，Boeglin WE，et al.Molecular cloning of a second human 15S-lipoxygenase and its murine homologue，an 8S-lipoxygenase：their relationship to other mammalian lipoxygenases[J].Adv Exp Med Biol，1999，447：29-36.

[14]Lai N，Lu W，Wang J.Ca2+and ion channels in hypoxiamediated pulmonary hypertension[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8（2）：1081-1092.

[15]Zhang J，Zhou J，Cai L，et al.Extracellular calcium-sensing receptor is critical in hypoxic pulmonary vasoconstriction[J].Antioxid Redox Signal，2012，17（3）：471-484.

[16]Han W，Tang X，Wu H，et al.Role of ERK1/2 signaling pathways in 4-aminopyridine-induced rat pulmonary vasoconstriction[J].Eur J Pharmacol，2007，569（1-2）：138-144.

[17]Li X，Ma C，Zhu D，et al.Increased expression and altered subcellular distribution of PKC-δ and PKC-ε in pulmonary arteriesexposedtohypoxiaand15-HETE[J].Prostaglandins Other Lipid Mediat，2010，93（3-4）：84-92.

[18]Michalak A，Lewandowska-Polak A，Moskwa S，et al.IgE-mediated 15-hydroxyeicosatetraenoic acid（15-HETE）generation by peripheral blood leukocytes：its association with basophil activation [J].Postepy Dermatol Alergol. 2015，32（4）：262-267.

[19]Shen T，Shi J，Wang N，et al.15-Lipoxygenase and 15-hydroxyeicosatetraenoic acid regulate intravascular thrombosis in pulmonary hypertension [J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2015，309（5）：L449-L462.

[20]Yu X，Li T，Liu X，et al.modulation of pulmonary vascular remodeling in hypoxia：role of 15-LOX-2/15-HETEMAPKs pathway[J].Cell Physiol Biochem，2015，35（6）：2079-2097.

[21]Wei J，Xu H，Shi L，et al.Trimetazidine protects cardiomyocytes against hypoxia-induced injury through ameliorates calcium homeostasis[J].Chem Biol Interact，2015，236：47-56.

[22]Thurmond P，Yang JH，Li Y，et al.Structural modifications of the prostate in hypoxia，oxidative stress，and chronic ischemia[J].Korean J Urol，2015，56（3）：187-196.

[23]Clarke MB，Wright R，Irwin D，et al.Sustained lung activity of a novel chimeric protein，SOD2/3，after intratracheal administration [J].Free Radic Biol Med，2010，49（12）：2032-2039.

Effect of 15-lipoxygenase-2 down-regulation on hypoxic pulmonary arterial smooth muscle cells

LIU Ye XING Wenjing LI Sijia
Teaching and Research Office of Immunology,Harbin Medical University,Heilongjiang Province,Harbin 150081, China

Objective To explore the effect of 15-lipoxygenase-2 (15-LOX-2)down-regulation on hypoxic pulmonary arterial smooth muscle cells(PASMCs).Methods PASMCs were randomly divided into 4 groups,normal control group, hypoxic group,scramble group and 15-LOX-2 siRNA group.Real time PCR was used to detect the expression of 15-LOX-2.Proliferation of PASMCs was examined by MTT assay.ELISA was employed to detect 15-hydroxyeicosatetraenoic acid(15-HETE).The changes of reactive oxygen species(ROS)and superoxide dismutase(SOD)were analyzed.Results During hypoxia,the expression of 15-LOX-2,15-HETE,ROS and PASMCs proliferation were increased,the activity of SOD reduced,there were statistically significant differences compared with normal control group (P＜0.05).After transfection of 15-LOX-2 siRNA during hyoxia,15-LOX-2,15-HETE,ROS and PASMCs proliferation were down-regulated,while SOD activity increased,there were statistically significant differences compared with hypoxic group (P＜0.05).Conclusion 15-LOX-2 down-regulation can inhibit 15-HETE formation and abnormal PASMCs proliferation,regulate oxidant/antioxidant balance,which delays pathological process of HPV.

15-lipoxygenase-2;Pulmonary arterial smooth muscle cells;15-hydroxyeicosatetraenoic acid;Oxidation/ anti-oxidation

R563.9

A

1673-7210（2015）11（c）-0026-04

2015-08-10本文編輯：張瑜杰）

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（12511177）。

劉曄（1978.4-），女，博士，副教授；研究方向：呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制和防治。