樊琛 李燕 曾慶華 王會 陸長民 鄭煥芹

摘要：通過單因素試驗和正交試驗探討了FeS04溶液用量、水楊酸-乙醇溶液用量、H202溶液濃度、反應溫度、反應時間對Fenton反應體系的影響，篩選出羥自由基反應體系的最優(yōu)反應條件，并檢測了乙醇體積分數、pH對反應體系的影響。結果表明，最佳反應條件為1.8 mmol/L的FeS04溶液2.50 mL，1.8 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，0.05% H202溶液0.10 mL，蒸餾水0.50 mL，20 ℃水浴10 min。反應體系的pH及待測液乙醇體積分數對反應體系有明顯影響，建議待測液含乙醇時，應做相同體積分數乙醇對照組進行修正。

關鍵詞：Fenton反應；羥自由基；分光光度法；水楊酸

中圖分類號：S-3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5382-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.046

Correction of Fenton Hydroxy Radical Reaction System

FAN Chen， LI Yan， ZENG Qing-hua， WANG Hui， LU Chang-min， ZHENG Huan-qin

（College of Agricultural， Liaocheng University， Liaocheng 252059， Shandong， China）

Abstract：Through single factor experiment and orthogonal experiment were conducted to study the effects of FeS04 solution dosage， salicylic acid-ethanol dosage，H202 concentration， temperature， time of reaction system， screening out the optimum reaction conditions of hydroxyl free radical reaction system， and 1.8 mmol/L FeS04 solution for 2.50 mL，1.8 mmol/L of salicylic acid-ethanol solution 2.00 mL， 0.05% H202 solution 0.10 mL，0.50 mL of distilled water， in 20 ℃ water bath for 10 min. In addition， the effects of volume fraction of ethanol solution and the pH were also discussed. The results showed that pH and ethanol had obvious effects on the reaction system. The Control group should add ethanol with same concentration of experimental group.

Key words： Fenton reaction； hydroxyl radicals； spectrophotometric method； salicylic acid

羥自由基（·OH）消除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標[1-3]。在幾種常用的羥自由基（·OH）檢測方法中，分光光度法較高效液相色譜法和電子自旋共振法簡便、直接，且由于其所需設備簡單，而被廣泛采用[4-8]。目前，常采用的方法是基于水楊酸可以捕獲羥自由基（·OH）生成2，3-二羥基苯甲酸和2，5-二羥基苯甲酸，在波長510 nm處有最大吸收的原理，建立的用分光光度法檢測Fenton反應產生的羥自由基（·OH）的方法[9]。但是·OH的化學反應活性強、存在壽命短[10，11]，實際應用過程中易引起明顯誤差。

本試驗以FeS04、H2O2、水楊酸-乙醇為反應體系，通過對影響反應體系的條件進行優(yōu)化，篩選最佳反應條件，并對其穩(wěn)定性進行檢測。在此基礎上，測定pH、乙醇等對羥自由基（·OH）反應體系清除率的影響，為修正羥自由基檢測的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

硫酸亞鐵、水楊酸、30%過氧化氫、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、維生素C（抗壞血酸），所用試劑均為分析純，試驗用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

UV-1800型紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；SB-2000型水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；T-214型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3 反應體系吸收光譜

取水楊酸-水溶液、水楊酸-乙醇-水溶液、水楊酸-乙醇溶液，在波長190～1 100 nm范圍內分別測定吸收光譜。

第一組：向各試管中依次加入3.00 mL蒸餾水，水楊酸-乙醇1.50 mL，最后加 H2O2 （0.03%）0.10 mL振蕩混合；第二組：向試管中依次加入1.00 mL蒸餾水，FeSO4溶液2.00 mL，水楊酸-乙醇1.50 mL，最后加 H2O2（0.03%） 0.10 mL，振蕩混合；第三組：向各試管中依次加入1.10 mL蒸餾水，FeSO4溶液2.00 mL，水楊酸-乙醇1.50 mL；第四組：水楊酸-乙醇，各組均在37 ℃水浴中40 min，在波長190～1 100 nm處測定其吸光度，比較各組的吸收光譜圖。

水楊酸-水溶液、水楊酸-乙醇-水溶液吸收光譜檢測方法同上。

1.4 單因素試驗

1.4.1 FeS04用量的影響 改變FeSO4溶液的體積，其他反應條件不變，考察FeSO4溶液不同用量對反應體系吸光度的影響。向各試管中依次加入FeSO4溶液，分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，水楊酸-乙醇1.50 mL，蒸餾水補足體積至5.5 mL，最后加 H2O2（0.03%） 0.10 mL，振蕩混合，11 ℃條件下反應10 min，在510 nm處測定其吸光度。

1.4.2 水楊酸-乙醇溶液用量的影響 取水楊酸-乙醇溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，其他條件不變，考察水楊酸-乙醇溶液不同用量對反應體系吸光度的影響。

1.4.3 H2O2體積分數的影響 加入不同體積分數（0、0.010%、0.025%、0.035%、0.050%、0.100%、0.150%、0.200%、0.250%、0.300%、0.350%）的H2O2溶液0.10 mL啟動反應，其他條件不變，考察不同H2O2體積分數對體系吸光度的影響。

1.4.4 反應溫度的影響 在不同溫度條件下8、13、17、22、27、32、37、42、46 ℃反應，其他條件不變，考察不同溫度對體系吸光度的影響。

1.4.5 反應時間的影響 反應1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 min，其他條件不變，考察不同反應時間對體系吸光度的影響。

1.5 正交試驗設計

上述單因素試驗表明溫度和時間兩個因素對反應體系的影響不明顯。因此，確定FeSO4溶液用量，水楊酸-乙醇溶液用量，H2O2溶液體積分數為正交試驗的三個因素，分別記作A、B、C，各因素均取3個水平，正交試驗因素和水平見表1。

1.6 驗證試驗

1.6.1 動力學試驗 根據正交試驗最優(yōu)組合，向試管中依次加入蒸餾水0.50 mL，FeSO4溶液2.50 mL，水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，最后加入0.05%的H2O2溶液0.10 mL。加入H2O2溶液后立即（時間控制在15 s內）倒入比色皿中，在510 nm處測定其吸光度，每隔5 s測一次。

1.6.2 乙醇的影響 在試管中依次加入FeSO4溶液2.50 mL，水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，不同體積分數乙醇溶液（0、30%、50%、70%）以及無水乙醇0.5 mL，H2O2（0.05%） 0.10 mL，振蕩混合，20 ℃水浴10 min，在510 nm下測量其吸光度。

1.6.3 pH的影響 在各試管中依次加入蒸餾水0.50 mL，FeSO4溶液2.50 mL，水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，加H2O2（0.05%）0.10 mL，用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調節(jié)各試管反應體系的pH，分別為2.0、3.0、3.5、4.0、6.0、6.2、6.4、6.7、7.0，20 ℃水浴10 min，在510 nm下測量吸光度。

1.6.4 VC對羥自由基的清除作用 在試管中依次加入FeSO4溶液2.50 mL，水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，不同質量分數的VC溶液（0、50、100、150、200、300、400、500 μg/mL）0.5 mL，H202（0.05%） 0.10 mL，振蕩混合，20 ℃水浴10 min，在510 nm下測量吸光度。自由基清除率計算公式為：

D=[（AO-As）/AO]×100%

式中，AO為空白管的吸光度值，As為加入自由基清除劑后的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 Fenton反應體系吸收光譜

Fenton反應體系在510 nm波長處有吸收峰，而水楊酸-乙醇溶液單獨與FeSO4或者H2O2反應時在510 nm波長處沒有明顯的光吸收（圖1），說明水楊酸溶液作為捕捉劑可捕捉Fenton試劑產生的羥自由基（·OH），產物在510 nm波長有特征吸收峰，因此選用510 nm波長為測定波長。

由圖1可見，吸收光譜b與a、c、d在510 nm波長處有明顯差異，表明FeSO4溶液與H2O2溶液單獨使用時幾乎不與水楊酸作用產生有色物質，反應體系產生的紫紅色物質為羥自由基與水楊酸作用產生的。試驗結果表明，水楊酸-乙醇溶液、水楊酸-水溶液、水楊酸-乙醇-水溶液，3種溶液的特征光吸收相近，由于水楊酸晶體易溶于乙醇，故反應體系選用水楊酸-乙醇溶液。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 FeSO4用量的影響 如圖2所示，隨著FeSO4溶液用量的增大，反應體系顏色逐漸加深，反應體系的吸光度增大，當FeSO4溶液用量增大到2.0 mL后，吸光度變化逐漸趨于平穩(wěn)，再增加FeSO4溶液的用量對反應體系吸光度無明顯影響。

2.2.2 水楊酸-乙醇溶液用量的影響 隨著水楊酸-乙醇溶液用量增加，反應體系顏色逐漸加深。 如圖3所示，隨著水楊酸-乙醇溶液用量的增加，反應體系吸光度增大，當水楊酸-乙醇溶液用量達到2.0 mL后，反應體系吸光度趨于平穩(wěn)，再增加水楊酸-乙醇溶液的用量對反應體系無明顯影響。

2.2.3 H2O2體積分數的影響 隨著H2O2體積分數的增加，反應體系顏色逐漸加深。如圖4所示，隨H2O2溶液體積分數的增大，吸光度隨之增大，H2O2溶液體積分數在0～0.035%之間對反應體系吸光度的影響明顯，當H2O2溶液體積分數大于0.035%后，吸光度趨于平穩(wěn)，再增大H2O2溶液的體積分數對反應體系無明顯影響。

2.2.4 反應溫度的影響 隨著反應溫度的變化，反應體系顏色無明顯差異。如圖5所示，在17～22 ℃之間，反應體系吸光度較高；反應溫度大于22 ℃或小于17 ℃，反應體系吸光度值降低，但降低的程度不明顯。

2.2.5 反應時間的影響 隨反應時間增長，反應體系顏色無明顯變化。如圖6所示，在反應1 min時，其吸光度為0.849，隨著反應時間的增加，反應體系吸光度變化不明顯，表明反應時間對體系影響不明顯。

單因素試驗結果表明，FeSO4溶液用量，水楊酸-乙醇溶液用量和H2O2溶液體積分數3個因素對反應體系的影響明顯，而溫度和時間對反應體系的影響不明顯。

2.3 正交試驗結果

采用四因素三水平的正交試驗方法，研究不同因素對Fenton反應體系的影響，正交試驗結果見表2。由表2可見，RC>RA>RB，各因素對Fenton反應體系影響的主次順序為C、A、B。即H2O2溶液的體積分數影響最大，其次是FeSO4溶液的用量，而水楊酸-乙醇溶液用量的影響最小。A3B2C3為最優(yōu)組合，即：FeSO4溶液的用量為2.50 mL，水楊酸-乙醇溶液的用量為2.00 mL，H2O2溶液的體積分數為0.05%，用量為0.10 mL，加水量為0.50 mL。

2.4 驗證試驗

2.4.1 動力學試驗 如圖7所示，反應體系在最初75 s內就產生了較多的羥自由基，在170 s時，吸光度達到1.003，此后吸光度值無明顯變化。

2.4.2 不同體積分數乙醇的影響 如圖8所示，不同體積分數（30%、50%、70%）的乙醇溶液以及無水乙醇對Fenton反應體系有明顯影響。隨著乙醇體積分數的增大，反應體系吸光度值逐漸降低，表明乙醇可消除部分羥自由基。因此，實際應用時，若待測液中含有乙醇，應做相同體積分數的乙醇對照來修正待測液的羥基自由基清除率，避免出現假陽性結果。

2.4.3 pH的影響 如圖9所示，反應體系pH 2.0～7.0時，其吸光度先升高后降低。pH小于4.0及大于6.4時反應體系的吸光度值較小，當體系pH大于7.0時，易產生沉淀。因此，反應體系較合適的pH范圍為4.0～6.4，最適pH范圍為6.0～6.4。

2.4.4 維生素C對羥自由基的清除作用 維生素C溶液可顯著清除Fenton體系產生的羥自由基。由圖10可見，當維生素C的質量分數達到200 μg/mL時，反應體系的羥自由基清除率可達100%。維生素C（抗壞血酸） 是一種有效的自由基清除劑，它通過逐級供給電子而轉變成脫氫抗壞血酸，以清除羥自由基（·OH）等自由基[12]。

3 小結

1）在單因素試驗中FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液、H2O2溶液3個因素對反應體系的影響明顯，而溫度和時間對反應體系的影響不明顯。

2）最適體系為：1.8 mmol/L FeSO4溶液2.50 mL，1.8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2.00 mL，0.05%的H2O2溶液0.10 mL，蒸餾水0.50 mL，20 ℃水浴10 min，在波長510 nm下測定吸光度。

3）最適反應體系的pH為6.0～6.4；待測液的乙醇體積分數對反應體系有影響，實際應用中應對待測液的pH及乙醇體積分數做對照組修正。

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