張相飛 李凌緒

摘要：橘皮素和川陳皮素是陳皮多甲氧基黃酮的重要活性成分，以HPLC法測(cè)定陳皮提取物中橘皮素和川陳皮素的含量，優(yōu)選了提取溶劑，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)考察了提取溫度、提取時(shí)間、溶劑添加量和提取次數(shù)對(duì)提取工藝的影響，確定了最佳提取工藝。結(jié)果表明，石油醚是同時(shí)提取橘皮素和川陳皮素的適宜溶劑，正交試驗(yàn)所得的最佳提取工藝為加入6倍量石油醚，80 ℃提取4次，每次3 h，所獲得的提取工藝合理、穩(wěn)定、可靠。

關(guān)鍵詞：陳皮；橘皮素；川陳皮素；正交試驗(yàn)；工藝

中圖分類號(hào)：R282.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）21-5364-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.041

Optimize Extraction Technology for Tangeretin and

Nobiletin Using Orthogonal Design Method

ZHANG Xiang-feia， LI Ling-xub

（Qingdao Agricultral University， a. College of Chemistry and Pharmaceutical Science；b. College of Agronomy and Plant Protection，

Qingdao 266109， Shandong， China）

Abstract： Tangeretin and nobiletin were important polymethoxyflavones in tangerine peel. The content of tangeretin and nobiletin were measured by HPLC methods. The extracting solvents were selected. The influence of extracting temperature， extracting time， the menstruum dosage， extracting times were investigated using orthogonal design method. The results showed that petroleum ether was the best extracting solvent. The optimal conditions for the extraction technology were as follows： extracting for four times， each time for 3 h at 80 ℃， with 6 times the amount of petroleum ether. This extraction technology is reasonable， stable and feasible.

Key words： tangerine peel； tangeretin； nobiletin； orthogonal design； extraction technology

陳皮是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，富含黃酮等多種活性成分，其來(lái)源為蕓香科柑橘屬植物柑橘的果皮。多甲氧基黃酮（Polymethoxylated Flavones，PMFs）是蕓香科植物特有的活性成分，因其良好的抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等活性受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[1-3]。同時(shí)PMFs也是柑橘果實(shí)貯存期重要的抗病物質(zhì)，在果實(shí)采摘后可抵抗柑橘青霉菌（Penicillium digitatum）[1，4]、柑橘褐腐疫霉病菌（Phytophthora citrophthora）[5，6]等病菌的侵染。橘皮素和川陳皮素是PMFs的重要組成部分，對(duì)胃癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞有良好的抑制活性[7-10]，同時(shí)對(duì)膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[11]、蘋果腐爛病菌（Valsa mali）均有很強(qiáng)的抑菌活性。

我國(guó)是柑橘生產(chǎn)大國(guó)，每年產(chǎn)生的橘皮高達(dá)300萬(wàn)t[12]，絕大部分被丟棄浪費(fèi)。如能利用廢棄的橘皮資源，提取其中的橘皮素和川陳皮素等活性成分，將其開(kāi)發(fā)為藥物、保健品、植物源農(nóng)藥等高附加值商品，將極大地提高橘皮的商業(yè)價(jià)值，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，已有關(guān)于橘皮素或川陳皮素提取方法的報(bào)道[13，14]，李成平等[15]報(bào)道了微波法提取橘皮中橘皮素和川陳皮素的工藝，但僅使用75%乙醇作為提取溶劑，并未對(duì)提取溶劑進(jìn)行篩選。75%乙醇對(duì)橘皮素的溶解性較低且易溶出蛋白質(zhì)、多糖等水溶性成分，給后續(xù)純化工藝造成干擾。本試驗(yàn)采用浸提法提取橘皮中的橘皮素和川陳皮素，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)對(duì)提取溶劑進(jìn)行篩選，并設(shè)計(jì)L16（45）正交試驗(yàn)對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳提取工藝，為工業(yè)上提取橘皮素和川陳皮素提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

LC-10高效液相色譜儀為日本島津公司產(chǎn)品。試驗(yàn)所用橘皮為中藥材陳皮，購(gòu)自青島市城陽(yáng)區(qū)富康大藥房，產(chǎn)地為浙江黃巖，在室內(nèi)陰干，粉碎備用。橘皮素對(duì)照品和川陳皮素對(duì)照品購(gòu)自北京北研馨綠生物技術(shù)有限公司。HPLC分析采用乙腈（天津市申通化工有限公司）和甲醇（天津市巴斯夫化工有限公司）二者均為色譜純，水為超純水。

1.2 橘皮素和川陳皮素的測(cè)定

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Bondapak C18柱（300 mm×3.9 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈∶甲醇∶水（50∶20∶30），流速1.0 mL/min，UV檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)255 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25 ℃。在此條件下，橘皮素和川陳皮素的保留時(shí)間分別為8.7 min和6.9 min（圖1）。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取川陳皮素對(duì)照品和橘皮素對(duì)照品各50.00 mg，分別置于500 mL容量瓶中，以10 mL甲醇溶解并用流動(dòng)相定容，搖勻，冷卻至室溫，用0.2 μm濾膜過(guò)濾即為儲(chǔ)備液，備用。

1.2.3 供試樣品的制備 精確稱取陳皮粉末5 g，置于圓底燒瓶中，加入適量溶劑，熱回流提取。提取液經(jīng)抽濾后蒸干用10 mL甲醇溶解定容，取1 mL置于25 mL容量瓶中用流動(dòng)相定容，搖勻后用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

1.2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精確量取上述儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻。按照“1.2.1”的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，采用面積歸一化法測(cè)定峰面積。以每個(gè)對(duì)照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 μg/mL的橘皮素和川陳皮素對(duì)照品，按“1.2.1”的色譜條件進(jìn)行5次平行測(cè)定，計(jì)算平均峰面積的RSD值，結(jié)果表明橘皮素的RSD值為0.56%，川陳皮素為0.68%。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取相同供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣1次，測(cè)定6次，記錄色譜圖，計(jì)算橘皮素RSD為0.89%，川陳皮素RSD為1.6%，表明供試樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.7 分析方法的準(zhǔn)確度 稱取6份已知準(zhǔn)確含量的橘皮素和川陳皮素試樣，分別加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照上述方法和操作條件進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，計(jì)算橘皮素和川陳皮素的平均回收率分別為98.3%、101.3%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

1.2.8 樣品測(cè)定 取樣品適量，按“1.2.1”的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算橘皮素和川陳皮素的量，得到陳皮提取物的HPLC圖譜（圖2）。

1.3 提取溶劑的選擇

分別稱取陳皮粉末5份，每份5 g，依次加入9倍體積的石油醚（60～90 ℃）、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、無(wú)水乙醇，60 ℃提取2 h，按“1.2.3”的方法制備樣品溶液，并按“1.2.1”的色譜條件分析橘皮素和川陳皮素的含量。

1.4 提取條件的選擇

根據(jù)“1.3”的試驗(yàn)結(jié)果，確定石油醚為最佳提取溶劑。以提取溫度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為影響因素，每因素設(shè)定4個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，選用L16（45）正交試驗(yàn)（表1），以橘皮素和川陳皮素的提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算R值并進(jìn)行方差分析。

1.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取陳皮粉末3份，每份5 g，按最佳提取工藝條件進(jìn)行提取，按“1.2.1”的方法進(jìn)行橘皮素和川陳皮素的含量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以對(duì)照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。橘皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=29.107 7X+0.268 9，R2=0.999 7，川陳皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=56.570 3X+0.350 0，R2= 0.999 9。結(jié)果表明，橘皮素、川陳皮素在1～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 提取溶劑的選擇

不同溶劑對(duì)橘皮素和川陳皮素的提取結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，除石油醚之外，橘皮素在其他溶劑中的溶解度非常低，因此，綜合考慮選取石油醚為提取溶劑。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，由直觀分析可知，各因素對(duì)橘皮素和川陳皮素提取效果的影響順序均為D、A、B、C，橘皮素的最優(yōu)提取工藝為A4B3C1D4，川陳皮素的最優(yōu)提取工藝為A4B3C4D4。由方差分析結(jié)果（表4）可知，提取溫度、提取次數(shù)對(duì)橘皮素和川陳皮素的提取率均有顯著影響，而提取時(shí)間、料液比對(duì)橘皮素和川陳皮素的提取均無(wú)顯著影響。為了節(jié)省溶劑，選擇料液比為1∶6。綜上所述，確定最佳提取工藝為A4B3C1D4，即加入6倍量的石油醚，80 ℃提取4次，每次3 h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的最佳提取工藝，提取的橘皮素分別為1.026、1.018、1.009 mg/5 g藥材，川陳皮素分別為1.758、1.721、1.737 mg/5 g藥材，表明優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可靠，可兼顧橘皮素和川陳皮素的提取效果。

3 討論

橘皮素和川陳皮素是陳皮多甲氧基黃酮的重要組分，具有抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗菌等多種活性，本試驗(yàn)以橘皮素和川陳皮素兩個(gè)成分為指標(biāo)，考察了陳皮的提取工藝，具有一定的現(xiàn)實(shí)價(jià)值。

本試驗(yàn)以乙腈-甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，條件簡(jiǎn)單易行，相比甲醇-水或乙腈-水的洗脫系統(tǒng)能顯著縮短分析時(shí)間[14，15]。本試驗(yàn)首先對(duì)提取溶劑進(jìn)行了篩選，選擇非極性的石油醚作為提取溶劑，可避免浸出蛋白質(zhì)、多糖等極性成分，使后續(xù)分析及純化步驟更容易處理。

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