【作 者】溫賢濤，王蕊，賈璇，湯菊莉，賀學英

1 北京市醫(yī)療器械檢驗所，北京市，101111

2 醫(yī)療器械檢驗與安全性評價北京市重點實驗室，北京市，101111

鎳離子體外細胞毒性研究

【作 者】溫賢濤1,2，王蕊1,2，賈璇1,2，湯菊莉1,2，賀學英1,2

1 北京市醫(yī)療器械檢驗所，北京市，101111

2 醫(yī)療器械檢驗與安全性評價北京市重點實驗室，北京市，101111

該文的目的在于深入研究鎳離子的細胞毒性，為含鎳醫(yī)療器械生物學評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。該文選取小鼠結(jié)締組織細胞（L929）、小鼠胚胎心肌細胞（H9c2(2-1)）、人胚腎細胞（293[HEK-293]）、人成骨細胞（hFOB1.19）、人肝永生化細胞（THLE-3）、人T淋巴瘤細胞（H9）、人外周血B淋巴細胞（IM-9）等七種細胞，按醫(yī)療器械細胞毒性試驗推薦的MTT法檢測，對不同鎳離子濃度下細胞毒性進行研究。得出每種細胞在不同鎳子濃度下的細胞增殖率，并對細胞毒性進行分級，同時計算每種細胞的IC50值。結(jié)果表明不同細胞對鎳離子的敏感度不同，H9細胞對鎳離子最敏感，而L929細胞對鎳離子的毒性最耐受。當鎳離子濃度不大于1.25 mg/L時，所有細胞的細胞毒性均不大于1級，可認為此濃度以下為所選七種細胞的細胞毒性安全區(qū)。若以L929細胞作為醫(yī)療器械細胞毒性評判依據(jù)，鎳離子濃度在5 mg/L以下時無細胞毒性。本研究結(jié)果為初步判斷含鎳醫(yī)療器械中鎳離子溶出是否引起細胞毒性及全身毒性提供了實驗依據(jù)。

細胞毒性；鎳離子；IC50；醫(yī)療器械

0 引言

鎳合金是一種在醫(yī)療器械領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的生物材料，其中鎳鈦合金因其具有形狀記憶性和超彈性，被用于制造血管支架、正畸絲、封堵器等[1]。鎳鉻合金是常見的口腔醫(yī)用材料之一。由于鎳是一種具有較高毒性的元素，因此鎳合金的生物相容性一直備受關(guān)注。從上世紀七八十年代至今，已經(jīng)開展了大量關(guān)于鎳合金生物相容性的研究，其中包括細胞毒性研究。目前關(guān)于鎳合金細胞毒性的研究方法主要是采用浸提液法，將鎳合金在浸提介質(zhì)中浸提，然后用浸提液進行細胞毒性檢測。大部分試驗結(jié)果表明鎳合金無細胞毒性或者具有輕微的毒性[2]。鎳合金材料主要的有害溶出物為鎳離子，鎳離子濃度變化如何影響細胞增殖并無系統(tǒng)的研究[3]。本文選擇七種不同種類的細胞對鎳離子的細胞毒性進行研究。選擇L929小鼠結(jié)締組織細胞主要考慮到其為醫(yī)療器械細胞毒性試驗首選細胞。選擇h9c2(2-1)大鼠胚胎心肌細胞主要考慮到心血管支架及封堵器等產(chǎn)品是鎳鈦合金材料的重要應(yīng)用方向。選擇hFOB1.19人成骨細胞主要是考慮到鎳鈦合金材料也常應(yīng)用于骨科醫(yī)療器械。293[HEK-293]為人胚腎細胞和THLE-3為人肝永生化細胞，這兩株細胞的選擇主要考慮到腎與肝為主要的毒物代謝器官。H9為人T淋巴瘤細胞和IM-9為人外周血B淋巴細胞，這兩株細胞的選擇主要是想考查鎳離子對免疫細胞的毒性影響。

本研究中所選取的細胞毒性研究方法是根據(jù)醫(yī)療器械生物學評價標準推薦的方法，以MTT為顯色劑，結(jié)果以細胞相對增殖率表示，并按細胞毒性的分

級標準進行分級[4-5]。此外，計算鎳離子對各種細胞的TC50值。因此，本研究的結(jié)果對于含鎳醫(yī)療器械的細胞毒性評價重要的參考價值。

1 材料和方法

1.1 試劑

六水氯化鎳（Sigma）； MEM培養(yǎng)基（HyClone）；小牛血清（天津康源生物技術(shù)有限公司）；胰酶/EDTA（HyClone）；PBS（不含Ca和Mg）（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；MTT（Sigma-Aldrich）；青霉素-鏈霉素（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）；谷氨酰胺（Solarbio）；二甲亞砜（DMSO）（Sigma）；鈦合金；DMEM培養(yǎng)基；MEM-EBSS培養(yǎng)基；DMEM/F12(1:1)；Clonetics Corporation, Walkersville, MD 21793培養(yǎng)基；RPMI 1640培養(yǎng)基。

1.2 儀器、設(shè)備及耗材

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(MCO-18AIC，三洋)；超凈工作臺(BCN-1360B)；液氮罐(YDS-50B-200，東亞)；倒置顯微鏡(DMIL，萊卡)；酶標儀(MK3，Thermo)；4oC及-20oC冰箱；高壓滅菌鍋；天平；細胞計數(shù)板；微量加樣器(1 000 μL、100 μL和10 μL)；25 cm2培養(yǎng)瓶；96孔細胞培養(yǎng)板；吸管；凍存管；離心管；濾器；加樣槍頭。

1.3 細胞

H9c2(2-1)；293[HEK-293]；hFOB1.19；THLE-3；H9；IM-9；L929，均從ATCC購買。

1.4 試劑配制

氯化鎳貯備液 將六水氯化鎳溶于生理鹽水中配制成鎳離子濃度為4 g/L的貯備液，用無菌濾頭過濾除菌后備用。使用時用培養(yǎng)基梯度稀釋，使其接觸細胞的終濃度為160 mg/L，80 mg/L，40 mg/L，20 mg/L，10 mg/L，5 mg/L，2.5 mg/L，1.25 mg/L。

MTT 用PBS溶液中，配成濃度為5 mg/mL的溶液，過濾滅菌，分裝后避光保存在-20oC。

陽性對照 將用培養(yǎng)基配制5%的DMSO作為陽性對照。

陰性對照 用培養(yǎng)基對鈦合金進行浸提，浸提液作為陰性對照。

1.5 試驗步驟

1.5.1 細胞培養(yǎng)

H9c2(2-1)用DMEM培養(yǎng)基，293[HEK-293]用MEM-EBSS培養(yǎng)基，hFOB1.19用DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基，THLE-3用Clonetics Corporation, Walkersville, MD 21793培養(yǎng)基，H9和 IM-9用RPMI 1640培養(yǎng)基，L929用MEM培養(yǎng)基。將各種細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的相應(yīng)培養(yǎng)基中，靜置于37oC、5%CO2、95%相對溫度的恒溫培養(yǎng)箱中孵育。

1.5.2 接種及給藥

待細胞處于對于生長期時，貼壁細胞用0.25%的胰酶進行消化后調(diào)成1.5×104細胞濃度，懸浮細胞直接調(diào)節(jié)成1.5×104細胞濃度。細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，設(shè)空白對照、陰性對照、陽性對照和8個不同鎳離子濃度試驗組，每組各設(shè)至少8孔，每孔接種100 μL細胞懸液。

置于5%CO2培養(yǎng)箱37oC培養(yǎng)24 h后，貼壁細胞棄去原培養(yǎng)液，懸浮細胞維持原培養(yǎng)基?？瞻讓φ战M加入新鮮細胞培養(yǎng)液，陰性對照組加入陰性對照浸提液，陽性對照組加入陽性對照液，試驗組加入相應(yīng)濃度的鎳離子溶液，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.5.3 吸光度測定：

每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，貼壁細胞組棄凈孔內(nèi)液體，加入100 μL DMSO，懸浮細胞組直接加入100 μL DMSO。置振蕩器上振蕩10 min，在酶標儀570 nm和630 nm波長下測定吸光度。

1.5.4 計算相對增殖率：

RGR =(A570nm-A630nm)×100 /(AB570nm-AB630nm)

式中:

RGR──相對增殖率，%；

A──供試品組（試驗組、陰性對照組、陽性對照組）；

AB──空白對照組吸光度。

1.6 細胞毒性分級

按GB/T 14233.2-2005標準中細胞毒性試驗推薦的分級方法[5]，根據(jù)相對增殖率進行分級，級別越高細胞毒性越大。

表1 細胞毒性反應(yīng)分級Tab.1 The grades of cytotoxicity

1.7 計算IC50值

取細胞增殖率曲線中涵蓋增殖率為50%的一段，對其進行擬合，得出線性方程，再計算出IC50值。

1.8 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 11.0 for Windows軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 細胞相對增殖率及細胞毒性分級

相對增殖率見表2，按表1細胞毒性反應(yīng)分級原則進行分級，細胞毒性級別見表3，從細胞毒性分級結(jié)果來看，所有種類細胞增殖率隨著鎳離子濃度增加而降低。所有種類細胞的細胞毒性在鎳離子濃度為1.25 mg/L時，均不大于1級。當鎳離子濃度為2.5 mg/L時，除H9細胞毒性結(jié)果為2級，其他均不大于1級。當鎳離濃度度增加到5 mg/L時，H9c2(2-1)、293[HEK-293]及L-929三種細胞毒性仍不大于1級，而hFOB1.19和THLE-3細胞毒性為2級，而IM-9和H9細胞毒性分別為3級和4級。當鎳離子濃度為10mg/L時，L929細胞毒性為2級，293[HEK-293]、H9c2(2-1)、hFOB1.19及THLE-3細胞毒性為3級，H9 和IM-9細胞毒性為4級。當鎳離子濃度大于等于20 mg/L時，所有種類細胞毒性均4級。由此可見，1.25 mg/L濃度對目前所用的七種細胞都是安全的，而大于20 mg/L時所有的細胞毒性均為4級。

值得注意的是L929細胞，作為醫(yī)療器械細胞毒性推薦的首選細胞，目前各檢驗中心也均使用L929細胞進行細胞毒性試驗。對于L929細胞，只要鎳離子濃度不高于5 mg/L，均無細胞毒性。因此在對于含鎳醫(yī)療器械產(chǎn)品進行生物學評價時，只要該產(chǎn)品的鎳離子溶出后終濃度不大于5 mg/L, 可以推斷細胞毒性試驗結(jié)果應(yīng)該能符合目前我國對細胞毒性結(jié)果不大于1級的要求。

2.2 IC50值

IC50結(jié)果見表3。IC50值可以反應(yīng)細胞對化學物毒性的敏感程度，IC50值越低說明細胞對該化學物越敏感。從IC50的值可看出，H9的IC50最低，為3 mg/L，IM-9的IC50為6 mg/L，hFOB1.19為8 mg/L，THLE-3和H9C2(2-1)為9 mg/L，293[HEK-293]為10 mg/L，L929的IC50最大，為15 mg/L。由此可見H9細胞對鎳離子毒性最敏感，而L929細胞對鎳離子毒性最耐受。Schmalz G等[6]研究發(fā)現(xiàn)，鎳離子對L929細胞的IC50值在332 μmol/L，也即19.5 mg/L，高于本研究結(jié)果?？赡苁怯捎诒驹囼炛屑毎麧舛群图毎佑|毒性物質(zhì)的時間與文獻報道有差別。Issa等[7]用MTT法研究不同濃度的鎳離子對牙齦成纖維細胞毒性進行研究，發(fā)現(xiàn)鎳離子對牙齦成纖維細胞的IC50值達到827.9 μmol/L，也即是48.6 mg/L，遠高于本試驗中各種細胞的IC50值。目前醫(yī)療器械細胞毒性試驗首選L929細胞作為評價細胞，從本實驗結(jié)果來看，L929細胞是一種對毒性較耐受的細胞，相對不敏感，但選擇較耐受的細胞有利于實驗體系的穩(wěn)定。細胞毒性為體外試驗，對醫(yī)療器械毒性僅起到初篩的作用，還需要配合體內(nèi)試驗對醫(yī)療器械生物相容性進行綜合評價。

表2 不同鎳離子濃度(mg/L)下7種細胞的相對增殖率（%）Tab.2 RGR (%) of seven cell lines under different concentrations of nickel ion

表3 不同鎳離子濃度(mg/L)下7種細胞的細胞毒性級別及對IC50值Tab.2 the cytotoxic grades of seven cell lines under different concentrations of nickel ion and IC50values

3 結(jié)論

本研究結(jié)論如下：（1）不同細胞對鎳離子的敏感度不同，H9細胞對鎳離子最敏感，而L929細胞對

鎳離子的毒性最耐受。（2）當鎳離子濃度不大于1.25 mg/L時，細胞毒性均不大于1級，當鎳離子濃度為20 mg/L及以上時，所有細胞毒性級別均為4級。當濃度處于1.25 mg/L到20 mg/L之間時，不同細胞的細胞毒性級別有所差別。根據(jù)目前我國對醫(yī)療器械細胞毒性要求，鎳離子濃度在1.25 mg/L以下可認為是安全的。體外毒性研究結(jié)果對體內(nèi)毒性研究有一定的預(yù)示作用，本次體外細胞毒性研究得出的安全濃度值對今后含鎳醫(yī)療器械全身毒性研究及毒性限量建立具有參考價值。（3）目前醫(yī)療器械細胞毒性試驗采用L929進行試驗，根據(jù)本文研究結(jié)果，當醫(yī)療器械鎳離子溶出的終濃度在5 mg/L以下時，可預(yù)測溶出的鎳離子不會引起細胞毒性。如果含鎳器械接觸人體部分成簡單，可能的潛在毒性來源只有鎳元素，本試驗結(jié)果可以直接用于判斷該器械可能的細胞毒性。如果含鎳器械與人體接觸部分組成復雜，可能含有除鎳元素外的其它潛在毒性源，應(yīng)該在本研究結(jié)果的基礎(chǔ)上充分考慮其它潛在毒性。（4）本研究結(jié)果可為含鎳醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)初步篩選細胞毒性合格的原料提供依據(jù)。

[1] 鄭玉峰, 趙連城. 生物醫(yī)用鎳鈦合金[M]. 北京: 科學出版社, 2004.

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[3] 王琛，夏露，陳亞明. 鎳離子對小鼠成纖維細胞毒性的實驗研究[J].口腔醫(yī)學，2012，32(4):226-229.

[4] 中國國家標準化管理委員會. GB/T 16886.5-2003醫(yī)療器械生物學評價第5部分: 體外細胞毒性試驗[S].

[5] 中國國家標準化管理委員會. GB/T 14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2部分: 生物學試驗方法[S].

[6] Schmalz G，Langer H，Schweikl H. Cytotoxicity of dental alloy extracts and corresponding metal salt solutions[J]. J Dent Res，1998, 77(10): 1772-1778.

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In Vitro Cytotoxicity Study of Nickel Ion

【W(wǎng)riters】WEN Xiantao1,2, WANG Rui1,2, JIA Xuan1,2, TANG Juli1,2, HE Xueying1,2
1 Beijing Institute of Medical Device Testing, Beijing, 101111
2 Beijing Key Laboratory of Medical Device Control, Beijing, 101111

The purpose of this study was to investigate the cytotoxicity of the nickel ion and provide with basic data for the biological evaluation of those medical devices containing nickel. Seven cell lines were chosen. They were L929, h9c2(2-1), 293[HEK-293], hFOB1.19, THLE-3, H9 and IM-9 respectively. According to the principle of biological evaluation of medical devices, MTT method was chosen to test the cytotoxicity in different concentrations of nickel ion. For each cell line, the relative growth rate (RGR) was obtained and the cytotoxic grade was classified. Besides, IC50values were calculated. As a result, it was found that the sensitivity was different among all cell lines. H9 was the most sensitive one, while the L929 was the most tolerant one. The concentration which is not above 1.25 mg/L was safe for all seven cell lines, because the cytotoxicity for all cells exposed in this concentration were not higher than grade 1. According to the criteria for medical devices, the concentrations not above 5 mg/L were safe for L929 cells. This result helps us to roughly assess the cytotoxicity and systematic toxicity caused by nickel contained in medical devices.

Cytotoxicity, Nickel ion, IC50, medical devices

TH77

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2015.03.016

1671-7104(2015)03-0212-04

2015-01-14

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項課題（2011-3001-02）

賀學英，研究方向：生物學評價，E-mail: hexueying@bimt.org.cn