劉瑤函李 娟鐘 成唐永強(qiáng)魯 藝

1（中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055）

2（中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

用于多腦區(qū)神經(jīng)環(huán)路解析的新型光電極陣列

劉瑤函1，2李 娟1，2鐘 成1，2唐永強(qiáng)1魯 藝1

1（中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055）

2（中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

光遺傳技術(shù)已被廣泛用于神經(jīng)環(huán)路的精確解析，幫助人們深入理解神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機(jī)制。然而在活體水平實(shí)現(xiàn)多腦區(qū)的光遺傳調(diào)控和電生理記錄仍然極具挑戰(zhàn)。文章介紹了一種制備多腦區(qū)光電極陣列的方法。這種光電極陣列包含微電極支架和步進(jìn)裝置，可以同時(shí)對(duì)小鼠4個(gè)腦區(qū)的自發(fā)電生理信號(hào)（包括神經(jīng)元放電和場(chǎng)電位）和光遺傳調(diào)控后誘發(fā)的電生理變化進(jìn)行記錄。此外，還采用電化學(xué)修飾技術(shù)，顯著降低了電極界面阻抗，提高了電生理記錄信號(hào)的質(zhì)量和穩(wěn)定性。文章利用該光電極陣列對(duì)光遺傳調(diào)控前后不同腦區(qū)之間神經(jīng)元的同步化關(guān)系進(jìn)行了分析，通過(guò) 4'， 6-二脒基-2-苯基吲哚染色確定了光電極的植入位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種多腦區(qū)光電極陣列適用于多腦區(qū)水平的研究，并且容易與其他在體研究方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定神經(jīng)環(huán)路的精確解析。

光遺傳學(xué)；多腦區(qū)；神經(jīng)環(huán)路解析；光電極陣列；表面修飾

1 引 言

目前，全球腦疾病的患者人數(shù)已經(jīng)超過(guò) 5億，由此產(chǎn)生的醫(yī)療負(fù)擔(dān)每年達(dá)數(shù)萬(wàn)億美元，高居全部疾病之首。為了深入了解腦疾病的發(fā)病和干預(yù)機(jī)制，推動(dòng)新型診療技術(shù)的發(fā)展，各國(guó)紛紛加大了對(duì)腦科學(xué)研究的投入。例如，歐洲在 2013年初啟動(dòng)了投入 15 億美元的人腦工程；美國(guó)隨后也啟動(dòng)了名為“通過(guò)推動(dòng)創(chuàng)新型神經(jīng)技術(shù)開(kāi)展大腦研究計(jì)劃”（即原“腦活動(dòng)圖譜計(jì)劃”），旨在繪制出人腦活動(dòng)圖譜，了解腦的運(yùn)行機(jī)理，繼而幫助促進(jìn)正常的腦功能和疾病狀態(tài)下的腦功能恢復(fù)［1，2］。由此可見(jiàn)，腦科學(xué)研究已經(jīng)成為全球共同關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

高細(xì)胞特異性和高時(shí)空精準(zhǔn)的神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)和功能解析是理解和治療腦疾病的基礎(chǔ)，而以光遺傳技術(shù)為代表的新一代腦圖譜解析技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這一目的的關(guān)鍵。光遺傳技術(shù)是正在迅速發(fā)展的一項(xiàng)多學(xué)科交叉的生物技術(shù)，它通過(guò)光感基因病毒載體實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的選擇性調(diào)控，利用光刺激實(shí)現(xiàn)外界信息的寫(xiě)入，借助在體光電極陣列技術(shù)實(shí)現(xiàn)特定行為下的電生理信息讀取，進(jìn)而精確解析某一特定神經(jīng)環(huán)路的功能特征以及與行為輸出之間的聯(lián)系。Nature Methods 期刊在 2010年將光遺傳技術(shù)評(píng)選為當(dāng)年的最佳技術(shù)（Method of the Year），并且在 2014年對(duì)最近十年重大技術(shù)的回顧（Ten Years of Methods）中評(píng)論道“光遺傳技術(shù)引發(fā)的革命正在改變神經(jīng)科學(xué)”。光遺傳技術(shù)已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究中不可或缺的技術(shù)，正在被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室用于神經(jīng)環(huán)路功能的精確解析當(dāng)中。

由于光遺傳技術(shù)同時(shí)兼具毫秒級(jí)別的時(shí)間分辨率和細(xì)胞選擇性，彌補(bǔ)了經(jīng)典藥理學(xué)和膜片鉗電生理等技術(shù)的局限性，因此，其在過(guò)去的幾年中被廣泛應(yīng)用腦科學(xué)的研究中，幫助研究者們回答了許多傳統(tǒng)方法無(wú)法回答的難題。借助光遺傳技術(shù)，人們深入研究了記憶的存儲(chǔ)、提取和消退等過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了對(duì)帕金森氏病和癲癇等疾病的在體干預(yù)，并且成功解析了與焦慮、抑郁、成癮、恐懼和抉擇等行為相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路。然而，目前光遺傳技術(shù)研究工具的發(fā)展相對(duì)滯后，無(wú)法完全滿(mǎn)足科研的需求。大腦特定功能的實(shí)現(xiàn)是不同腦區(qū)神經(jīng)元協(xié)同作用的結(jié)果，如何在自由活動(dòng)動(dòng)物多腦區(qū)水平穩(wěn)定地實(shí)施光遺傳調(diào)控下的神經(jīng)環(huán)路編碼解析，仍然是困擾研究者們的一大難題。

早在 20 世紀(jì)80年代，多通道電生理記錄技術(shù)就已經(jīng)開(kāi)始用于記錄神經(jīng)元胞外的電信號(hào)來(lái)評(píng)價(jià)神經(jīng)元的電活動(dòng)［3］，但目前用于神經(jīng)環(huán)路解析的光電極陣列仍多采用實(shí)驗(yàn)室自制的方式：在商品化的鎢絲電極、猶他電極［4］、密歇根電極［5］以及金屬絲電極陣列等［6，7］的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)。人類(lèi)大腦異常復(fù)雜，某一行為或某一種疾病同時(shí)可能涉及到多個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)環(huán)路［8］。因此，必須發(fā)展一種易于制備和使用的多腦區(qū)光電極陣列同時(shí)對(duì)多個(gè)腦區(qū)的神經(jīng)環(huán)路進(jìn)行解析。然而，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道在自由活動(dòng)水平實(shí)現(xiàn)多腦區(qū)步進(jìn)式光遺傳調(diào)控和電生理記錄的光電極陣列裝置。

此外，由于植入式光電極陣列直接與神經(jīng)組織接觸，因此必須考慮其生物相容性問(wèn)題。當(dāng)光電極陣列植入體內(nèi)后，由于手術(shù)創(chuàng)傷或者植入裝置的生物相容性問(wèn)題往往會(huì)引起炎性反應(yīng)，進(jìn)而形成組織包囊，使得電極界面阻抗急劇升高。另外，炎性反應(yīng)也可能會(huì)導(dǎo)致植入電極周?chē)窠?jīng)元的缺失，增大電極和目標(biāo)神經(jīng)元的距離，進(jìn)一步減弱刺激和記錄的效果。雖然采用高分子材料和生物活性物質(zhì)對(duì)電極表面進(jìn)行修飾能提高電極與神經(jīng)界面的生物相容性，降低炎癥反應(yīng)［9］，但這種方法的長(zhǎng)期穩(wěn)定性仍有待考察，并且步驟繁瑣，不易被神經(jīng)科學(xué)研究者掌握。相比之下，采用步進(jìn)式的電極陣列設(shè)計(jì)將會(huì)更加適用于多通道的神經(jīng)電生理學(xué)研究［10］。

因此，本文介紹了一種簡(jiǎn)化的多腦區(qū)光調(diào)控和電生理記錄的方法。我們開(kāi)發(fā)了一種用于采集在體四腦區(qū)神經(jīng)電生理信號(hào)的新型金屬絲記錄/刺激電極。簡(jiǎn)化了電化學(xué)修飾的工藝，實(shí)現(xiàn)了對(duì)電極表面進(jìn)行快速修飾，并通過(guò)交流阻抗譜和循環(huán)伏安掃描檢測(cè)，確認(rèn)修飾后的電極具有更好的電化學(xué)性能。將這種進(jìn)行修飾和檢測(cè)的電極用于動(dòng)物的在體電生理記錄，同時(shí)在四個(gè)腦區(qū)采集到了局部場(chǎng)電位和峰電位信號(hào)，并對(duì)采集到的信號(hào)腦區(qū)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析和神經(jīng)元放電分析。此外，我們還對(duì)記錄后的動(dòng)物大腦進(jìn)行了免疫熒光染色，證實(shí)了多腦區(qū)電極記錄位點(diǎn)的準(zhǔn)確性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 電極制備

首先定制規(guī)格為 7.0 mm ×8.5 mm 的印刷電路板（Printed Circuit Board，PCB）板，并根據(jù)特定腦區(qū)所在位點(diǎn)預(yù)留相應(yīng)尺寸的圓孔。例如，本實(shí)驗(yàn)中 PCB 板上包含有 7 個(gè)圓孔，其中 3 個(gè)用于電極骨架的固定，4 個(gè)用于電極的引導(dǎo)和固定（圖1（a））。通過(guò)對(duì)應(yīng)尺寸的螺釘將 3 塊 PCB板以圖1（b）中平行的方式固定成一個(gè)電極骨架，其中螺釘位于 PCB 板頂角附近。隨后，截取同等長(zhǎng)度的聚酰胺硅管和光纖，并將硅管均勻排布在光纖周?chē)?。硅管個(gè)數(shù)與四電極或雙電極數(shù)目相同。將排好的硅管插入相應(yīng)位點(diǎn)的孔洞中，調(diào)整合適位置后將硅管快速固定在骨架上。另取兩個(gè) 32 通道的排針，固定在電極骨架兩側(cè)。

在制作好的電極骨架上，借助顯微鏡將四電極或雙電極以平行于硅管的角度穿入硅管中。其中四電極或雙電極是通過(guò)將帶有絕緣層的 Φ17 μm的 Ni/Cr 金屬絲均勻纏繞成雙電極或四電極制作而成。電極絲一端以不銹鋼管為度量剪去多余長(zhǎng)度，另一端按照通道順序排列一一焊接到已固定好的排針引腳，將焊接完成的電極絲與電極排針一同封裝。最終獲得的電極如圖1（c）所示。

圖1 電極制作過(guò)程部分示意圖Fig. 1 The design and fabrication of multi-circuit optrode arrays

2.2 電化學(xué)修飾和檢測(cè)

電化學(xué)修飾常用電鍍鉑黑的方法［11］，本實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)化了該方法的工藝達(dá)到快速修飾電極的目的。其中電鍍使用的鉑酸溶液配制比為 2 mmol/L PtCl4：100 mmol/L HCl。

電化學(xué)修飾和電化學(xué)性能檢測(cè)在 Gamry 電化學(xué)工作站上進(jìn)行。電鍍采用恒電位法－0.25 V（vs. SCE），電流達(dá)到 20～22 nA 為止，恒電位持續(xù)時(shí)間約 20 s。電化學(xué)性能檢測(cè)采用交流阻抗譜和循環(huán)伏安曲線(xiàn)完成，交流阻抗譜的范圍為1～105Hz，擾動(dòng)點(diǎn)位為 10 mV，循環(huán)伏安曲線(xiàn)使用的電位范圍為－0.6～+0.6 V （vs. SCE），掃描速率為 50 mV/s。

2.3 在體多腦區(qū)電生理記錄和免疫染色

麻醉電生理實(shí)驗(yàn)的手術(shù)方法與已有文獻(xiàn)中報(bào)道一致，區(qū)別在于需要同時(shí)在四個(gè)記錄位點(diǎn)的顱骨上開(kāi)骨窗。本次實(shí)驗(yàn)電生理記錄的位點(diǎn)包括：海馬（HPC）、伏隔核（NAc）、前額葉皮層（mPFC）和杏仁核（Amy）。實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)電極尖端接觸到杏仁核位點(diǎn)上方的軟腦膜時(shí)調(diào)整微推進(jìn)器z 軸坐標(biāo)為 0 點(diǎn)，并通過(guò)軟件控制固定電極的微推進(jìn)器操控電極步進(jìn)下降，到達(dá)目標(biāo)位置后開(kāi)始電生理記錄或光刺激。多通道電生理記錄系統(tǒng)為96 通道的 Plexon 系統(tǒng)。

為確認(rèn)電極在目標(biāo)腦區(qū)的確切位置，我們采取心臟灌流的方法對(duì)完成實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物腦組織進(jìn)行固定。動(dòng)物腦組織經(jīng)后固定、脫水后包埋切片，獲取相應(yīng)腦區(qū)的腦片并進(jìn)行尼氏染色或 4'， 6-二脒基-2-苯基吲哚染色，用 Leica 倒置熒光顯微鏡或共聚焦熒光顯微鏡拍攝電極痕跡和記錄位置。

2.4 數(shù)據(jù)分析

本研究中電生理以 40 kHz 采樣率記錄采集腦區(qū)原始寬頻信號(hào)，通過(guò)低通濾波獲得局部場(chǎng)電位信號(hào)，高通濾波提取神經(jīng)元峰電位信號(hào)。數(shù)據(jù)分析主要包括來(lái)自4個(gè)不同腦區(qū)的獨(dú)立信號(hào)分析，以及腦區(qū)之間的相干性信息。本文將簡(jiǎn)單分析上述信息，具體如下：

（1）神經(jīng)元峰電位的檢測(cè)和聚類(lèi)

由于單根電極會(huì)接收來(lái)自不同細(xì)胞的放電信號(hào)，因此需要根據(jù)波形將峰電位進(jìn)行聚類(lèi)，分離出單個(gè)細(xì)胞的峰電位放電序列。本次實(shí)驗(yàn)主要采用 Plexon 公司的 Offline Sorter 軟件進(jìn)行。首先將記錄的 .plx 格式文件導(dǎo)入軟件中，將電極類(lèi)型改為四電極，選擇記錄數(shù)據(jù)的通道，用 Butterworth 濾波器進(jìn)行高通濾波，截止頻率為 300 Hz。本文使用的峰電位檢測(cè)方法是進(jìn)行閾值檢測(cè)，選擇信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的－6 倍作為閾值線(xiàn)，超過(guò)該閾值線(xiàn)的作為峰電位。由于每個(gè)峰電位波形不一樣，因此閾值線(xiàn)與原始信號(hào)相交點(diǎn)并不對(duì)應(yīng)著峰電位不同的區(qū)間時(shí)刻，因此需要將峰電位的波峰進(jìn)行對(duì)齊，之后進(jìn)行降維聚類(lèi)。本次實(shí)驗(yàn)中主要采用主成分分析法進(jìn)行降維，利用模板匹配與 k 均值算法對(duì)峰電位進(jìn)行聚類(lèi)分析。選擇的 3 個(gè)主成分可以根據(jù)4個(gè)通道的信噪比來(lái)選擇信噪比較高的多個(gè)或一個(gè)通道的第一主成分、第二主成分、第三主成分等，確定每一團(tuán)的中心之后利用模板匹配的方法進(jìn)行聚類(lèi)，根據(jù)波形去除檢測(cè)出來(lái)的噪聲，保留峰電位信號(hào)。所有通道分析完成之后，將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)為 .plx 或 .nex格式的文件便于用 Matlab 進(jìn)行讀入與分析處理。

（2）功率譜分析

為了研究隨著時(shí)間變化或外界刺激下不同頻段的功率變化情況，需要進(jìn)行功率譜分析，該步驟可以用 Matlab 或 NeuroExplorer 軟件進(jìn)行處理分析。對(duì)于上述數(shù)字信號(hào)，選取 0～100 Hz 頻段計(jì)算對(duì)應(yīng)功率，并且選取固定時(shí)間窗，計(jì)算該時(shí)間窗之內(nèi)信號(hào)的自相關(guān)并進(jìn)行傅里葉變換，計(jì)算功率。顏色從藍(lán)到紅表示數(shù)值從小到大。隨后，移動(dòng)時(shí)間窗，計(jì)算了 120～210 s 的功率譜，其中 160～190 s為光遺傳刺激的時(shí)間階段。

（3）相干性分析

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

3.1 電極及其電化學(xué)性能

本文基于可步進(jìn)電極的電極支架，設(shè)計(jì)了一種由電極支架支撐并確定電極位置的多腦區(qū)記錄/刺激電極，根據(jù)上文中實(shí)驗(yàn)部分電極制備的方法即可獲得如圖1（d）中所示的四腦區(qū)電極。該實(shí)例中的電極擬用于杏仁核、海馬、皮層和伏隔核的同時(shí)記錄，可得單個(gè)神經(jīng)元放電以及局部場(chǎng)電位記錄。此外，通過(guò)在電極上耦合上光纖，本實(shí)驗(yàn)還實(shí)現(xiàn)了單個(gè)或某兩個(gè)腦區(qū)的同步光刺激。電極制備完成后，為確保每個(gè)通道能夠記錄到高信噪比的神經(jīng)信號(hào)，我們對(duì)每個(gè)通道逐一檢測(cè)電極性能，并對(duì)檢測(cè)正常的電極進(jìn)行電化學(xué)修飾。通道不正常的可能因素包括接觸不良導(dǎo)致的斷路、相鄰?fù)ǖ乐g短路、電極絕緣層破損等。電極由12～17 μm 的金屬絲制成，在 1000 Hz 下的阻抗在 2 MΩ 左右，而多通道電生理記錄儀在獲得良好的記錄信號(hào)信噪比情況下需要電極阻抗在 500 kΩ左右（小于 1 MΩ）。因此為記錄到良好的電生理信號(hào)，獲得理想的信噪比，需要對(duì)電極表面進(jìn)行電化學(xué)修飾，改善電極阻值。本文采用恒電位法電鍍鉑黑的方法，電鍍曲線(xiàn)如圖2（a）所示，電鍍15.5 s 后電流達(dá)到 21.54 nA。

為檢測(cè)電化學(xué)修飾之后電極性能，我們采用循環(huán)伏安掃描和交流阻抗譜兩種方法進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在人工腦脊液中以三電極體系連接進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)使用的參比電極為飽和甘汞電極，對(duì)電極為鉑絲電極。結(jié)果如圖2（b）和圖2（c） 所示。其中紅色為電極制成后的檢測(cè)結(jié)果，藍(lán)色為電鍍鉑黑之后的檢測(cè)結(jié)果。如圖2 所示，電鍍前電極的電容性差、阻抗高，電鍍之后電極電容性有明顯提高，且阻抗有明顯降低，如在電生理測(cè)試相關(guān)的最受關(guān)注的 1000 Hz 下阻抗，從2.4 MΩ 下降到了 412 KΩ。電極修飾至該阻抗時(shí)通常能獲得信噪比較好的信號(hào)。

3.2 電生理記錄及其位置確認(rèn)

我們將電鍍并檢測(cè)好的四腦區(qū)電極在 VGATChR2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物上進(jìn)行電生理記錄，同時(shí)采集局部場(chǎng)電位和神經(jīng)元放電信號(hào)，并在特定腦區(qū)進(jìn)行光刺激記錄光刺激對(duì)各腦區(qū)神經(jīng)元的影響。圖3 所示為四腦區(qū)同步電生理記錄及光刺激原始數(shù)據(jù)。其中圖3（a）為神經(jīng)元放電連續(xù)信號(hào)，為原始信號(hào) 300 Hz 高通濾波所得；（b）為局部場(chǎng)電位信號(hào)。黑色、藍(lán)色、綠色和洋紅色四個(gè)通道分別選自四個(gè)腦區(qū)，所有記錄到的信號(hào)不止于這幾個(gè)通道。光刺激第四個(gè)通道所在腦區(qū)，刺激參數(shù)為頻率 60 Hz、光強(qiáng) 10 mW 的波長(zhǎng)為 473 nm 藍(lán)光，每次刺激持續(xù) 30 s。從圖3（a）中可以看出，光刺激時(shí)胞體神經(jīng)元被激活興奮產(chǎn)生動(dòng)作電位，而第二個(gè)和第三個(gè)通道所處腦區(qū)電活動(dòng)顯著性被抑制，第一個(gè)通道所處腦區(qū)活動(dòng)被激活，更細(xì)致的信息可通過(guò)后續(xù)電生理信號(hào)分析獲得。由圖3（b）可看出，除了光刺激本地的局部場(chǎng)電位受到光刺激的影響，其他三個(gè)腦區(qū)都在光刺激期間以及光刺激結(jié)束后發(fā)生變化。

圖2 電鍍鉑黑前（紅）后（藍(lán)）電極電化學(xué)性能對(duì)比Fig. 2 Electrochemical characteristics before （red） and after （blue） electrical deposition

圖3 四腦區(qū)同步電生理記錄及光刺激Fig. 3 Representative examples of electrophysiological recordings in4brain regions

為確認(rèn)電生理信號(hào)記錄的來(lái)源是否屬于目標(biāo)的核團(tuán)，在記錄后將動(dòng)物進(jìn)行灌注固定以及免疫染色，對(duì)電極、光纖的位置進(jìn)行拍照確認(rèn)，如圖4 所示。

3.3 多腦區(qū)電生理數(shù)據(jù)分析

電生理信號(hào)是腦內(nèi)神經(jīng)元各類(lèi)電活動(dòng)變化的綜合，包含信息通常較多且較為復(fù)雜，其中場(chǎng)電位信號(hào)反應(yīng)局部電活動(dòng)變化，一般需要通過(guò)數(shù)據(jù)處理進(jìn)行進(jìn)一步解析。本文同時(shí)記錄了四個(gè)腦區(qū)的電生理信號(hào)，并加入光刺激事件，通過(guò)計(jì)算光刺激前后局部場(chǎng)電位的能量譜以及腦區(qū)之間場(chǎng)電位相干性分析，分別如圖5 和圖6 所示，解析光刺激對(duì)四個(gè)腦區(qū)電活動(dòng)的影響。

圖4 光電極（箭頭所示）位置確認(rèn) （標(biāo)尺=250 μm）Fig.4DAPI-labeled brain sections showing the locations of optrode tips （arrows）（bar=250 μm）

圖5 光刺激杏仁核引發(fā)的局部場(chǎng)電位能量譜分析（藍(lán)色標(biāo)記為光刺激時(shí)間）Fig. 5 The time-frequencypower spectrum before and during light stimulation（The thick blue line denotes the 30 s stimulation period）

從圖5 的局部場(chǎng)電位功率譜我們可以發(fā)現(xiàn)光刺激腦區(qū) d，圖5（a）中顯示光刺激結(jié)束后在不同頻段上能量均有明顯的上升，圖5（b-c）與（a）相似。圖6 顯示了多腦區(qū)之間的場(chǎng)電位相干性分析。黑色為正常 VGAT-ChR2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物上腦區(qū)間場(chǎng)電位相關(guān)性，圖中虛線(xiàn)表示在 P 值為 99%時(shí)對(duì)應(yīng)的置信水平；藍(lán)色為光刺激激活杏仁核腦區(qū)中抑制性神經(jīng)元時(shí)腦區(qū)間的場(chǎng)電位相干性。圖6（b）中 20 Hz 左右頻段處光刺激顯著升高了NAc-BLA 兩個(gè)腦區(qū)間的局部場(chǎng)電位相干性，而在該頻段其他兩個(gè)腦區(qū)之間的局部場(chǎng)電位相關(guān)性隨光刺激影響不大。

4 結(jié) 論

目前光遺傳技術(shù)研究工具的發(fā)展相對(duì)滯后，無(wú)法完全滿(mǎn)足科研的需求。大腦特定功能的實(shí)現(xiàn)是不同腦區(qū)神經(jīng)元協(xié)同作用的結(jié)果。在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中多腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)的記錄要求下，猶他電極［7］的使用受到了較大的限制，記錄深部腦區(qū)或是同時(shí)記錄幾個(gè)腦區(qū)都很難用猶他電極來(lái)實(shí)現(xiàn)，而密歇根電極［8］則因其空間尺寸較纖細(xì)而在麻醉電生理和清醒固定的電生理記錄中占有一定優(yōu)勢(shì)。目前報(bào)道的自由活動(dòng)電極主要為單個(gè)腦區(qū)或雙腦區(qū)同時(shí)記錄［12］，而多腦區(qū)同時(shí)記錄的自由活動(dòng)電極尚未報(bào)道過(guò)。本文解決了動(dòng)物在體水平多個(gè)腦區(qū)的同步電生理記錄與光神經(jīng)調(diào)控技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)——多腦區(qū)光電極陣列。

圖6 VGAT-ChR2 小鼠在光遺傳刺激前（黑）后（藍(lán)）的場(chǎng)電位相干分析Fig. 6 The LFP coherences of VGAT-ChR2 transgenic mice before （black） and during （blue） optogenetic stimulations

本文設(shè)計(jì)并制備了用于海馬、杏仁核、伏隔核和前額葉等四個(gè)腦區(qū)光遺傳刺激和電生理記錄的多腦區(qū)多通道光電極陣列，并且簡(jiǎn)化了電化學(xué)修飾方法。此外，還通過(guò)循環(huán)伏安法和交流阻抗法對(duì)光電極陣列進(jìn)行了檢測(cè)，證實(shí)了這種光電極陣列具有較高的電容性和較低的電化學(xué)阻抗，可獲得比較好的信噪比。隨后，將該光電極陣列成功植入到小鼠的四個(gè)目標(biāo)腦區(qū)進(jìn)行電生理記錄與光刺激，同時(shí)獲得了自發(fā)和光刺激時(shí)的四個(gè)腦區(qū)的神經(jīng)元放電和局部場(chǎng)電位信號(hào)，克服了動(dòng)物在體水平多腦區(qū)同步電生理記錄的障礙。另外，通過(guò)熒光染色方法確認(rèn)的記錄位點(diǎn)，對(duì)記錄的電生理信號(hào)進(jìn)行了分析，研究了光遺傳刺激對(duì)腦區(qū)間同步化的影響。綜上所述，本文發(fā)展的多腦區(qū)光電極陣列制備方法進(jìn)一步完善了光遺傳技術(shù)，非常適用于對(duì)神經(jīng)精神疾病發(fā)病機(jī)制和治療機(jī)理的研究，以及病理狀態(tài)下神經(jīng)環(huán)路的精確解析。

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Optrode Arrays for Multi-Circuit Dissection

LIU Yaohan1，2LI Juan1，2ZHONG Cheng1，2TANG Yongqiang1LU Yi1

1（ Shenzhen Institutes of Advanced Technology， Chinese Academy of Sciences， Shenzhen 518055， China ）
2（ University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China ）

Optogenetics has been successfully applied to understand the mechanisms of neuropsychiatric diseases through the precise temporal control of specific neural circuitries. However， it remains a great challenge to integrate optogenetic modulation with electrophysiological recordings in multiple brain regions in vivo. In this study， a simplified method for the fabrication and electrochemical modification of the multicircuit optrode arrays was developed. The modified optrode arrays exhibited a significantly higher capacitance and lower electrochemical impedance at 1 kHz as compared to unmodified optrodes. The optrode arrays were chronically implanted into the brain of VGAT-ChR2 transgenic mice. Spontaneous action potentials and local field potentials as well as light-evoked responses were obtained in4different brain regions in vivo. The crossarea synchronizations were analyzed and the localizations of the implanted optrode arrays were confirmed by 4'， 6-diamidino-2-phenylindole immunofluorescence staining. All these characteristics are greatly desired in optogenetic applications， and the fabrication method of the optrodes can be easily integrated with other in vivotechniques to build more advanced tools for the dissection of neural circuitry.

optogenetics； multiple brain regions； neural circuitry dissection； optrode array； surface modification

Q 189 Q 424

A

2015-04-03

2015-04-28

劉瑤函，碩士研究生，研究方向?yàn)樯窠?jīng)生物學(xué)；李娟，碩士研究生，研究方向?yàn)樯窠?jīng)信號(hào)處理；鐘成，博士研究生，研究方向?yàn)樯窠?jīng)電生理；唐永強(qiáng)，研究助理，研究方向?yàn)樯窠?jīng)電生理；魯藝（通訊作者），副研究員，研究方向?yàn)槟X圖譜解析技術(shù)，E-mail：luyi@siat.ac.cn。