雷 琎，張紫秋，王智柔，鄧先余，林連兵

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500)

家蠅是我國(guó)常見(jiàn)的一種資源性的昆蟲(chóng)。研究發(fā)現(xiàn)，家蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)含有多種抗菌物質(zhì)，其中包括蛋白類，如:天蠶素、昆蟲(chóng)防御素等(馬紅霞等，2007)，非蛋白類如:1-LPE (Meylaers et al.，2004)、幾丁質(zhì)(Sukontascn et al.，2000)、尿囊素等(Moreira et al.，2003)。這些抗菌物質(zhì)具有分子量小，熱穩(wěn)定性好，廣譜抗菌 (翟朝陽(yáng)，1996)甚至是抑制腫瘤細(xì)胞等特點(diǎn) (Mohammad et al.，1995)。

利用基因工程克隆抗菌肽，其種類少，效果不佳且蠅蛆體內(nèi)有非蛋白抗菌物質(zhì)，這部分物質(zhì)無(wú)法通過(guò)基因工程的方法合成，所以如何高效制備抗菌物質(zhì)是工業(yè)上一直探索的問(wèn)題。

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于家蠅抗菌物質(zhì)的研究主要集中在抗菌肽的誘導(dǎo)與單蛋白的純化上，如周永富等(1997)探究了家蠅抗菌肽的誘導(dǎo)條件，陸婕等(2006)分離出單一的家蠅抗菌肽MD7095，陸婕等(2007)人采用加熱層析法和海藻酸法優(yōu)化工業(yè)制備抗菌肽的方法，對(duì)于抗菌物質(zhì)大量工業(yè)化制備的文獻(xiàn)較少見(jiàn)。

在陸婕等(2007)采用的海藻酸吸附和加熱后凍干再層析的制備方法中，由于海藻酸的昂貴和層析處理的樣品量少，在大規(guī)模制備上仍然存在一定的局限性。切向流是一種大體積的超濾系統(tǒng)，根據(jù)黨向利(2008)的研究結(jié)果表明，使用10 kDa的小體積超濾濃縮管就能很好的回收家蠅抗菌肽，基于此結(jié)論本文采用加熱后再利用切向流超濾法和直接凍干法提取抗菌物質(zhì)，通過(guò)分析比較，探索最佳提取抗菌物質(zhì)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)蠅蛆:在65℃下干燥24 h的家蠅Musca domestica 幼蟲(chóng)

測(cè)試菌株:金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC6538、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis CMCC (B)63501、大腸桿菌 Escherichia coli 0157NOTC12900、大腸桿菌Escherichia coli Rosetta、沙門(mén)氏菌Salmonella enteritidis CMCC (B)50335、志賀氏菌Shigella dysenteriae A7CC10231 (以上菌種購(gòu)自廣東微生物研究所)

主要試劑:GE Hiload Superdex 75 (GE Amersham)、LB 培養(yǎng)基(安琪)

主要儀器:層析系統(tǒng)AKTA Explorer (GE Amersham)、蛋白電泳系統(tǒng)(GE Amersham)、恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒)、粉碎機(jī)(普潤(rùn))、真空冷凍干燥器(Jouan)、蠕動(dòng)泵(Lopump)、10 kDa 切向流膜包(Sartorius)

1.2 方法

1.2.1 蠅蛆抗菌物質(zhì)提取液制備

將400 g 干蠅蛆用粉碎機(jī)磨成粉末，將其溶于2 L 0.5 mol/L 乙酸溶液中，在4℃下靜置10 h，4℃8000 rpm 離心15 min，將上清通過(guò)1000 目的網(wǎng)目后置于100℃水浴鍋中水浴10 min，4℃8000 rpm 離心15 min，取上清，并用真空抽濾裝置透過(guò)0.22μm 濾膜，取濾液用于抗菌物質(zhì)的濃縮。

1.2.2 抗菌物質(zhì)的濃縮

本文采用兩種不同的方法濃縮抗菌物質(zhì)，具體方法:(1)超濾法:采用切向流超濾法(如圖1的裝置)，將其中1 L 抗菌物質(zhì)酸提取液在4℃通過(guò)10 kDa的切向流系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，至50 mL 獲得濃縮液。(2)直接凍干法:將抗菌物質(zhì)提取液分裝于幾個(gè)平皿中進(jìn)行真空冷凍干燥，將干燥后的粉末再次溶回50 mL 0.5 mol/L 乙酸溶液，以13000 rpm 離心去除沉淀，獲得可溶性的濃縮液，用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定。

圖1 切向流超濾裝置Fig.1 Device of tangential flow ultrafiltration

1.2.3 凝膠過(guò)濾層析

參照鐘雅(2007)的層析條件并適當(dāng)改進(jìn)，用0.2 mol/L 乙酸溶液平衡Superdex 75 柱子，分別將以上濃縮液以13000 rpm 離心后，通過(guò)0.22μm 針頭濾膜，取其中2 mL 進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析。以2.5 mL/min的速度用0.2 mol/L 乙酸進(jìn)行洗脫，根據(jù)280 nm 處監(jiān)測(cè)值對(duì)樣品分離的各組分進(jìn)行收集，每管收集10 mL，并凍干后，每個(gè)組分加入1 mL 蒸餾水溶解，供抗菌活力檢測(cè)用。同時(shí)取10 mL 0.2 mol/L 醋酸凍干后溶于1 mL 蒸餾水中作為空白對(duì)照。切向流法制備層析的組分為A 組，直接凍干法制備的組分為B 組，空白組為C 組。

1.2.4 抗菌活力檢測(cè)

采用平板打孔法，取OD600 ≈0.8 待測(cè)菌500μL，加入到20 mL 預(yù)熱的LB 固體培養(yǎng)基中，混勻后倒平板。待瓊脂凝固后打孔，向孔內(nèi)分別加入40μL 上述各組分的溶液，自然擴(kuò)散30 min后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法(Coligan，2003)，測(cè)定可溶性蛋白含量。

1.2.6 蛋白質(zhì)電泳

采用Tricine-SDS-PAGE 法進(jìn)行電泳，參考Herman 等(1987)的方法，分離膠濃度為17%，濃縮膠濃度為5%，每孔上樣20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種濃縮方法制備液中蛋白含量測(cè)定結(jié)果

利用超濾法得到的抗菌物質(zhì)為深褐色濃縮液，無(wú)沉淀;利用凍干法制備出的抗菌物質(zhì)也為深褐色，但有較多沉淀。

通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定超濾法制備液的可溶蛋白含量為10.2 mg/mL，而直接凍干法得到的可溶蛋白含量?jī)H為1.2 mg/mL。

圖2 兩種不同濃縮液的凝膠層析結(jié)果Fig.2 Gel chromatography results of two different extraction methods

2.2 凝膠過(guò)濾層析結(jié)果

對(duì)采用超濾法獲得的濃縮液進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析后，收集得到25個(gè)組分(A1-A25)，直接凍干法獲得的濃縮液則得到15個(gè)組分(B1-B15)。

2.3 各組分抗菌活性的分布

采用7 種不同的測(cè)試菌對(duì)切向流超濾濃縮液和直接凍干濃縮液的不同組分抗菌能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1 和表2 所示。A1、A2、A10、A11、A12、A13、A20、A21 具有抗菌活性，但抗菌譜不盡相同。在這9個(gè)具有抗菌活性的組分中，A1、A2、A10、A11、A12、A13 抗菌譜均較窄，僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和部分革蘭氏陰性細(xì)菌有抑菌能力，而A20、A21的抗菌譜較寬，對(duì)幾種測(cè)試菌都有不同程度的抑菌效果。但通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)，A1、A2、A10、A11、A12、A13 組分的蛋白量均超過(guò)0.5 mg/mL，而A20、A21 難以檢測(cè)的其含有蛋白，可能為非蛋白成分。

采用直接凍干法提取的蛋白再進(jìn)行凝膠層析后，得到15個(gè)組分，除了B4 和B14 以外，所有組分均具有抗菌活性。其中B1、B2 僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和部分革蘭氏陰性細(xì)菌有抑菌能力，兩個(gè)組分的蛋白量均超過(guò)0.2 mg/mL;B6-B12 具有較寬的廣譜抗菌能力，對(duì)7 種測(cè)試菌都有不同程度的抑菌效果，且有較強(qiáng)抗菌活性，其抑菌圈超過(guò)了1 cm，但無(wú)法通過(guò)考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)到蛋白，也有可能是非蛋白成分。

空白對(duì)照組C 組對(duì)6 種測(cè)試菌均無(wú)抑菌效果。

表1 超濾法提取的抗菌物質(zhì)各組分抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effect of antimicrobial substances components extracted by ultrafiltration method

表2 直接凍干法提取的抗菌物質(zhì)各組分抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of antimicrobial substances components extracted by direct freeze-drying

2.4 活性組分的電泳結(jié)果

使用Tricine-SDS-PAGE 進(jìn)行電泳，每孔上樣20μL，結(jié)果如圖3 所示(箭頭表示)。采用超濾法分離得到的各組分中，A2 分布在75 kDa、48 kDa、24 kDa、17 kDa 和11 kDa 幾個(gè)位置，A11主要集中在9 kDa-41 kDa，A12 主要集中在25 kDa-34 kDa 和7 kDa-18 kDa，A13 主要集中在25 kDa-33 kDa、15 kDa-17 kDa 和6 kDa-12 kDa 三段。A20 和A21 電泳后沒(méi)有顯示出明顯的條帶(圖中未顯示)，結(jié)合蛋白濃度測(cè)定的結(jié)果，斷定為非蛋白類物質(zhì)。B1、B2 主要集中在15 kDa-17 kDa 和6 kDa-10 kDa 這兩段。B5-B11 電泳后沒(méi)有顯示出任何條帶(圖中未顯示)，結(jié)合蛋白濃度的測(cè)定結(jié)果，也推斷為非蛋白類物質(zhì)。

A11 和A12的抗菌強(qiáng)度均好于A13、B1、B2，對(duì)比A11、A12、A13、B1、B2的電泳條帶可知有一部分的蛋白類的抗菌物質(zhì)處在11 kDa-41 kDa這個(gè)范圍。A2 具有一定的抗菌活性，但是由于抗菌物質(zhì)在制備過(guò)程中進(jìn)行了沸水浴，所以電泳圖中的100 kDa、75 kDa、48 kDa 條帶的位置是少量未熱變性沉淀的蛋白，不具有抗菌活性，而24 kDa、17 kDa、11 kDa 條帶是具有抗菌活性的蛋白。

圖3 抗菌活性組分的電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of fractions with antibacterial activity

3 結(jié)論與討論

家蠅體內(nèi)含有多種抗菌肽，這些抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均有一定的殺滅作用。目前對(duì)抗菌肽的大規(guī)模制備仍處于探索階段。陸婕(2007)等人采用了海藻酸吸附的方法和加熱后直接凍干再層析的方法進(jìn)行了提取，使用海藻酸吸附法并不能得到較高的產(chǎn)率且海藻酸較為昂貴，而使用加熱層析法雖然產(chǎn)率有所提升但是層析并不適合用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)，故上述兩種方法并非工業(yè)化上最優(yōu)方法。根據(jù)黨向利(2008)研究表明，使用10 kDa 超濾濃縮管進(jìn)行超濾，抗菌肽的回收率可達(dá)到99%。由于濃縮管超濾的流速方向與濾膜是垂直的而切向流超濾的流速方向與濾膜是平行的，所以與濃縮管超濾相比切向流超濾不但可以更高的提高回收率而且可以一次性處理更大體積的樣品。本研究采用了加熱后通過(guò)10 kDa 切向流系統(tǒng)超濾和直接凍干兩種方法進(jìn)行抗菌肽的提取，結(jié)果表明利用切向流超濾法得到的可溶蛋白量是直接凍干法可溶蛋白量的8.5 倍?？紤]到切向流超濾是一種簡(jiǎn)單的設(shè)備，使用時(shí)僅需要定期清洗即可重復(fù)使用，對(duì)于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)這是一種簡(jiǎn)單而且有效降低成本的方法。

在對(duì)比兩種制備方法制備的抗菌物質(zhì)的組分分析方面，本研究采用凝膠過(guò)濾層析法，使用Superdex 75 凝膠過(guò)濾層析柱，參照鐘雅(2007)的層析條件并適當(dāng)改變了流速，對(duì)使用兩種提取方法得到的抗菌肽進(jìn)行分離得到了兩種不同的洗脫峰。使用超濾法提取的蛋白進(jìn)行層析后在A280處得到多個(gè)吸收峰，其中收集到的蛋白組分的抗菌譜不如非蛋白組分的抗菌譜廣。使用直接凍干法提取的蛋白在A280處只有兩個(gè)峰，但抑菌試驗(yàn)和蛋白含量檢測(cè)結(jié)果表明未能測(cè)出蛋白的組分無(wú)論從抗菌譜還是抗菌活性均更好。通過(guò) Tricine SDS-PAGE后，通過(guò)分析對(duì)比，能測(cè)出蛋白類的抗菌物質(zhì)的組分分布各不相同，但大致可以斷定抗菌物質(zhì)是分布在11 kDa-41 kDa，而未能測(cè)出蛋白的組分均無(wú)法得到電泳圖，進(jìn)一步證實(shí)這些組分為非蛋白類物質(zhì)。

凝膠過(guò)濾層析過(guò)程中有大量無(wú)法用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)出蛋白含量，但在A280有較高吸光值的物質(zhì)，結(jié)合蛋白檢測(cè)結(jié)果斷定為非蛋白類的抗菌成分，家蠅體內(nèi)除了抗菌肽以外也含有非蛋白類抗菌物質(zhì)，如Meylaers 等(2004)用甲醇從家蠅體內(nèi)提取出抗菌物質(zhì)1-LPE，其分子量為451.2 Da，此外人們還發(fā)現(xiàn)了幾丁質(zhì)、尿囊素等非蛋白類抗菌物質(zhì)(Craezyk et al.，2001)。它們的分子量較小，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒的作用，其中尿囊素還可以促進(jìn)傷口的愈合(羅金香等，2005)。尿囊素在A293處有強(qiáng)烈的吸光度，殼聚糖的衍生物在A260處有最大吸光度，這些非蛋白抗菌組分也會(huì)在A280處會(huì)有一定的吸光度。

通過(guò)凝膠過(guò)濾層析分析顯示，在制備抗菌物質(zhì)的方法上，使用切向流超濾法比直接凍干法得到的蛋白類抗菌組分多，非蛋白類抗菌組分少。通過(guò)蛋白電泳結(jié)果也顯示，使用10 kDa 切向流超濾可以高效回收復(fù)合抗菌物質(zhì)中抗菌蛋白類成分。綜合上述結(jié)果可知，切向流超濾在有效濃縮蛋白類抗菌組分的同時(shí)，非蛋白類抗菌組分也從切向流超濾系統(tǒng)中透過(guò)。非蛋白類的抗菌物質(zhì)可采用噴霧干燥等方法進(jìn)行濃縮干燥。蛋白類抗菌組分與非蛋白類抗菌組分在此過(guò)程中得以分離，同時(shí)也保證了蛋白類的抗菌物質(zhì)得到了最大程度的回收。

在家蠅的抗菌物質(zhì)中，既有蛋白類抗菌物質(zhì)也有非蛋白類抗菌物質(zhì)，在制備蠅蛆抗菌物質(zhì)時(shí)，需充分考慮不同方法獲得的組分差異和制備效率。

References)

Coligan JE.Short Protocols in Protein Science ［M］.Hoboken:John Wiley ＆ Sons，Inc.2003，41-60.

Craezyk TK，Knight R，Gilman RH，et al.The role of non-biting flies in the epidemiology of human infection diseaaes ［J］.Microbe and Infeclion，2001，3:231-235.

Dang XL.Preparation and Study on Separation and Purification of Musca domestica Pupa Natural Antibacterial Peptide ［D］.Guangzhou:Zhongshan Universiry，2008.［黨向利.家蠅蛹天然抗菌肽的制備及其分離純化研究［D］.廣州:中山大學(xué)，2008］

Hermann S，Von GJ.Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kD ［J］.Analytical Biochemistry，1987，166:368-379.

Lu J，Wang JH，Zhong Y，et al.Purification and characterization of weak-acid antibacterial peptide MD7095from Musca domestica larvae［J］.Acta Micrbidogica Sinica，2006，46 (3):406-411.［陸婕，汪俊漢，鐘雅，等.弱酸性家蠅蛆抗菌肽MD7095的分離純化及性質(zhì)研究［J］.微生物學(xué)報(bào)，2006，46 (3):406-411］

Lu J，Zhong Y，Liu L，et al.Optimization of extraction technique for antibacterial peptides from Musca domestica larvae ［J］.Acta Entomologica Sinica，2007，50 (2):106-112.［陸婕，鐘雅，柳林，等.家蠅蛆抗菌肽提取工藝研究［J］.昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2007，50 (2):106-112］

Luo JX，Yang CL，Wu WD.Study and application of Musca domestic antimicrobial peptides ［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2005，42 (3):235-239.［羅金香，楊春龍，吳偉東.家蠅抗菌肽的研究與應(yīng)用［J］.應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2005，42 (3):235-239］

Ma HX，Sun N，Pei ZH，et al.Reseaech progress on antibiotic peptite of Musca domestica ［J］.Chinese Journal of Veterinary Drug，2007，41 (11):45-49.［馬紅霞，孫娜，裴志花，等.家蠅抗菌肽研究進(jìn)展［J］.中國(guó)獸藥雜志，2007，41 (11):45-49］

Meylaers K，Clynen E，Daloze D.Identification of 1-lysophosphatidylethanolamine (C16 ∶1) as an antimicrobial compound in the housefly Musca domestica［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2004，34 (1):43-49.

Sukontascn K，Bunchoo M，Khantawa B.Musca domestica as a mechanicak carrier of becteria in Chiang Mai，North Thailand ［J］.Vector Ecol.，2000，25:114-117.

Mohammad FV，Noorwala M，Ahmad VU，et al.A bidesmosidic triterpenoidal saponins from the roots of Symphytum off icinale ［J］.Planta Med.，1995，61:94.

Moreira CK，Capurro M，Calvo E.The Musca domestica larval hexamerin is composed of multiple，similar polypeptides ［J］.Insect Biochem.Mol.Biol.，2003，33 (4):389-395.

Zhao CY.The progress of studies on insecet antibacterial proteins ［J］.Acta Entomologica Sinica，1996，39 (1):99-104.［翟朝陽(yáng).昆蟲(chóng)抗菌物質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，1996，39 (1):99-104］

Zhong Y.Purification and Partial Characterization of a Novel，Antibacterial Peptide from Musca domestica Larvae ［D］.Wuhan:Huazhong University of Science and Technology，2007.［鐘雅.一個(gè)新家蠅抗菌肽的分離純化和部分性質(zhì)研究［D］.武漢:華中科技大學(xué)，2007］

Zhou YF，Rao JH，Yang JC，et al.Induction of antibacterial substance of Musca domestica ［J］.Journal of Biology，1997，14 (77):23-26.［周永富，饒軍華，陽(yáng)建春，等.家蠅抗菌物質(zhì)的誘導(dǎo)［J］.生物學(xué)雜志，1997，14 (77):23-26］