楊 爽, 尹 姣, 曹雅忠, 樊 東, 李克斌*

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 哈爾濱 150030; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室, 北京 100193)

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麥長管蚜OBP7基因的RNA干擾

楊 爽1,2, 尹 姣2, 曹雅忠2, 樊 東1*, 李克斌2*

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 哈爾濱 150030; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室, 北京 100193)

OBP是蚜蟲嗅覺功能中的一類重要分泌蛋白,能選擇性地結(jié)合氣味分子并進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本試驗使用顯微注射法將麥長管蚜OBP7的小干擾RNA(siRNA)導(dǎo)入麥長管蚜體內(nèi),通過qRT-PCR檢測OBP7 mRNA相對表達(dá)量的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在siRNA濃度0.32 μg/μL,注射量23 nL,注射后24 h,麥長管蚜成蚜的mRNA相對表達(dá)量降低到37.1%,證明了顯微注射方式進(jìn)行RNA干擾的可行性。在注射23 nL的siRNA-467,經(jīng)過36 h后,麥長管蚜出現(xiàn)了對EβF趨性行為的改變(P<0.05),表明OBP7蛋白在麥蚜對EβF的識別過程中具有重要作用。

麥長管蚜; OBP7; RNA干擾; 熒光定量PCR

OBP7(odorant binding protein 7,OBP7)是鐘濤在麥長管蚜中發(fā)現(xiàn)的一種氣味結(jié)合蛋白基因,基因登錄號為GQ847859.2,全長為616個堿基對;該蛋白對報警信息素的主要成分反-β-法尼烯(EβF)有很強(qiáng)的結(jié)合特性,鐘濤推測它可能是報警信息素結(jié)合受體[1]。氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein,OBP)是蚜蟲嗅覺功能中的一類重要分泌蛋白,它主要識別6個保守位置的半胱氨酸,并形成3對內(nèi)鎖的二硫鍵結(jié)構(gòu)[2],能選擇性地結(jié)合氣味分子并能進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。嗅覺是蚜蟲與外部環(huán)境進(jìn)行信息交流的主要手段,在覓食、聚集、選擇生境及危險規(guī)避等行為中起著重要作用[4]。

麥長管蚜[Sitobionmiscanthi(Takahashi)]在分類學(xué)上屬半翅目胸喙亞目蚜科,通常進(jìn)行周期性的孤雌生殖[5]，是我國各麥區(qū)的優(yōu)勢種。它通過刺吸式口器吸食小麥營養(yǎng)、影響其光合作用,而且還傳播麥類病毒如大麥黃矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus,BYDV)等,導(dǎo)致小麥減產(chǎn)和品質(zhì)下降,嚴(yán)重威脅小麥生產(chǎn)[6]。20世紀(jì)70年代以來,麥蚜的危害由間歇性增長發(fā)生變成如今的常發(fā)性發(fā)生,發(fā)生數(shù)量和面積呈現(xiàn)逐年上升趨勢[7]。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是Fire等發(fā)現(xiàn)的一種能特異性干擾目的基因mRNA表達(dá)的技術(shù)[8]。通過向目標(biāo)生物體內(nèi)導(dǎo)入特定雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)能引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默[9]。小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)能與Dicer以及Argonaute蛋白的PAZ區(qū)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。RISC在ATP作用下被激活并解鏈,與目的mRNA配對的一條鏈引導(dǎo)RISC特異性切割 mRNA并使之降解[10],另一條鏈在RNA依賴性的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRP)的作用下,擴(kuò)增生成大量新的siRNA。新生成的siRNA又形成RISC,然后繼續(xù)降解目的mRNA。通過此機(jī)制將RNA干擾信號不斷在細(xì)胞內(nèi)放大[11],最終使目的基因mRNA的表達(dá)量降低。

將dsRNA或siRNA導(dǎo)入生物體內(nèi)的方法有浸泡法、喂食法、注射法等[12]。Fire 等最早通過浸泡法在線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象[8]。于文娟和王暉等通過Parafilm膜夾營養(yǎng)液喂食法成功對麥長管蚜進(jìn)行了RNA干擾試驗,并取得了較好的干擾效果[13-14]。注射siRNA法能精確地對注入的siRNA劑量及注射部位進(jìn)行調(diào)整從而取得高水平的干擾效果。本試驗選擇顯微注射法向麥長管蚜體內(nèi)導(dǎo)入siRNA,研究siRNA對麥長管蚜OBP7 mRNA干擾的效果,以期為探索或解析OBP7的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥長管蚜于2013年4月采自河北省廊坊市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試基地。在室溫(20±2)℃、相對濕度60%～80%,光照周期L∥D=16 h∥8 h的條件下用小麥苗進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖。當(dāng)土培小麥苗出土約3 cm時,把麥長管蚜轉(zhuǎn)移到麥苗上。小麥品種是感蚜蟲品種‘中旱101’。

RNA提取試劑TRIzol Reagent購自Invitrogen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect real time),熒光定量試劑SYBR Premix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購自TaKaRa公司,普通PCR試劑TaqMix購自Biomed公司。顯微注射儀Nanoliter 2010,購自World Precision Instruments公司。反-β-法尼烯購自Sigma Aldrich公司,石蠟油購自廣達(dá)恒益公司,大氣采樣儀購自北京市勞動保護(hù)科學(xué)研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

選取2日齡麥長管蚜成蚜若干頭,按照TRIzol Reagent技術(shù)手冊提取RNA,用1.2%瓊脂糖凝膠電泳及微量紫外分光光度計對RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測,合格后留存放入-80 ℃冰箱中備用。

使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成熒光定量PCR所需要的模板cDNA。Oligo (dT)引物和隨機(jī)六聚體引物按1∶1的體積比混合作為反轉(zhuǎn)錄引物,具體步驟參見PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒的操作說明。

1.2.2 引物設(shè)計和siRNA的合成

實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)選擇β-actin基因作為內(nèi)參基因,利用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物。表1中F1、R1和F2、R2分別為OBP7和β-actin基因PCR及qPCR的上下游引物，擴(kuò)增片段長度分別為241 bp和230 bp；siRNA-467是以O(shè)BP7 mRNA為靶序列設(shè)計的雙鏈小干擾RNA,由上海吉瑪公司設(shè)計合成。siRNA-467的一條鏈與圖1所示的灰色部分堿基互補(bǔ)，雙鏈的3′端添加了“TT”臂。siRNA-NC為雙鏈無意義序列對照。siRNA配制成0.32 μg/μL終濃度的試劑備用。

表1 試驗所用引物及siRNA序列

圖1 OBP7基因的siRNA干擾位點Fig.1 The interfering site of small interference RNA in OBP7 gene

普通PCR反應(yīng)體系：forward primer (10 μmol/L)0.5 μL,reverse primer (10 μmol/L)0.5 μL,TaqMix 12.5 μL,cDNA 模板0.5 μL,超純水定容至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s, 35個循環(huán);72 ℃終止延伸10 min;用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

提取未處理的麥長管蚜成蚜總RNA,反轉(zhuǎn)錄后將cDNA模板按100、101、102、103、104倍數(shù)進(jìn)行稀釋,每個濃度3次重復(fù)來繪制實時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實時熒光定量PCR體系：SYBR PremixExTaqⅡ(2×)10.0 μL,forward primer (10 μmol/L)0.4 μL,reverse primer (10 μmol/L)0.4 μL,ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL,cDNA 2.0 μL,ddH2O 6.8 μL,總體積20 μL。

熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán);95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s。

1.2.4 麥長管蚜siRNA的顯微注射及相對表達(dá)量檢測

選擇麥長管蚜2齡成蚜,放置于裝有瓊脂糖凝膠的培養(yǎng)皿上并用適量的CO2氣體使其昏迷。使用顯微注射儀Nanoliter 2010通過毛細(xì)管將0.32 μg/μL siRNA-467注射至麥長管蚜腹部,設(shè)置15 nL和23 nL兩個注射量，以注射DEPC水為空白對照組,注射siRNA-NC為陰性對照組。保證每組麥長管蚜存活數(shù)量為30頭,將注射后的麥長管蚜轉(zhuǎn)移到裝有水培麥苗的離心管中飼養(yǎng)。注射過程中,丟棄由于機(jī)械損傷造成體液外流的麥蚜。

分別在注射后12、24和36 h,每組隨機(jī)抽取10頭麥長管蚜,通過熒光定量PCR進(jìn)行OBP7 mRNA的相對表達(dá)量檢測, 另外20頭進(jìn)行對EβF的趨性試驗。

1.2.5 麥長管蚜“Y”形管行為測定

“Y”形嗅覺儀試驗裝置如圖2所示,嗅覺儀三臂長10 cm,內(nèi)徑2 cm,兩臂夾角75°,主臂接大氣采樣儀作為抽氣泵。把一根形狀與“Y”形管相似的鐵絲放入“Y”形管中便于麥長管蚜行動。圖2裝置中接口處均用Teflon管連接。

試驗前將一側(cè)進(jìn)氣管放入裝有水的水杯中,另一側(cè)堵塞,開啟大氣采樣儀檢測裝置氣密性,兩側(cè)檢測完畢后進(jìn)行試驗。試驗前配制氣源物,分別將0.2、2、4、8 μg EβF用20 μL石蠟油稀釋后滴加在濾紙條上放入氣源瓶中作為氣味源。對照組氣源瓶內(nèi)放入直接滴加20 μL石蠟油的濾紙。試驗中大氣采樣儀流速控制為100 mL/min,將“Y”形管主臂用黑布蓋住,根據(jù)熒光定量PCR試驗結(jié)果，選擇干擾效果最好的處理組麥長管蚜20頭放于“Y”形管鐵絲上,10 min為1次觀測時段,在觀測時間內(nèi)蚜蟲進(jìn)入側(cè)臂超過3 cm,停留1 min及以上定義為趨性反應(yīng)。

圖2 麥長管蚜對EβF的趨向反應(yīng)裝置Fig.2 Y-typed olfactometer for testing orientation of S.miscanthi to EβF

1.2.6 數(shù)據(jù)的計算與處理

采用2-ΔΔCt法進(jìn)行mRNA相對表達(dá)量的計算,基本方程為N=N0(1+E)Ct,N0為起始模板cDNA拷貝數(shù),N為循環(huán)數(shù)Ct之后拷貝數(shù),E為該基因擴(kuò)增效率。

2-ΔΔCt計算步驟：

① 用內(nèi)參基因校正樣品間差異,Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因=ΔCt；

② 處理樣品與參照樣品進(jìn)行比較,ΔCt處理樣品-ΔCt參照樣品=ΔΔCt；

③ 處理樣品mRNA相對于參照樣品的表達(dá)量=2-ΔΔCt。

試驗數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計軟件SAS 9.1進(jìn)行分析。不同處理間差異顯著性檢驗的統(tǒng)計分析,使用ANOVA/LSD方法分析和檢驗,確定差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性檢測

圖3泳道2為241 bp的OBP7單一條帶,泳道4為230 bp的β-actin單一條帶,無模板對照泳道1、3無條帶。熒光定量PCR熔解曲線中可以看到OBP7和β-actin都是單峰且無雜帶,證明設(shè)計引物特異性良好(圖4)。

圖3 OBP7和β-actin的PCR產(chǎn)物Fig.3 PCR products of OBP7 and β-actin

圖4 OBP7和β-actin的熔解曲線Fig.4 Dissociation curves of OBP7 and β-actin

2.2 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖5所示,通過ABI 7500型熒光定量PCR儀得到OBP7和β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為：Y=-3.13X+27.045,R2=0.994,擴(kuò)增效率=108.7%;Y=-3.197X+22.8,R2=0.995,擴(kuò)增效率=105.5%。ABI 7500給出的目的基因OBP7與內(nèi)參基因β-actin的擴(kuò)增效率分別為108%和105%,一致率為100%,兩方程R2均大于0.990,符合2-ΔΔCt法計算要求。

圖5 熒光定量PCR中OBP7和β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curves of OBP7 and β-actin in qPCR

2.3 siRNA干擾效果分析

圖6為在15 nL siRNA-467注射量時OBP7 mRNA在處理后不同時間的相對表達(dá)量。當(dāng)注射后時間相同時,處理組siRNA-467與空白對照組DEPC水之間差異顯著(P<0.05)。OBP7 mRNA相對表達(dá)量最低值在24 h后出現(xiàn),最低值為46.3%,在36 h時OBP7的相對表達(dá)量有一定回升,注射后24 h與12 h和36 h差異顯著(P<0.05),注射后12 h與36 h差異不顯著(P>0.05)。

圖6 注射量為15 nL下不同時間處理的mRNA相對表達(dá)量Fig.6 Relative expression levels of OBP7 mRNA under different processing times with an injecting volume of 15 nL siRNA

圖7為在23 nL siRNA-467注射量時OBP7 mRNA在處理后不同時間的相對表達(dá)量。從圖中可以看出,處理組siRNA-467與對照組DEPC水之間差異顯著。OBP7 mRNA相對表達(dá)量最低值在注射后24 h出現(xiàn),最低值為46.3%,在36 h時的相對表達(dá)量有一定回升,24 h與12 h差異顯著,12 h處理與36 h處理差異不顯著。整體結(jié)果與注射量為15 nL時相似，而干擾效率高于注射15 nL,因此后續(xù)試驗中選用注射23 nL siRNA-467的麥長管蚜進(jìn)行“Y”形管行為試驗。

圖7 注射量為23 nL下不同時間處理的mRNA相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of OBP7 mRNA under different processing times with an injecting volume of 23 nL siRNA

如圖8所示為麥長管蚜在分別注射23 nL DEPC水、siRNA-467和siRNA-NC后0 h和12 h時的OBP7 mRNA相對表達(dá)量。注射后0 h時,3種不同注射處理下麥長管蚜的OBP7 mRNA相對表達(dá)量兩兩間差異不顯著(P>0.05)。12 h時,siRNA-NC處理與DEPC水處理間差異不顯著(P>0.05),siRNA-467處理分別與DEPC水和siRNA-NC間差異顯著(P<0.05)。表明,OBP7 mRNA相對表達(dá)量僅在siRNA-467注射后出現(xiàn)改變,試驗中并未出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。

2.4 麥長管蚜“Y”形管行為分析

當(dāng)試驗開始時,大多數(shù)麥長管蚜沿鐵絲逆氣流方向運動,部分爬行較快,部分爬行較慢,其觸角不斷前后左右擺動。當(dāng)進(jìn)入鐵絲分叉口時略微停留,隨后進(jìn)入其中一臂。

表2為未處理麥長管蚜進(jìn)行“Y”形管試驗的結(jié)果?？瞻讓φ罩蠩βF臂的蟲口數(shù)與石蠟油臂中的蟲口數(shù)差異不顯著(P>0.05)。使用0.2 μg EβF時,EβF臂的蟲口數(shù)與石蠟油臂中的蟲口數(shù)差異不顯著(P>0.05),此濃度的EβF對麥長管蚜行動影響不大。而當(dāng)使用2、4、8 μg EβF時,EβF臂的蟲口數(shù)與石蠟油臂中的蟲口數(shù)差異顯著(P<0.05),麥長管蚜表現(xiàn)出對EβF臂的強(qiáng)烈的驅(qū)避性。因此后續(xù)試驗選擇使用8 μg EβF進(jìn)行試驗。

圖8 不同注射處理下OBP7 mRNA相對表達(dá)量Fig.8 Relative expression of OBP7 mRNAin different injection treatments

處理Treatment蚜蟲數(shù)/頭Numberofaphis石蠟油臂ParaffinoilendEβF臂EβFend空白對照CK(6.67±1.47)a(8.33±2.36)a0.2μgEβF(8.00±2.33)a(7.67±2.65)a2μgEβF(10.33±0.75)a (6±1.42)b4μgEβF(11.67±1.19)a(3.33±0.55)b8μgEβF(12.00±1.38)a (2±0.67)b

1) 表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。

Data with different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). The same below.

如表3所示,空白對照組中,EβF臂的蟲口數(shù)與石蠟油臂中的蟲口數(shù)差異顯著(P<0.05)。注射siRNA-467后12 h和24 h時,EβF臂中的蟲口數(shù)與石蠟油臂中的蟲口數(shù)差異顯著(P<0.05),說明此時的麥長管蚜對EβF的趨性并未受到影響;而注射siRNA-467后36 h,EBF臂的蟲口數(shù)與石蠟油臂中的蟲口數(shù)差異不顯著(P>0.05),說明麥長管蚜的趨性發(fā)生了變化,即OBP7的mRNA表達(dá)被干擾影響了麥長管蚜對EβF的識別能力。

3 結(jié)論與討論

通過人工合成與OBP7 mRNA同源的21 bp的siRNA-467,利用顯微注射的方法實現(xiàn)了對麥長管蚜OBP7的RNA干擾,并且通過注射無意義的siRNA-NC為對照確定干擾效果并未出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。然后在不同注射量與注射后不同時間段使用qPCR技術(shù)對OBP7 mRNA的相對表達(dá)量進(jìn)行了檢測。在siRNA濃度為320 ng/μL時,注射量23 nL的干擾效果在3個不同檢測時間始終高于注射量15 nL,這與Turner等利用RNA干擾蘋淡褐卷蛾CXE1及PBP1基因時發(fā)現(xiàn)喂食不同數(shù)量的dsRNA能導(dǎo)致不同效率的RNAi結(jié)論一致[15]。Mutti等用顯微注射siRNA的方法干擾豌豆蚜唾液基因時發(fā)現(xiàn)在siRNA濃度為10 μg/μL,注射量為5 nL的條件下,豌豆蚜的致死率最高[16]。

表3 注射23 nL siRNA-467后麥長管蚜對

當(dāng)RNA干擾時間不同時,發(fā)現(xiàn)siRNA注射量為15 nL時,前24 hOBP7 mRNA干擾效果隨時間增加呈下降趨勢,但在36 h時mRNA表達(dá)量回升。當(dāng)siRNA注射量為23 nL時,前24 h RNA干擾效果隨時間增加呈下降趨勢,處理后24 h與36 h的RNA干擾效果基本相同。王暉等用喂食法干擾麥長管蚜P450基因時發(fā)現(xiàn)使用濃度為7.5 ng/μL的dsRNA喂食時,干擾效果隨時間增加而增加,P450 mRNA相對表達(dá)量在8 d后達(dá)到最低值36.29%,與本試驗的最低值37.1%相似[14]。Turner等在研究蘋淡褐卷蛾時發(fā)現(xiàn),EposCXE1基因mRNA的表達(dá)量隨著dsRNA喂食時間的延長呈下降趨勢,下降到一定量后出現(xiàn)一個較低的穩(wěn)定表達(dá)量[15]。推測可能的原因是mRNA的表達(dá)量變化是一個動態(tài)的過程,由于DNA能夠轉(zhuǎn)錄生成mRNA,當(dāng)生物體的某種蛋白或多肽缺失時,會產(chǎn)生信號并誘導(dǎo)mRNA的合成來進(jìn)一步指導(dǎo)翻譯過程。所以RNA干擾初期會出現(xiàn)mRNA表達(dá)量的顯著下降,但是最后進(jìn)入一個平穩(wěn)期。與mRNA表達(dá)量變化不同的是,由于mRNA缺失造成的功能蛋白的減少會導(dǎo)致生物體的死亡率隨著RNA干擾時間的延長而增加。

通過“Y”形管對麥長管蚜進(jìn)行行為測定,發(fā)現(xiàn)麥長管蚜對EβF有很強(qiáng)的驅(qū)避作用。而當(dāng)對麥長管蚜被注射siRNA-467后36 h時由于OBP7的表達(dá)缺陷造成麥長管蚜的趨性發(fā)生了變化,說明麥長管蚜喪失了對EβF的驅(qū)避能力,證實OBP7蛋白與EβF間有一定作用關(guān)系,而是否OBP7基因就是報警信息素結(jié)合蛋白受體基因,有待更多的試驗驗證。如能開發(fā)一種能夠隨時檢測OBP7蛋白表達(dá)量變化的技術(shù),當(dāng)麥長管蚜被RNA干擾后喪失對EβF的感知能力時,通過檢測此時麥長管蚜體內(nèi)OBP7蛋白含量的多少就能進(jìn)一步確定它與EβF即報警信息素之間的關(guān)系。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

RNA interference ofOBP7 gene inSitobionmiscanthi

Yang Shuang1,2, Yin Jiao2, Cao Yazhong2, Fan Dong1, Li Kebin2

(1. College of Agriculture, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Odorant binding protein (OBP) is one of the most important functional proteins in olfaction of the aphids, with which aphids can combine odor molecules and transduce them. A microinjection method was used to deliver small interference RNAs which were synthesized specifically forOBP7 gene into the adult aphids. The variation of the relative expression of the mRNA in adult aphids was detected by using qRT-PCR technique. The mRNA relative expression decreased to the lowest level of 37.1% in 24 hours when injected with 23 nL of siRNA at a concentration of 0.32 μg/μL, which demonstrates the feasibility of microinjection for RNA interference. Aphids changed their taxic behavior to EβF significantly (P<0.05) after 36 hours when treated with 23 nL siRNA.It indicates that OBP7 play a very important role in aphid alarm pheromone(EβF) discrimination.

Sitobionmiscanthi; odorant binding protein 7; RNA interference; real-time PCR

2014-04-18

2014-09-11

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項 (201103022)

Q 963

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.020

* 通信作者 E-mail:dnfd@163.com；likebin54@163.com