金 文, 張金良, 劉 艷*, 王錫鋒

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室,北京 100193; 2.北京市植物保護(hù)站,北京 100029)

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小麥矮縮病毒NASH快速檢測方法的建立及應(yīng)用

金 文1, 張金良2, 劉 艷1*, 王錫鋒1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室,北京 100193; 2.北京市植物保護(hù)站,北京 100029)

以非放射性物質(zhì)地高辛為標(biāo)記物,采用PCR法制備了特異性強(qiáng)、靈敏度高的DNA探針。通過優(yōu)化反應(yīng)體系, 建立了小麥矮縮病毒(Wheatdwarfvirus, WDV)的核酸斑點雜交 (nucleic acid spot hybridization,NASH)快速檢測技術(shù)體系。該方法診斷準(zhǔn)確率高,操作簡單,周期短,整個檢測過程僅需5 h左右。利用建立的NASH技術(shù)開展WDV流行學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)近年來WDV在我國陜西韓城、山西太原和河北石家莊等地區(qū)點片發(fā)生,沒有大面積暴發(fā)成災(zāi)。

小麥矮縮病毒; 地高辛; 核酸斑點雜交(NASH); 快速檢測

小麥矮縮病毒(Wheatdwarfvirus,WDV)是一類侵染麥類作物的雙生病毒,為雙生病毒科(Geminiviridae)玉米線條病毒屬(Mastrevirus)的成員[1-2]。該病毒由條沙葉蟬(PsammotettixstriatusL.)以持久性非增殖方式傳播[3],寄主為小麥、大麥、燕麥和多種禾本科雜草,罹病植株表現(xiàn)為矮化、黃化、分蘗增多等[4],它的局部流行曾對歐洲多個國家的大麥、小麥生產(chǎn)造成很大危害[5-7]。2007年我國首次報道了小麥矮縮病毒在山西太原發(fā)生[8],隨后在陜西、甘肅、河北和云南等12個省均有發(fā)現(xiàn)。近年來在陜西北部麥區(qū)已引起嚴(yán)重減產(chǎn),正成為威脅我國西北、華北和西南麥區(qū)重要的病毒病[9-11]。建立適合田間大量樣品鑒定的快速檢測方法,做到早期發(fā)現(xiàn)與預(yù)警,對及時有效地控制該病害將起到重要的作用。

植物病毒的檢測方法通常有生物學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)等手段。但就小麥矮縮病毒而言,由于該病毒為蟲傳病毒,其傳播介體條沙葉蟬飼養(yǎng)困難,生物學(xué)鑒定難度很大;血清學(xué)具有快速簡便、高通量等優(yōu)點,但對制備抗體的特異性有較高要求;PCR法較為常用,但存在因交叉污染而帶來的假陽性等問題。核酸斑點雜交技術(shù)(nucleic acid spot hybridization,NASH)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點[12],尤其是非放射性標(biāo)記如地高辛的發(fā)展使得這種方法得到更廣泛的應(yīng)用[13],近年來NASH技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物病毒的檢測中[14-15]。本研究制備了基于地高辛標(biāo)記的DNA探針,將NASH檢測技術(shù)用于小麥矮縮病毒(WDV)的快速診斷和鑒定。

1 材料與方法

1.1 毒源及傳毒介體

小麥矮縮病毒(WDV)分離物和傳毒介體(條沙葉蟬)均采自陜西韓城小麥矮縮病毒病發(fā)病田塊。經(jīng) PCR檢測和基因測序確定為小麥矮縮病毒(WDV)后,在感病小麥品種(‘揚(yáng)麥12’)上繁殖毒源。條沙葉蟬經(jīng)脫毒純化后在健康小麥上扣罩飼養(yǎng)。上述毒源和介體均在22 ℃,20 000 lx條件的光照培養(yǎng)箱中常年繁殖。小麥黃矮病毒GPV株系(Wheatyellowdwarfvirus-GPV, WYDV-GPV)及大麥黃矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus, BYDV)的GAV株系和PAV株系等參照毒源均為本實驗室-70 ℃保存樣品。

1.2 探針引物的設(shè)計、合成與標(biāo)記

將GenBank上登錄的WDV陜西韓城分離物與其他地區(qū)分離物進(jìn)行序列比對,結(jié)果表明外殼蛋白(coat protein, CP)基因較為保守,故選取該基因作為靶基因。應(yīng)用Vector NT 10.0軟件設(shè)計CP基因特異性引物,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具體序列為CP/F: 5′-ATGGTGACCAACAAGGACTCC-3′;CP/R:5′-TTACTGAATGCCGATGGCTTTG-3′。DIG探針標(biāo)記采用PCR法,用試劑盒(DIG PCR probe synthesis kit,Roche)中的DIG-dNTPs(含0.7 mmol/L DIG-11-dUTP,1.3 mmol/L dTTP)代替PCR正常體系中的dNTPs進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 WDV-CP基因的克隆

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：模板DNA 1 μL,10 μmol/L正反向引物各0.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,5U ExTaq酶0.25 μL,10×buffer 2.5 μL,加ddH2O至25 μL。在Eppendorf PCR儀中按下列擴(kuò)增程序進(jìn)行：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,56 ℃復(fù)性45 s;72 ℃延伸1 min,35次循環(huán);最后72 ℃ 延伸10 min,4 ℃下保存?zhèn)溆?。將純化好的PCR產(chǎn)物連接至pMD-18T載體(TaKaRa)上,轉(zhuǎn)化到DH 5α大腸桿菌感受態(tài)中。經(jīng)PCR鑒定選取3個陽性克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司完成序列測定。

1.4 WDV-NASH檢測方法的建立

采用CTAB法提取樣品的總DNA：取1 μL點于尼龍膜(Amersham HybondTM-N+,GE Healthcare)上,將膜放在UV紫外交聯(lián)儀中固定;將固定好的雜交膜放入雜交袋中,加入適量雜交緩沖液后50 ℃下預(yù)雜交15 min;將DIG探針100 ℃變性5 min后加入雜交液中,50 ℃雜交1.5～2 h;膜置于足量的2×SSC(含0.1% SDS)溶液中,振蕩漂洗2次,每次10 min;轉(zhuǎn)入足量的0.5×SSC (含0.1% SDS)的溶液中,65 ℃條件下輕微振蕩漂洗2次,每次10 min;用封閉緩沖液輕搖封閉20 min。

采用免疫顯色：加入堿性磷酸酶標(biāo)記的DIG抗體(Roche公司)達(dá)到工作濃度為1∶7 500,室溫孵育30 min;洗滌液(0.1 mol/L maleic acid,0.15 mol/L NaCl, pH 7.5,含0.3% W/V Tween-20)洗膜2次,每次10 min;加入適量含330 μg/mL NBT和165 μg/mL BCIP的堿性磷酸酯酶緩沖液(現(xiàn)用現(xiàn)配);暗處顯色約20～30 min,用50 mL無菌雙蒸水或TE buffer 將膜漂洗5 min,終止顯色反應(yīng)。

1.5 NASH特異性和靈敏度檢測

取1 μL小麥矮縮病毒DNA提取液,同時以健康小麥DNA提取液和感染小麥的其他病毒W(wǎng)YDV-GPV、BYDV-GAV和BYDV-PAV的cDNA作為對照,按照建立的NASH檢測方法進(jìn)行特異性檢測;將小麥矮縮病毒DNA模板進(jìn)行10倍系列梯度稀釋,得到10-1～10-6倍的稀釋液,進(jìn)行靈敏度檢測試驗。

1.6 大田疑似WDV樣品的檢測

2010年至2013年間,于每年小麥生長季在我國主要麥區(qū)采集嚴(yán)重矮化、分蘗增多、黃化且不能抽穗的小麥矮縮病毒疑似標(biāo)樣。每份標(biāo)樣稱取0.1 g,采用CTAB法提取樣品的總DNA,溶解于0.1×TE 溶液中,-20 ℃暫存?zhèn)溆?。采?.4中建立的WDV-NASH技術(shù)進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 WDV-CP基因的克隆

從繁殖WDV毒源的小麥葉片中提取總DNA,采用1.2中設(shè)計的特異性引物對(CP/F和CP/R)擴(kuò)增獲得了大小約為780 bp的條帶(圖1泳道1), 與預(yù)期CP基因目的片段大小(783 bp)基本一致。將回收純化的CP基因擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pMD-18T連接,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中,經(jīng)PCR鑒定和序列測定獲得含WDV-CP基因的重組質(zhì)粒。

2.2 地高辛標(biāo)記探針的制備

以獲得的含WDV-CP基因的重組質(zhì)粒為模板,采用DIG標(biāo)記PCR法制備探針。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,因DIG的分子量大,從圖中可以看出已標(biāo)記的條帶(圖1泳道2)明顯滯后于普通未標(biāo)記的條帶,說明此探針標(biāo)記成功。

圖1 PCR法制備WDV特異性DIG探針的電泳圖Fig.1 Gel analysis of PCR-amplified specific DIG-labeled probe for WDV

2.3 探針特異性檢測

將已提取的WDV、WYDV-GPV、BYDV-GAV和BYDV-PAV等病毒核酸各取1 μL點于同一張尼龍膜上,以健康小麥DNA作為陰性對照,用制備的WDV特異的DIG核酸探針進(jìn)行核酸斑點雜交。結(jié)果顯示：該探針僅與WDV樣品DNA產(chǎn)生反應(yīng)(圖2)。表明此探針具有較強(qiáng)的特異性,可以用于鑒別區(qū)分WDV和與其癥狀相似的小麥上其他病毒。

圖2 WDV-CP探針的特異性檢測Fig.2 Detection for the specificity of WDV-CP probe

2.4 探針靈敏度檢測

提取3份WDV樣品DNA,編號為1～3。用Nanodrop微量測定儀測定核酸濃度,1～3號樣品的濃度分別為1 501.4、904.7和1 647.7 ng/μL。分別取1 μL DNA,按10-1～10-6系列比例用ddH2O稀釋DNA,然后按稀釋順序點于同一張尼龍膜上進(jìn)行斑點雜交。雜交顯色結(jié)果(圖3)表明10-2稀釋倍數(shù)能得到較為清晰的DNA印跡,10-3稀釋倍數(shù)仍能檢測到DNA,該試驗3次重復(fù)的平均靈敏度為1.33 ng/μL。

圖3 WDV-CP探針的靈敏度檢測Fig.3 Detection for the sensitivity of WDV-CP probe

2.5 大田疑似樣品的檢測

采用建立的WDV-NASH技術(shù),對2010年至2013年采自山西、陜西、山東、河北、云南和四川等12個省份部分地區(qū)的373份WDV疑似標(biāo)樣進(jìn)行了檢測。取標(biāo)樣DNA 1 μL點于尼龍膜上,并分別以已知WDV毒源樣品和樣品緩沖液為陽性對照和空白對照，部分雜交結(jié)果見圖4。結(jié)果表明近幾年來小麥矮縮病毒在陜西韓城、山西太原和河北石家莊等地區(qū)點片發(fā)生,沒有大面積暴發(fā)。將檢測樣品同時用PCR方法驗證,準(zhǔn)確率達(dá)99%以上。

圖4 部分大田標(biāo)樣的核酸斑點雜交檢測結(jié)果Fig.4 Detection of samples collected from fields by NASH assay

3 討論

WDV一旦發(fā)生,其造成的經(jīng)濟(jì)損失就會相當(dāng)嚴(yán)重,所以各發(fā)生國家都十分重視對該病害的流行監(jiān)測。依賴于抗血清的WDV檢測技術(shù)以ELISA技術(shù)最成熟,應(yīng)用最廣泛。但由于受到抗血清制備水平的限制,國內(nèi)尚無商品化的抗血清;以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ),已經(jīng)開發(fā)出如qPCR[16]和RCA-RAPD[17]等針對WDV的檢測技術(shù),但是這些技術(shù)不易掌握,且受到試劑和儀器昂貴等成本問題影響,難以在基層植保部門推廣。

本研究首先對WDV病毒及其近似種的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)分析,設(shè)計了用于特異性檢測WDV的CP基因特異性引物,并對反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,建立了以地高辛標(biāo)記的DNA探針為基礎(chǔ)的NASH檢測技術(shù)。免疫檢測結(jié)果表明：制備的含WDV-CP的DNA探針具有較強(qiáng)的特異性和高靈敏度,并成功地應(yīng)用于田間疑似WDV標(biāo)樣的檢測。該探針的制備方法簡單,具有無放射性污染的優(yōu)點,且可反復(fù)使用4～5次,節(jié)約了檢測成本。將制備的地高辛探針、雜交緩沖液和洗滌液等反應(yīng)體系成分組裝成試劑盒后,無需PCR、酶聯(lián)測定儀等任何昂貴的儀器,操作簡單方便,對基層單位十分適用,具有良好的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Development and application of nucleic acid spot hybridization (NASH) assay for rapid detection ofWheatdwarfvirus

Jin Wen1, Zhang Jinliang2, Liu Yan1, Wang Xifeng1

(1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2.Beijing Plant Protection Station, Beijing 100029, China)

In this study, a nucleic acid spot hybridization (NASH) method was developed to detectWheatdwarfvirus(WDV). Based on digoxigenin (non-radioactive)-labeled strategy, a DNA probe with well-characterized specificity and sensitivity was prepared by PCR.The reaction system was optimized for highly accurate diagnosis and simple operation. The whole process of assay was rapid and efficient, which could be completed in 5 h. The established system was applied to epidemiological survey of WDV.The results indicated that no large-scale outburst of WDV has occurred in China in recent years, and it only happened sporadically in local areas, including Hancheng (Shaanxi Province), Taiyuan (Shanxi Province) and Shijiazhuang (Hebei Province).

Wheatdwarfvirus(WDV); digoxigenin; nucleic acid spot hybridization (NASH); rapid detection

2014-04-16

2014-07-21

國家自然科學(xué)基金(31171820)；北京市糧食高產(chǎn)創(chuàng)建項目(PXM2013-036203-000022);糧食作物產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊項目

S 435.121.5

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.019

* 通信作者 E-mail:yliu@ippcaas.cn