朱琳峰, 彭 煥, 黃文坤, 張東升, 孔令安, 彭德良

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

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抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆Cp4-epsps基因快速簡(jiǎn)便的LAMP 檢測(cè)方法

朱琳峰, 彭 煥, 黃文坤, 張東升, 孔令安, 彭德良*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

針對(duì)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的外源基因Cp4-epsps，建立了一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)體系，其擴(kuò)增產(chǎn)物既可利用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，還可通過SYBR Green I染色進(jìn)行快速檢測(cè)。LAMP 檢測(cè)體系中dNTPs濃度為0.8 mmol/L、Mg2+濃度為3 mmol/L、反應(yīng)時(shí)間為45 min時(shí)擴(kuò)增效果最佳，其檢測(cè)靈敏度為5 μg/L，比常規(guī)PCR靈敏100倍。田間實(shí)際檢測(cè)結(jié)果表明，LAMP 檢測(cè)結(jié)果和PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致，準(zhǔn)確率為100%。本研究所建立的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆LAMP 檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)便快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特征，是一種能夠用于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)、田間基因漂移監(jiān)測(cè)和環(huán)境安全研究的有力工具。

抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆;Cp4-epsps; LAMP; 快速檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因作物自研發(fā)以來,一直呈現(xiàn)迅猛增長(zhǎng)的趨勢(shì),據(jù)ISAAA 統(tǒng)計(jì),截至2013年,轉(zhuǎn)基因作物種植面積已經(jīng)達(dá)到1.752億hm2,較1996年增加了100倍以上。其中轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的 47%,主要以抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆為主。截至2013年6月,我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)了11種轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)口并用作加工原料, 但至今仍未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因大豆的商業(yè)化種植。缺乏合適、可靠、高效而又簡(jiǎn)便的轉(zhuǎn)基因大豆基因漂移監(jiān)測(cè)方法及其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法是一個(gè)重要的因素。近年來轉(zhuǎn)基因生物尤其是轉(zhuǎn)基因食品的安全問題成為公眾關(guān)注的熱門話題[1]。建立一套高效、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)技術(shù),對(duì)于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)和基因漂移的監(jiān)測(cè)、促進(jìn)中國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆的商業(yè)化進(jìn)展,加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因大豆種植的田間監(jiān)管,維護(hù)消費(fèi)者在轉(zhuǎn)基因大豆食品安全上的知情權(quán)具有現(xiàn)實(shí)意義。

外源基因檢測(cè)與外源蛋白檢測(cè)是轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)的兩種常用方法。常用的外源蛋白檢測(cè)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[2-3]以及膠體金試紙條法[4]，操作簡(jiǎn)便,結(jié)果易于判定,特異性好，方法實(shí)用有效,但是對(duì)于轉(zhuǎn)基因加工制品的檢測(cè)，其靈敏度較低[5],且價(jià)格昂貴,不適合在日常檢測(cè)中普及。外源基因的檢測(cè)主要通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行,常用的檢測(cè)序列有啟動(dòng)子序列、終止子序列以及外源基因等[6]。此外,研究者們還在PCR的基礎(chǔ)上開發(fā)出一些新的技術(shù)來增加檢測(cè)的特異性,如巢式PCR[7]、RT-PCR[8]、熒光定量PCR[9],Southern Blot[10]等。這些分子檢測(cè)手段具有高度的特異性及靈敏度,但是檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng),操作繁瑣,對(duì)儀器、試劑有較高要求,因而不適宜在田間檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是日本學(xué)者Notomi 等[11]發(fā)明的一種新式恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù),該技術(shù)應(yīng)用4條引物特異性識(shí)別靶序列上的6個(gè)特異位點(diǎn),在Bst酶的作用下,恒溫?cái)U(kuò)增30～90 min即可完成反應(yīng)，其結(jié)果通過瓊脂糖凝膠電泳可以觀察到典型的梯形條帶;Nagamine等[12]又在LAMP 4條引物的基礎(chǔ)上,增設(shè)了一對(duì)環(huán)引物,該引物直接與LAMP 反應(yīng)過程中產(chǎn)生的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)結(jié)合,從而將LAMP 反應(yīng)時(shí)間縮短了一半以上。目前, LAMP 技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因作物的快速檢測(cè)中。Lee等[13]根據(jù)花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(P-35S), 農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶啟動(dòng)子(P-NOS)以及農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(T-NOS)的序列設(shè)計(jì)特異性LAMP 引物,用于轉(zhuǎn)基因油菜中的外源基因鑒定,但結(jié)果仍然是通過電泳檢測(cè)完成;,王永等[14]以轉(zhuǎn)基因作物中常用的花椰菜花葉病毒35S 啟動(dòng)子(CaMV35S)為檢測(cè)靶標(biāo),利用LAMP 技術(shù)同時(shí)對(duì)7 種轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行了LAMP 檢測(cè),并添加SYBR Green Ⅰ熒光染料作為指示劑來判斷反應(yīng)結(jié)果;陳金松等[15]將LAMP 法檢測(cè)應(yīng)用于含有CaMV35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)中; Chen 等[16]將羥基萘酚藍(lán)(HNB)作為指示劑應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因水稻的LAMP 檢測(cè)中; Li 等[17]建立了轉(zhuǎn)基因水稻中的cry1Ab基因LAMP 檢測(cè)方法; Randhawa 等[18]針對(duì)啟動(dòng)子(P-35S和P-FMV)及報(bào)告基因(aadA、nptII和uidA)等序列分別設(shè)計(jì)LAMP 引物,比較了5個(gè)LAMP 引物檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花的靈敏度及效率,發(fā)現(xiàn)針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)的LAMP 引物檢測(cè)靈敏度較高。

抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆是通過Cp4農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將epsps(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶)基因轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi),使之過量表達(dá),從而使大豆獲得草甘膦抗性[19]。呂山花[20],王存芳[21]等采用常規(guī)PCR法對(duì)4種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆制品中的Cp4-epsps基因進(jìn)行檢測(cè),但由于豆制品加工過程損傷了DNA而導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度較低;張明輝[22]等人采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)大豆‘Roundup Ready’加工品中的Cp4-epsps基因進(jìn)行檢測(cè),該檢測(cè)方法靈敏度高,且無需電泳分析,但對(duì)儀器、試劑要求較高;蘭青闊等[23]根據(jù)Cp4-epsps基因開發(fā)出抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆LAMP 檢測(cè)技術(shù),但結(jié)果仍采用凝膠電泳進(jìn)行判定。

本研究以抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆外源基因Cp4-epsps為靶標(biāo),通過體系優(yōu)化,靈敏度和特異性分析,建立了抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的LAMP 快速檢測(cè)體系,通過加入一對(duì)環(huán)引物大大縮短檢測(cè)時(shí)間。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便,對(duì)儀器設(shè)備要求低,水浴鍋就可,且檢測(cè)結(jié)果肉眼即可判定,適用于基層檢測(cè)部門及田間檢測(cè),本研究結(jié)果將為轉(zhuǎn)基因大豆的田間監(jiān)控及轉(zhuǎn)基因食品的安全檢測(cè)提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2012年11月至2013年12月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 供試大豆品種

抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆品種‘AG5601’、‘中作1’、‘中作2’以及常規(guī)大豆品種‘中黃13’、‘中黃30’和‘SNK500’為本實(shí)驗(yàn)室保存;常規(guī)大豆品種‘抗線9’、‘黑農(nóng)44’、‘黑農(nóng)48’、‘黑農(nóng)64’、‘黑農(nóng)66’,‘黑農(nóng)68’和‘黑農(nóng)69’由黑龍江省農(nóng)科院饋贈(zèng)。

1.2 試劑

TaqDNA聚合酶、DNA marker DL 2000購自寶生物工程(大連)有限公司;Bst DNA 聚合酶大片段購自美國(guó)New England Biolabs公司; SYBR Green I 購自美國(guó)Invitrogen公司;植物基因組DNA 提取試劑盒(DP305)購自天根生化(北京)科技有限公司。

1.3 大豆基因組DNA 提取

大豆葉片基因組 DNA 提取采用DNAsecure Plant Kit完成。采用紫外分光光度儀Nanodrop 2000(Themo,美國(guó))測(cè)定DNA濃度,置于-20 ℃保存。

1.4 LAMP 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Cp4-epsps基因序列(GenBank登錄號(hào):I43998),使用在線軟件PrimerExplorer Version 4.0 (http:∥primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP 引物,包含2條外引物(F3和 B3)、2條內(nèi)引物(FIP 和 BIP)以及2條環(huán)引物(LB和LF)(表1,圖1)。所有的引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 試驗(yàn)所用引物序列

圖1 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆LAMP 引物設(shè)計(jì)Fig.1 LAMP primer design for detection of glyphosate-resistant soybean

1.5 LAMP 體系的建立

參照Fukuta等[24]設(shè)定LAMP 反應(yīng)的初始體系,對(duì)反應(yīng)中的關(guān)鍵因子dNTPs、Mg2+濃度、反應(yīng)溫度及時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

反應(yīng)體系包括內(nèi)引物FIP和BIP各1.6 μmol/L,外引物F3和B3各0.2 μmol/L,環(huán)引物L(fēng)B和LF各0.4 μmol/L,dNTPs (0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mmol/L),Mg2+(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L),20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),10 mmol/L KCl,10 mmol/L (NH4)2SO4,8 U Bst DNA聚合酶大片段,1 μL模板DNA,ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。將上述反應(yīng)體系混勻后,置于60～65 ℃保溫15～90 min,85 ℃酶滅活5 min。LAMP 擴(kuò)增結(jié)束后,加2 μL 100×SYBR Green I 核酸染料,混勻后觀察顏色變化。同時(shí)取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳,EB染色后,在凝膠成像系統(tǒng)(Biorad DX)中觀察照相。

1.6 常規(guī)PCR檢測(cè)

常規(guī)PCR 反應(yīng)采用一步雙重PCR,其中內(nèi)標(biāo)基因lectin和Cp4-epsps檢測(cè)引物和擴(kuò)增體系參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T675-2003 《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測(cè)大豆定性PCR方法》進(jìn)行,擴(kuò)增體系包括2.5 μL 10×buffer(含有Mg2+), 2 μL dNTPs (10 mmol/L), 引物L(fēng)ectin F、Lectin R、Cp4-epsps F和Cp4-epsps R(表1)各1 μL,0.5 μLTaq酶和1 μL模板DNA,ddH2O 補(bǔ)齊至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃,10 min; 4 ℃保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳,EB染色后觀察并照相。

1.7 特異性分析

以轉(zhuǎn)基因品種‘AG5601’、‘中作1’、‘中作2’，以及非轉(zhuǎn)基因品種‘SNK500’、‘中黃13’、‘中黃30’、‘抗線9’、‘黑農(nóng)44’、‘黑農(nóng)48’、‘黑農(nóng)64’、‘黑農(nóng)66’、‘黑農(nóng)68’、‘黑農(nóng)69’基因組DNA為模板同時(shí)進(jìn)行LAMP 和常規(guī)PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系及條件參照1.5和1.6,以驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的LAMP 引物的特異性。

1.8 靈敏度分析

將5×104μg/L抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆‘AG5601’的基因組DNA按照10倍梯度稀釋成7個(gè)濃度梯度(5×104、5×103、5×102、5×101、5、5×10-1、5×10-2μg/L),各取1 μL作為模板,按照1.5優(yōu)化的體系進(jìn)行LAMP 檢測(cè),同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增,比較兩種檢測(cè)方法的靈敏度。

1.9 田間大豆樣品的 LAMP 檢測(cè)

在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊科研中試基地轉(zhuǎn)基因大豆生物安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)地,大豆3～4片復(fù)葉期間,隨機(jī)選取45個(gè)大豆品種(表2),每個(gè)品種采集2～3片葉子, 提取DNA作為模板,采用1.5 優(yōu)化的LAMP 體系進(jìn)行擴(kuò)增,以轉(zhuǎn)基因大豆‘AG5601’為陽性對(duì)照。同時(shí),以上述模板進(jìn)行一步雙重PCR檢測(cè),比較分析LAMP 檢測(cè)與PCR 準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)化

dNTPs 濃度優(yōu)化結(jié)果表明,當(dāng)dNTPs濃度為0.4 mmol/L時(shí)無擴(kuò)增,在dNTPs濃度為0.8～2.4 mmol/L時(shí)均有擴(kuò)增,但擴(kuò)增效率無明顯差異(圖2a);Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果表明,在1～3 mmol/L 時(shí),隨著Mg2+濃度的增加,擴(kuò)增效率增加,但當(dāng)Mg2+濃度超過3 mmol/L 時(shí),擴(kuò)增效率下降(圖2b),因此確定最適Mg2+濃度為3 mmol/L;溫度優(yōu)化結(jié)果表明,在60～65 ℃ 之間進(jìn)行擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增效果無明顯差異(圖2c);加環(huán)引物的LAMP 擴(kuò)增時(shí)間優(yōu)化結(jié)果表明(圖2d),在15～30 min,沒有擴(kuò)增,45 min開始出現(xiàn)擴(kuò)增,隨著時(shí)間增加,擴(kuò)增結(jié)果無顯著差異,由此確定加環(huán)引物的LAMP 擴(kuò)增最佳時(shí)間為45 min。不加環(huán)引物的LAMP 擴(kuò)增時(shí)間優(yōu)化結(jié)果(圖2e)表明,擴(kuò)增75 min時(shí)才有微弱的條帶，在90 min出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增條帶，因此不加環(huán)引物的LAMP 擴(kuò)增最佳時(shí)間為90 min，這說明加環(huán)引物可以將反應(yīng)時(shí)間縮短到一半。由此確定LAMP 優(yōu)化的擴(kuò)增體系為：dNTPs濃度0.8 mmol/L,Mg2+濃度3 mmol/L,添加環(huán)引物L(fēng)B和LF,其他擴(kuò)增條件不變,60 ℃擴(kuò)增45 min。

圖2 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆LAMP 反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization of condition for LAMP reaction

2.2 特異性分析

以3種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆和10種非轉(zhuǎn)基因大豆的基因組DNA為模板進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增,檢測(cè)LAMP 擴(kuò)增引物的特異性。SYBR Green I染色結(jié)果表明,3種轉(zhuǎn)基因大豆‘中作1’、‘中作2’和‘AG5601’ LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物中觀察到綠色熒光信號(hào),而10種非轉(zhuǎn)基因大豆品種的LAMP 擴(kuò)增結(jié)果為橙色(圖3a)。凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明,3個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆的擴(kuò)增產(chǎn)物均觀察到特征性的梯形條帶,而非轉(zhuǎn)基因大豆無任何擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3b)。常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果表明,3種轉(zhuǎn)基因大豆均擴(kuò)增得到500 bp左右的Cp4-epsps特異條帶,所有樣品均檢測(cè)到長(zhǎng)度為118 bp的lectin內(nèi)標(biāo)基因的條帶(圖3c),大小約為118 bp。LAMP 擴(kuò)增結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。

圖3 抗草甘膦大豆品種LAMP 特異性分析結(jié)果Fig.3 The specificity for detection of glyphosate-resistant soybean varieties by LAMP

2.3 靈敏度分析

靈敏度分析結(jié)果表明,抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA濃度稀釋到5 μg/L時(shí),仍能檢測(cè)到LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物,繼續(xù)將DNA濃度稀釋到5×10-1μg/L時(shí),檢測(cè)不到擴(kuò)增產(chǎn)物(圖4a、b);常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,當(dāng)模板DNA濃度稀釋到5×102μg/L時(shí),可以檢測(cè)到目的條帶,再次稀釋則檢測(cè)不到(圖4c)。由此得出LAMP 的檢測(cè)最低濃度為5 μg/L,約為4拷貝(1 ng基因組DNA的拷貝數(shù)為877),PCR的檢測(cè)最低閾值為5×102μg/L,約為400拷貝,由此確定LAMP 的檢測(cè)靈敏度為常規(guī)PCR的100倍。

2.4 田間大豆樣品的LAMP 檢測(cè)

45個(gè)田間樣本LAMP 檢測(cè)結(jié)果顯示,其中24個(gè)品種染色結(jié)果為綠色。常規(guī)PCR也從上述24個(gè)品種中擴(kuò)增出500 bp左右以及118 bp 2條目的條帶,其他品種均只在118 bp處出現(xiàn)1條目的條帶。LAMP 檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致,檢測(cè)精確率為100 %(表2)。

圖4 抗草甘膦大豆LAMP 檢測(cè)和PCR 檢測(cè)靈敏度分析結(jié)果Fig.4 The sensitivity for detection of glyphosate-resistant soybean by LAMP and PCR

3 討論與結(jié)論

根據(jù)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆的外源Cp4-epsps基因設(shè)計(jì)一組特異性LAMP 引物,并對(duì)反應(yīng)中的關(guān)鍵因素進(jìn)行一系列優(yōu)化,建立了一種高靈敏度和高特異性的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆LAMP 快速檢測(cè)方法。研究結(jié)果表明,抗草甘膦大豆Cp4-epsps基因的LAMP 檢測(cè)體系中最佳dNTPs濃度為0.8 mmol/L,這與陳金松等[15]建立的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因玉米CaMV35S的LAMP 檢測(cè)優(yōu)化體系一致,而本研究的最佳Mg2+濃度為3 mmol/L, 與陳金松等建立的最優(yōu)體系Mg2+濃度4 mmol/L具有一定的差異,這可能是由于靶基因不同或者是引物的差異所致。靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明,本研究建立的LAMP 檢測(cè)體系最低DNA檢測(cè)濃度為4拷貝,檢測(cè)靈敏度比轉(zhuǎn)基因棉花的LAMP 檢測(cè)靈敏度 40拷貝[18]要高8倍,而和抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆(RR大豆)LAMP 檢測(cè)靈敏度5拷貝[25]基本一致。

為了加快反應(yīng)速度,本研究在4條LAMP 特異引物的基礎(chǔ)上,增加了一對(duì)環(huán)引物,擴(kuò)增時(shí)間縮短至45 min,相較于常規(guī)PCR 擴(kuò)增和一般LAMP 擴(kuò)增相比,時(shí)間縮短一半以上。和Real-time PCR相比,LAMP 檢測(cè)不需要PCR 儀等專業(yè)儀器設(shè)備,操作便捷,且通過添加SYBR Green I等熒光染料,結(jié)果肉眼即可判斷,能夠用于試驗(yàn)條件較差的基層檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

在本研究的田間實(shí)際檢測(cè)中,45個(gè)田間樣本多數(shù)為轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆和普通大豆或者野生豆雜交后代,而LAMP 檢測(cè)均能夠準(zhǔn)確地鑒定,說明建立的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆LAMP 檢測(cè)方法不僅可以應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因大豆樣品的檢測(cè)中,還可以應(yīng)用到田間雜交樣品的實(shí)際檢測(cè)中。本研究方法在田間轉(zhuǎn)基因大豆的快速篩選中具有廣泛的應(yīng)用前景。

由于LAMP 擴(kuò)增的靈敏度較高,更容易受到氣溶膠的污染而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本研究為了降低氣溶膠污染,在LAMP 反應(yīng)體系中滴加1滴石蠟油,這樣可以在反應(yīng)完成后將反應(yīng)產(chǎn)物密封在管內(nèi),有效減少氣溶膠的產(chǎn)生。

綜上所述,本研究建立的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆Cp4-epsps基因LAMP 檢測(cè)方法, 具有快速高效、特異性好、靈敏度高、操作便捷等優(yōu)勢(shì),特別適用于基層檢測(cè)及田間檢測(cè),是抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及轉(zhuǎn)基因食品安全檢測(cè)的一個(gè)有力工具。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Rapid and simple detection ofCp4-epspsgene in glyphosate-resistant soybean by loop-mediated isothermal amplification

Zhu Linfeng, Peng Huan, Huang Wenkun, Zhang Dongsheng, Kong Ling’an, Peng Deliang

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193,China)

The LAMP (loop-mediated isothermal amplification) assay based glyphosate-resistant soybean detection system was developed in this paper. A set of four basic primers and two loop primers was designed to target the exogenousCp4-epspsgene. The LAMP products were detected by agarose gel electrophoresis and SYBR Green I. The optimum result was obtained at 45 min of reaction time, 0.8 mmol/L dNTPs and 3 mmol/L Mg2+.The method developed in this paper could specifically detect glyphosate-resistant soybeans.And the low detect limit of genomic DNA of glyphosate-resistant soybeans was 5 μg/L which was 100 times higher than that of regular PCR. The field testing showed that the results of LAMP detection were consistent with those of PCR, and the accuracy of this method was 100%. The LAMP method we developed for glyphosate-resistant soybean detection is rapid,efficient, specific，sensitive and convenient，which make it a useful tool for detection of glyphosate-resistant soybean, monitoring of gene flow and research on environmental security.

glyphosate-resistant soybean;Cp4-epsps; LAMP; rapid and simple detection

2014-04-11

2014-06-25

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2014ZX008011-003)

S 565.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.017

* 通信作者 E-mail：pengdeliang@caas.cn