王夢(mèng)穎, 劉 敬, 瞿紹洪, 王旭麗*, 王國(guó)梁*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193;2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所, 杭州 310021)

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水稻抗稻瘟菌HIGS表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

王夢(mèng)穎1, 劉 敬1, 瞿紹洪2, 王旭麗1*, 王國(guó)梁1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193;2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所, 杭州 310021)

水稻是我國(guó)主要糧食作物之一,而稻瘟病是影響水稻安全生產(chǎn)的最主要病害之一。為克服抗病基因的抗病性很快消失的弊端,本研究嘗試了宿主誘導(dǎo)的基因沉默(HIGS)技術(shù)在創(chuàng)制抗稻瘟病水稻新材料上的可行性。HIGS是新發(fā)展起來(lái)的以RNAi為基礎(chǔ)的抗病技術(shù),即在寄主植物中表達(dá)可沉默病原物特定基因的HIGS載體,達(dá)到控制病原菌擴(kuò)展的目的。本研究選取了兩個(gè)稻瘟菌致病關(guān)鍵基因Nox1和NAC為研究靶標(biāo),分別克隆其UTR區(qū)和CDS區(qū)中的特異區(qū)段,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建這4個(gè)片段HIGS表達(dá)載體,再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將各載體分別轉(zhuǎn)化水稻,通過(guò)鑒定得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株,為后續(xù)開(kāi)展該技術(shù)在水稻抗稻瘟病方面的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

水稻; 稻瘟病; HIGS; 遺傳轉(zhuǎn)化

水稻是世界上種植最廣泛的農(nóng)作物之一,養(yǎng)育了全世界超過(guò)1/2的人口[1]。隨著人口的增長(zhǎng)及人們生活水平的提高,水稻產(chǎn)量需要在2030年提高40%方可滿足水稻供需平衡[2]。目前的水稻產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)難以滿足消費(fèi)需求,這要求我們培育出更優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的水稻品種來(lái)克服由生物或非生物因素造成的損失。在諸多生物因素中,稻瘟病是影響水稻高產(chǎn)最嚴(yán)重的威脅之一[3-4]。稻瘟病由稻梨孢菌(Magnaporthegrisea)引起,每年因該病害損失的糧食可以養(yǎng)活六千萬(wàn)人口,造成經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)700億美元[5]。因此,稻瘟病的防控成為水稻生產(chǎn)中的重要課題。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是真核生物中普遍存在的一種基因調(diào)控手段,其通過(guò)siRNA或microRNA介導(dǎo),抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)。近年來(lái)基因沉默機(jī)制的相關(guān)研究為探索病原真菌與宿主的互作以及新型控病策略提供了新的思路。RNAi機(jī)制已經(jīng)被用來(lái)商業(yè)化創(chuàng)制對(duì)病毒有抗性的轉(zhuǎn)基因植株[6]。HIGS(host-induced gene silencing)是新發(fā)展起來(lái)的基于RNAi的抗病技術(shù),通過(guò)在寄主植物中表達(dá)以病原真菌特定基因?yàn)榘袠?biāo)的RNAi載體，特異性地沉默該病原真菌中靶標(biāo)基因的表達(dá)[7]。對(duì)布氏白粉菌[Blumeriagraminis(DC.) Speer][8]、條形柄銹菌(PucciniastriiformisWest)[9]、輪枝鐮孢菌[Fusariumverticillioides(Sacc.) Nirenberg][10]等的相關(guān)研究已經(jīng)證明了利用HIGS機(jī)制來(lái)創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因抗病植株的可行性。在大麥或小麥中導(dǎo)入以布氏白粉菌致病相關(guān)基因?yàn)榘袠?biāo)的dsRNA或者反義RNA,可使轉(zhuǎn)基因植株對(duì)白粉菌具有抗性,當(dāng)通過(guò)HIGS機(jī)制沉默效應(yīng)子Avra10的表達(dá),在缺失相應(yīng)的抗病基因Mla10的情況下,病原菌的正常生長(zhǎng)受到抑制。在擬南芥或大麥中導(dǎo)入以輪枝鐮孢菌基因CYP51為靶標(biāo)的dsRNA,大大提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)輪枝鐮孢菌的抗性。在針對(duì)條形柄銹菌的HIGS研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)沉默基因PtMAPK1、PtCYC1、PtCNB的表達(dá)時(shí),寄主對(duì)病原菌的抗性增強(qiáng),病原菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)孢都受到了抑制[8-10]。以上研究結(jié)果表明,宿主誘導(dǎo)的基因沉默有潛力作為一種新型植物保護(hù)措施,用于培育持久抗病的作物新品系。

雖然在多個(gè)病原真菌-宿主互作體系中已經(jīng)證實(shí)了HIGS的作用,但尚無(wú)研究報(bào)道HIGS是否對(duì)水稻抗稻瘟病有效。本研究選取了2個(gè)稻瘟菌致病關(guān)鍵基因Nox1和NAC進(jìn)行HIGS的相關(guān)研究。Nox1和NAC基因存在于稻瘟菌中,Nox1編碼NADPH氧化酶,是稻瘟菌附著胞正常形成并完成侵染的關(guān)鍵基因,該基因缺失會(huì)導(dǎo)致稻瘟菌致病性喪失[11]。NAC編碼ATP合成酶,是植物病原真菌致病關(guān)鍵因子(本研究團(tuán)隊(duì)擬發(fā)表數(shù)據(jù))。本研究分別克隆這2個(gè)基因的UTR區(qū)及CDS區(qū)中的特異片段,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建這4個(gè)片段HIGS表達(dá)載體,并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入水稻獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株,為水稻抗稻瘟病分子育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RNA提取所用稻瘟菌菌株70-15、轉(zhuǎn)化用水稻品種‘日本晴’種子、克隆用宿主菌E.coliDH5α均為本實(shí)驗(yàn)室保存。載體pENTR和pBDL03由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈(zèng)。大腸桿菌(E.coli) DH5α感受態(tài)以及農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室制備。TRIzol、GatewayLR ClonaseTMII Enzyme Mix試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司,限制性內(nèi)切酶(BamHI、XhoI、KpnI、SacI)、TaqDNA聚合酶、dNTPs及T4DNA連接酶購(gòu)自Fermentas公司,RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA回收純化試劑盒、各種抗生素(潮霉素、卡那霉素、利福平)購(gòu)自Promega公司,其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。引物合成及測(cè)序由北京華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNAi干擾區(qū)段的選擇與引物設(shè)計(jì)

選擇稻瘟菌中2個(gè)致病關(guān)鍵基因Nox1(MGG_00750)和NAC(MGG_02660)來(lái)進(jìn)行HIGS研究。Nox1調(diào)節(jié)NADPH的形成[11],NAC編碼ATP合成酶。根據(jù)在稻瘟菌數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的這2個(gè)基因的基因組DNA序列及CDS序列,通過(guò)在稻瘟菌數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.broadinstitute.org/annotation/genome/magnaporthe_grisea/MultiHome.html)及水稻數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,分別在這2個(gè)基因的UTR區(qū)及CDS區(qū)選取大約350 bp的特異區(qū)段作為RNAi干擾區(qū)段(注意所選取的RNAi干擾區(qū)段必須是特異性的,干擾這段區(qū)域不會(huì)對(duì)其他基因的表達(dá)造成影響)。采用Primer 5.0設(shè)計(jì)4個(gè)干擾區(qū)段的引物,并在上游引物5′端添加BamHI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基,在下游引物5′端添加X(jué)hoI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。所選取的RNAi干擾區(qū)段不含BamHI、XhoI、KpnI、SacI酶切位點(diǎn)(表1)。

1.2.2 RNA提取與目標(biāo)干擾片段的獲得

采用TRIzol法提取稻瘟菌70-15菌株的總RNA,使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用25 μL的PCR反應(yīng)體系,包含0.5 μL的反轉(zhuǎn)錄cDNA,10 μmol/L的上下游引物各1 μL,1U的TaqDNA聚合酶,1×PCR緩沖液,2 μL dNTPs。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證其條帶大小正確后回收并檢測(cè)產(chǎn)物濃度。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物1)

1) 小寫(xiě)序列為所添加的限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI的酶切位點(diǎn)。

The lowercase letters indicate the restriction enzyme sites ofBamHI andXhoI.

1.2.3 HIGS表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.3.1 入門(mén)載體的構(gòu)建

pENTR載體為入門(mén)載體,該載體的多克隆位點(diǎn)含BamHI和XhoI酶切位點(diǎn),PCR獲得的RNAi干擾片段兩端也具有這2個(gè)酶切位點(diǎn)。pENTR空載體質(zhì)粒及純化后的PCR產(chǎn)物均由限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切,對(duì)酶切并純化后的pENTR空載體和RNAi干擾片段使用T4連接酶在22 ℃孵育2 h，從而將靶標(biāo)基因的特異RNAi干擾片段連到入門(mén)載體中。

將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,轉(zhuǎn)化后菌液涂布于含卡那霉素的LB固體平板上。37 ℃孵育10～14 h。

從平板上挑取單克隆搖培,提取菌液質(zhì)粒并使用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切鑒定，以pENTR空載體雙酶切作為對(duì)照。陽(yáng)性載體送華大基因測(cè)序,測(cè)序正確即成功構(gòu)建入門(mén)載體。

1.2.3.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

pBDL03為HIGS表達(dá)載體(圖1)。構(gòu)建成功的入門(mén)載體pENTR在RNAi干擾片段的兩端含有2個(gè)重組位點(diǎn)attL1和attL2,HIGS表達(dá)載體pBDL03中含有attR1和attR2重組位點(diǎn)。將構(gòu)建成功的入門(mén)載體和HIGS空表達(dá)載體pBDL03利用Gateway技術(shù)進(jìn)行LR重組反應(yīng),入門(mén)載體的重組位點(diǎn)會(huì)與HIGS表達(dá)載體的重組位點(diǎn)發(fā)生同源重組,入門(mén)載體中的RNAi干擾序列將替換掉HIGS表達(dá)載體中attR1和attR2重組位點(diǎn)間的序列,實(shí)現(xiàn)將外源RNAi干擾片段構(gòu)建到HIGS表達(dá)載體的目的。

使用GatewayLR ClonaseTMII Enzyme Mix試劑盒進(jìn)行LR重組反應(yīng)構(gòu)建表達(dá)載體。5 μL的反應(yīng)體系中包含：入門(mén)載體50～150 ng,pBDL03空載體(與入門(mén)載體的摩爾比需接近1∶1),TE緩沖液(pH 8.0),1 μL LR enzyme mix。輕輕混合,25 ℃過(guò)夜反應(yīng)。

加入0.5 μL蛋白酶K終止反應(yīng)。37 ℃孵育10 min,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,取菌液涂布于含卡那霉素的LB固體平板上。37 ℃孵育10～24 h,從平板上挑取單克隆搖培,提取菌液質(zhì)粒并用KpnI、SacI雙酶切鑒定(pBDL03載體中含這2個(gè)酶切位點(diǎn)),以pBDL03空載體雙酶切作為對(duì)照。鑒定為陽(yáng)性的載體送華大基因測(cè)序,測(cè)序正確即完成了HIGS表達(dá)載體的構(gòu)建。

1.2.4 HIGS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻

采用電轉(zhuǎn)法將4個(gè)HIGS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞,將菌液涂布于含卡那霉素和利福平的LB固體篩選平板上,28 ℃培養(yǎng)2～3 d。從平板上挑取單克隆進(jìn)行KpnI、SacI雙酶切鑒定。鑒定正確的菌株用于水稻轉(zhuǎn)化。

圖1 HIGS表達(dá)載體pBDL03圖譜Fig.1 The map of HIGS expression vector pBDL03

參考Hiei等[12]的方法進(jìn)行水稻轉(zhuǎn)化。將水稻成熟的胚愈傷組織與含HIGS表達(dá)載體的農(nóng)桿菌共培養(yǎng),然后經(jīng)含潮霉素的篩選培養(yǎng)基篩選2次得到抗性愈傷組織, 分化、再生得到轉(zhuǎn)基因水稻株系。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的篩選及PCR檢測(cè)

因HIGS表達(dá)載體中含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記基因(hpt)及mCherry紅色熒光蛋白標(biāo)記基因,所以對(duì)得到的4個(gè)HIGS表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行潮霉素抗性鑒定及紅色熒光觀察,可初步篩選出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

剪取轉(zhuǎn)基因植株的綠色健康葉片浸泡于含潮霉素(100 μg/mL)和6-芐氨基嘌呤(1 μg/mL)的檢測(cè)液中,26 ℃，L∥D=12 h∥12 h下培養(yǎng),5～7 d后觀察葉片顏色的變化,判斷植株對(duì)潮霉素的抗性水平[13]。

使用熒光蛋白觀察儀,戴上裝有熒光濾光片的觀察帽,在黑暗環(huán)境下用紅色熒光激發(fā)光源對(duì)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因植株的莖稈和葉片,觀察mCherry紅色熒光蛋白。

通過(guò)以上方法初步篩選出轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株,選取其中部分植株,采用CTAB法提取水稻植株的基因組DNA,以基因組DNA稀釋液為模板,使用擴(kuò)增RNAi干擾片段的引物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)干擾片段的獲得

以稻瘟菌菌株70-15總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,用設(shè)計(jì)的4對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別獲得Nox1基因的5′UTR區(qū)和CDS區(qū)、NAC基因的3′UTR區(qū)和CDS區(qū)中特異片段,大小依次為342、368、329和359 bp。

2.2 入門(mén)載體的構(gòu)建及其鑒定

RNAi干擾片段與pENTR入門(mén)空載體經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)后,由卡那霉素篩選得到入門(mén)克隆,挑取單菌落搖菌,提取質(zhì)粒后通過(guò)限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切鑒定。成功構(gòu)建的載體在經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切后凝膠電泳可分離出大小分別為2 700 bp和350 bp左右的電泳條帶,結(jié)果顯示,4個(gè)RNAi干擾片段均成功導(dǎo)入入門(mén)載體(圖2)。

圖2 入門(mén)載體的酶切鑒定Fig.2 Identification of the entry vectors by restriction enzyme digestion

2.3 HIGS表達(dá)載體的構(gòu)建及其鑒定

構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后電泳分離可分別獲得10 kb和2 kb左右的電泳條帶。結(jié)果顯示,各重組質(zhì)粒均構(gòu)建成功。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序,測(cè)序正確的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。

2.4 HIGS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻

將成功構(gòu)建的HIGS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105后,篩選得到目的克隆。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將HIGS表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻中,每個(gè)HIGS表達(dá)載體均獲得轉(zhuǎn)基因水稻T0代植株。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的篩選及PCR檢測(cè)

4個(gè)HIGS表達(dá)載體的T1代轉(zhuǎn)基因植株通過(guò)潮霉素抗性檢測(cè)(圖3)和mCherry紅色熒光觀察初步鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

圖3 轉(zhuǎn)基因水稻植株的潮霉素抗性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The hygromycin resistance test of the transgenic plants

提取各載體T1代轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA,使用目標(biāo)干擾片段的引物鑒定。結(jié)果顯示野生型植株的基因組DNA PCR擴(kuò)增后電泳未出現(xiàn)任何條帶,而陽(yáng)性植株的基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后,出現(xiàn)了約350 bp左右的電泳條帶,表明HIGS載體上的外源基因片段存在于該水稻植株中(圖4)。

圖4 轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR檢測(cè)Fig.4 PCR detection of transgenic rice plants

HIGS表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株TransgenicplantstransformedbyHIGSconstructspBDL03-Nox1-UipBDL03-Nox1-MipBDL03-NAC-UipBDL03-NAC-Mi總株數(shù)Numberoftransgenicplants46314442潮霉素抗性植株Hygromycin+31203827帶mCherry紅色熒光基因植株mCherry+28203830基因組PCR檢測(cè)為陽(yáng)性植株GenomicDNAPCR+29223735經(jīng)3種方法鑒定均為陽(yáng)性的植株P(guān)ositivetransgenicplantsidentifiedthrough3methods28193727

表2中展示了通過(guò)以上3種方法鑒定出的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種方法的鑒定結(jié)果一致性較好,選取3種方法鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性的植株進(jìn)行擴(kuò)繁并做進(jìn)一步的抗病分析,選取3種方法鑒定結(jié)果均為陰性的植株作為后續(xù)試驗(yàn)的對(duì)照。

3 討論

本研究利用了傳統(tǒng)的酶切和連接方法,結(jié)合Gateway位點(diǎn)特異性重組技術(shù),構(gòu)建了分別以稻瘟菌致病關(guān)鍵基因Nox1和NAC為靶標(biāo)的HIGS表達(dá)載體。這種載體構(gòu)建方法簡(jiǎn)單快捷,僅需兩步亞克隆,即可使外源片段快速構(gòu)建到HIGS表達(dá)載體中。我們所選擇的HIGS表達(dá)載體含有由Gus linker連接的2個(gè)反向attR位點(diǎn),重組反應(yīng)后RNAi干擾片段整合到重組位點(diǎn)之間,由Gus linker連接2個(gè)反向的RNAi干擾序列,產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu),形成dsRNA并由dsRNA引發(fā)下一步的RNAi反應(yīng)。另外HIGS表達(dá)空載體的每個(gè)attR位點(diǎn)之間含有ccdB致死基因,如果重組反應(yīng)不成功則轉(zhuǎn)化菌不能存活,該機(jī)制保證了LR反應(yīng)后得到的表達(dá)載體的準(zhǔn)確性。值得一提的是,在進(jìn)行LR反應(yīng)構(gòu)建HIGS表達(dá)載體的過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)注意以下幾點(diǎn)可提高構(gòu)建效率。第一,為降低成本,可將10 μL的反應(yīng)體系減半為5 μL的反應(yīng)體系。第二,使用新鮮的入門(mén)載體質(zhì)粒及HIGS表達(dá)空載體質(zhì)粒有助于提高重組效率,另外要保證質(zhì)粒濃度較大,LR反應(yīng)時(shí)HIGS表達(dá)空載體與入門(mén)載體的摩爾比為1∶1時(shí)重組效率高。第三,加入GatewayLR ClonaseTMII Enzyme Mix酶后將反應(yīng)液置于25 ℃過(guò)夜反應(yīng)可提高重組率。

本研究將構(gòu)建好的4個(gè)HIGS表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻獲得轉(zhuǎn)基因植株。因?yàn)槲覀兯褂玫腍IGS表達(dá)載體是在pANDA載體的基礎(chǔ)上改造而成的,改造后的HIGS載體在具有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記基因,卡那霉素抗性基因的基礎(chǔ)上,連接進(jìn)了mCherry基因。因此在對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的篩選過(guò)程中,不僅可以利用對(duì)潮霉素的抗性初步篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株,也可以通過(guò)使用熒光觀察儀來(lái)初步篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株,因?yàn)槌晒D(zhuǎn)入HIGS表達(dá)載體的植株會(huì)表達(dá)mCherry紅色熒光蛋白,從而更加便利了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的篩選。結(jié)果證明潮霉素抗性鑒定、mCherry紅色熒光蛋白鑒定和提取植株基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)鑒定3種方法一致性較好,證明了這3種鑒定方法均具有可行性。通過(guò)3種方法鑒定結(jié)論均為陽(yáng)性的植株其HIGS表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入的可靠性更高。并且潮霉素抗性鑒定及mCherry紅色熒光蛋白觀察鑒定這兩種方法操作簡(jiǎn)便,成本較低,可為大規(guī)模篩選鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株節(jié)省時(shí)間、人力、物力。

本研究構(gòu)建了HIGS表達(dá)載體并成功轉(zhuǎn)化水稻得到了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株,為下一步的轉(zhuǎn)基因植株的抗病性鑒定奠定了基礎(chǔ)。本研究獲得的轉(zhuǎn)基因植株同傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植株不同,被導(dǎo)入寄主植物的是以病原菌致病相關(guān)基因?yàn)榘袠?biāo)的dsRNA。當(dāng)病原菌侵入寄主植物時(shí),這些dsRNA具有引發(fā)RNAi作用的潛力,可沉默病原菌中的靶基因表達(dá),影響病原菌的繼續(xù)侵染,達(dá)到提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)該病原菌的抗性的目的。雖然HIGS現(xiàn)象已經(jīng)被證明在作物抗布氏白粉菌、條形柄銹菌、輪枝鐮孢菌侵染危害中發(fā)揮作用,但是HIGS是否對(duì)水稻抗稻瘟菌有作用還未見(jiàn)報(bào)道。這是在水稻中轉(zhuǎn)入稻瘟菌致病相關(guān)基因干擾片段進(jìn)行HIGS研究的首次嘗試,具有重要的理論意義與實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Construction of rice blast resistant HIGS expression vectors for rice genetic transformation

Wang Mengying1, Liu Jing1, Qu Shaohong2, Wang Xuli1, Wang Guoliang1

(1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2.Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021,China)

Rice blast disease seriously influences the quality and production of rice, the main food crop in China. To overcome the easy breakdown of conventional disease resistant transgenic plants, we used HIGS (host induced gene silencing) to create new kind of transgenic rice plants. By transforming HIGS constructs targeting the virulence-related genes of the rice blast fungusMagnaporthegriseainto host plants, HIGS could suppress the fungal development and virulence. We chose two important genes inM.oryzaeand cloned the specific fragments of the genes for HIGS vector construction. Then we transformed the HIGS constructs into rice. This research lays the foundation for molecular breeding of rice blast resistant varieties.

rice; rice blast; HIGS (host induced gene silencing); genetic transformation

2014-04-06

2014-07-25

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2012ZX08009001)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(31101404)

Q 782

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.015

實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)ExperimentalMethod&Technology

* 通信作者 E-mail:lilywang0313@163.com；wang.620@osu.edu