張小飛, 李 曉, 崔麗娜, 鄒成佳, 楊曉蓉, 向運佳

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室, 成都 610066)

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玉米圓斑病菌(Bipolariszeicola)遺傳多樣性ISSR分析

張小飛, 李 曉*, 崔麗娜, 鄒成佳, 楊曉蓉, 向運佳

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室, 成都 610066)

利用簡單序列重復(fù)間隔區(qū)(inter-simple sequence repeats, ISSR)標(biāo)記對玉米圓斑病菌(Bipolariszeicola)的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。篩選出9個擴(kuò)增多態(tài)性好且穩(wěn)定的通用引物,共擴(kuò)增出47條DNA條帶,大小分布于250～2 000 bp之間,其中多態(tài)性條帶為33條,為總條帶數(shù)的70.21%。遺傳距離為0.91處時,所有菌株被聚為6個組。ISSR標(biāo)記可以揭示菌株間的親緣關(guān)系及差異性,可用于玉米圓斑病菌遺傳多樣性研究。此外,通過分子標(biāo)記劃分的類群與利用寄主反應(yīng)型之間存在一定相關(guān)性,但其關(guān)系并不密切。

玉米圓斑病菌; 簡單序列重復(fù)間區(qū); 遺傳多樣性; 聚類分析

玉米圓斑病在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生,病原為玉米平臍蠕孢(Bipolariszeicola)。國內(nèi)于20世紀(jì)60年代中后期至70年代在吉林省玉米自交系‘吉63’及其選育的品種上嚴(yán)重發(fā)生,使圓斑病在吉林省多次流行成災(zāi),成為當(dāng)時影響玉米生產(chǎn)的重要病害[1]。隨后在遼寧、內(nèi)蒙古、四川、云南等地報道了玉米圓斑病的發(fā)生[2-5]。近幾年該病已經(jīng)蔓延到很多地區(qū),并且隨著生產(chǎn)水平的提高、品種的更換,有逐年加重發(fā)生的趨勢,對玉米生產(chǎn)帶來很大的影響。目前在玉米圓斑病的研究和描述中,對玉米圓斑病菌生物學(xué)特性、生理分化、品種抗病性、毒素等方面已有相關(guān)報道[6-8],而對玉米圓斑病菌遺傳多樣性研究報道較少。

玉米圓斑病菌有明顯的生理分化現(xiàn)象,現(xiàn)已報道玉米圓斑病菌有5個生理小種,Ullstrup報道了1號和2號2個生理小種[9];Nelson和Dodd等分別報道了3號和4號小種[10-11];Welz等報道了0號小種[12],迄今還沒有新的小種報道。圓斑病菌小種鑒定主要是根據(jù)引起病斑形狀的不同來區(qū)分,其中0號小種無致病性;1號小種有寄主專化性,可分泌?；远舅豀C-toxin,能在感病的玉米品種上引起大的卵圓形壞死斑;2號小種無寄主專化性,在寄主上產(chǎn)生枯黃的小型斑點;3號小種無寄主?；?對絕大多數(shù)的玉米品種有致病性,產(chǎn)生狹長的條形斑;4號小種對含有 B73 遺傳背景的自交系致病,在一些雜交品種上產(chǎn)生大的帶有同心輪紋的壞死斑。我國已經(jīng)報道有3個小種[13],分別為1號、2號、3號小種,主要分布于我國的東北和西南地區(qū)。白金鎧將我國發(fā)生的玉米圓斑病病菌鑒定為1號和2號兩個生理小種[14],孫廣宇報道玉米條斑型葉斑病是由3號生理小種引起[15],0號與4號小種在我國暫無報道。

ISSR(inter-simple sequence repeats)是一種基于微衛(wèi)星序列發(fā)展起來的分子標(biāo)記,具有簡便迅速、穩(wěn)定高效、DNA多態(tài)性高等優(yōu)點,具有比RAPD更高的可重復(fù)性和穩(wěn)定性,且擴(kuò)增時退火溫度比較高,保證PCR擴(kuò)增的可重復(fù)性[16]。目前ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在作物的遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種及品種純度鑒定方面得到了廣泛應(yīng)用,已被用于玉米絲黑穗病菌、玉米大斑病菌、小麥白粉病菌、鐮孢菌等植物病原菌的遺傳多樣性研究[17-20]。關(guān)于利用ISSR技術(shù)對玉米圓斑病菌的研究尚無公開報道,因此,這一標(biāo)記技術(shù)在圓斑病菌的遺傳多態(tài)性研究上具有重要的理論價值和廣闊的應(yīng)用前景。本研究探索了ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在玉米圓斑病菌研究中的應(yīng)用,在確定ISSR的可行性的同時,從DNA水平上了解探索不同來源的玉米圓斑病菌的遺傳多樣性與致病反應(yīng)型的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

自四川、湖北和云南等地采集典型玉米圓斑病病斑,采用單孢分離法[21]共獲得24個分離物。通過對病原菌形態(tài)學(xué)鑒定及其rDNA ITS序列分析,確認(rèn)分離物屬于玉米平臍蠕孢(Bipolariszeicola)(見表1)。以玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)作為對照菌株。

1.2 DNA提取

供試24個菌株接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中(馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,水1 000 mL),25 ℃振蕩培養(yǎng)7 d,收集菌絲后冷凍干燥,加液氮研磨成干粉。基因組DNA提取采用康為試劑公司的DNA提取試劑盒,具體操作參照試劑盒說明書。

表1 遺傳多態(tài)性研究的供試菌株

1.3 供試菌株ISSR擴(kuò)增

1.3.1 供試引物

ISSR引物是根據(jù)植物病原真菌基因組DNA重復(fù)序列的特征,從加拿大哥倫比亞大學(xué)提供的100條ISSR引物中篩選出9條擴(kuò)增條帶清晰,多態(tài)性好的引物(見表2),并由上海生工生物工程公司合成。

1.3.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系為20 μL,其中10×buffer 2 μL,MgCl22 μL (25 mmol/L),dNTP 0.6 μL (10 mmol/L),Taq酶0.2 μL(5 U/μL),引物1.5 μL(10 μmol/L),DNA 模板1 μL(25 ng) ddH2O 12.7 μL。

1.3.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

94 ℃ 2 min、55 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s 1個循環(huán);92 ℃ 20 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s 29個循環(huán);72 ℃ 2 min 1個循環(huán),程序結(jié)束后進(jìn)入4 ℃保持。擴(kuò)增反應(yīng)在 Prime基因擴(kuò)增儀(英國 TECHNE)上進(jìn)行。

1.4 PCR產(chǎn)物檢測

取PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行電泳檢測,電泳凝膠為1.5%的瓊脂糖,電壓為4 V/cm。Marker為DL2000(大連TaKaRa公司)。紫外分析儀檢測擴(kuò)增效果,并拍照、記錄。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

參照擴(kuò)增圖譜,出現(xiàn)條帶賦值為“1”,無條帶賦值為“0”,用NTSYS-PC軟件中的STMQUAL程序計算DNA相似系數(shù),并用UPGMA程序構(gòu)建遺傳相關(guān)聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取

采用基因組DNA提取試劑盒提取了供試菌株的基因組DNA。利用超微量分光光度計(NanoDrop2000)測得DNA濃度為200～500 ng/μL,A260/A280在1.8～2.0之間,表明DNA純度較好,適合PCR分析。統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL備用。

2.2 ISSR擴(kuò)增結(jié)果

利用玉米圓斑病菌基因組混合DNA進(jìn)行引物篩選,篩選出9個條帶清晰、穩(wěn)定、分布合理、重復(fù)性好的ISSR引物。篩選出的引物編號及其核苷酸序列見表2。

表2 9個ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果分析

用篩選出的9個通用引物分別對24株玉米圓斑病菌和1株玉米大斑病菌、1株玉米小斑病菌進(jìn)行ISSR擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果表明,不同引物的擴(kuò)增條帶數(shù)不同,并且玉米大斑病菌和玉米小斑病菌擴(kuò)增帶型與玉米圓斑病菌差異明顯。單獨統(tǒng)計供試的24株玉米圓斑病菌,共擴(kuò)增出47條DNA條帶;多態(tài)性條帶為33條,為總條帶數(shù)的70.21%(表2),大小分布于250～2 000 bp之間。9個引物的擴(kuò)增圖譜中,都有2條以上的共同譜帶,但是在個別遺傳位點上存在一定的差異。玉米圓斑病菌菌株間擴(kuò)增圖譜既表現(xiàn)出種內(nèi)的穩(wěn)定性,又反映出不同菌株之間的差異。由引物ISSR1對部分菌株的擴(kuò)增結(jié)果(圖1)可以看出,菌株YN1102、YN1103有一條特異性條帶與其他菌株差異較大,而這兩個菌株對寄主的反應(yīng)型明顯不同。對照菌株玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)與供試圓斑病菌帶型差異較大,在約500 bp處擴(kuò)出一條亮的條帶,和其他菌株差異明顯。而玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)在500～2 000 bp有2條特異性條帶,也與其他菌株明顯有區(qū)別。

圖1 引物ISSR1對部分供試菌株的擴(kuò)增圖譜Fig.1 Amplification products with primer ISSR1 for some isolates

2.3 聚類分析

聚類分析表明,供試菌株間的相似系數(shù)在0.78～1.00之間,不同菌株間相似程度明顯不同。其中,菌株YN1104和GZ1110,YN1102和YN1103相似系數(shù)都為1.00,表明兩個菌株同源性強(qiáng),不存在顯著的遺傳變異。而菌株HB1134與YN1102相似程度最低,為0.78,在DNA水平上存在明顯差異。ISSR擴(kuò)增結(jié)果聚類圖可知(圖2),當(dāng)相似系數(shù)在0.8左右時,可將供試玉米圓斑病菌與玉米大斑病菌、玉米小斑病菌明顯區(qū)別開,所有的玉米圓斑病菌菌株聚為一大類群。在相似系數(shù)為0.91左右時,可將24個株菌劃分為6個類群(BipolariszeicolaGroups,稱BGs),即BGⅠ、BGⅡ、BGⅢ、BGⅣ、BGⅤ、BGⅥ。BGⅠ群包括GZ1101、YN1102、YN1103共3個菌株,占總數(shù)的12.5%。BGⅡ群包括YN1104、GZ1110、HB1109等共11個菌株,占總數(shù)的45.8%,BGⅢ群包括YN1139、YN1140、YN1141等3個菌株,BGⅣ群包括SC1113、HB1138、HB1136、HB1137等4個菌株,BGⅤ包括HB1108、JL1147等2個菌株,BGⅥ只有一個來自湖北的菌株HB1134。玉米圓斑病菌各菌株表現(xiàn)出了一定的遺傳多樣性。此外,從聚類圖可以看出,BGⅠ、BGⅡ兩個大群里內(nèi)包含了來自各個采樣區(qū)的菌株,表明遺傳多樣性與地理來源之間無明顯的相關(guān)性。而在類群BGⅢ、BGⅤ均為對寄主產(chǎn)生圓形病斑的菌株,僅有YN1102被聚在了BGⅠ類群中,可見,通過ISSR分子標(biāo)記劃分的類群與利用寄主鑒定的致病類型之間存在一定相關(guān)性,但其關(guān)系并不密切,不能完全吻合。這可能是由于ISSR分子標(biāo)記是根據(jù)菌株本身的整個基因組遺傳差異建立的,反映病菌遺傳多樣性的實質(zhì),而致病類型則是依據(jù)在寄主上反應(yīng)類型劃分的,受鑒別寄主病菌互作及人為評判標(biāo)準(zhǔn)的影響。這說明DNA水平上的變化還不能完全反映所有病原菌致病力的分化。因此,將分子標(biāo)記技術(shù)和傳統(tǒng)的植物病理學(xué)技術(shù)結(jié)合起來,有利于更好地研究玉米圓斑病菌生理分化動態(tài),指導(dǎo)玉米圓斑病抗病育種和品種的合理布局。

圖2 供試菌株在DNA水平上的聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of the isolates tested at DNA level

3 結(jié)論與討論

ISSR分子標(biāo)記結(jié)果穩(wěn)定性高,不受樣品形態(tài)及環(huán)境因子的限制[22-23],ISSR引物核苷酸鏈的延長,退火溫度較高,擴(kuò)增的穩(wěn)定性也大大增強(qiáng)[24],本試驗對不同地區(qū)采集分離的玉米圓斑病菌進(jìn)行ISSR分子標(biāo)記和表型性狀的遺傳分析,結(jié)果顯示各菌株間的遺傳相似系數(shù)變化較大,可將24個株菌劃分為6個類群(BipolariszeicolaGroups,稱B G s),玉米圓斑病菌表現(xiàn)出了明顯的分化現(xiàn)象。聚類結(jié)果說明ISSR技術(shù)可用于玉米圓斑菌株親緣關(guān)系分析,能客觀地反映其遺傳基礎(chǔ)上的差異。同時對采集分離的圓斑病菌在不同寄主上引起的病斑反應(yīng)型進(jìn)行了田間鑒定,通過人工接種后3 d左右開始發(fā)病,發(fā)病初期病斑為黃褐色點狀,隨后有的縱向擴(kuò)展,表現(xiàn)為不均勻的線形病斑,有的只是橫向擴(kuò)展,表現(xiàn)為圓形病斑。聚類結(jié)果顯示,通過ISSR分子標(biāo)記劃分的類群與利用鑒別寄主鑒定的致病反應(yīng)型(生理小種)之間存在一定相關(guān)性,但其關(guān)系并不密切。ISSR分子標(biāo)記遺傳多樣性與供試菌株的地理來源之間無明顯的相關(guān)性,不同的類群里包含了來自各個地區(qū)的菌株。由于采集到的病菌數(shù)量有限,本研究只對供試菌株做了初步的劃分,尚需進(jìn)行仔細(xì)的鑒定工作和更全面的比較研究,尋找更多的ISSR多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)一步深入揭示玉米圓斑病菌遺傳多樣性與致病反應(yīng)型(生理小種)的關(guān)系,同時對田間病菌群體進(jìn)行分析,研究田間玉米圓斑病菌的群體結(jié)構(gòu)和進(jìn)化。

目前,圓斑病菌小種的劃分尚未確立一套類似于玉米大斑病菌那樣的具有抗病單基因為背景的材料,其劃分小種的依據(jù)主要以病原菌在寄主上的病斑反應(yīng)類型及致病性的強(qiáng)弱,而致病性強(qiáng)弱與病菌產(chǎn)生的?；远舅赜嘘P(guān),可以對寄主?；远舅剡M(jìn)行研究,分析各小種致病基因的差異[25]。由于玉米圓斑病菌種內(nèi)分化尚無統(tǒng)一的鑒別寄主,病原菌小種鑒定主要以病原菌在不同寄主上的病斑類型及病斑大小作為依據(jù)[26-27],并且小種生理分化有可能受寄主品種、環(huán)境條件等諸多因子影響,因此采用鑒別寄主鑒定與分子標(biāo)記結(jié)合是比較科學(xué)的監(jiān)測病菌分化的手段,既能從遺傳本質(zhì)上反映病菌的特征,又能揭示寄主-病菌親合與非親合互作的遺傳變異機(jī)制,為今后深入研究病菌致病機(jī)制和寄主抗性機(jī)制以及從根本上解決該病害防治問題奠定基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Genetic diversity analysis of corn leaf spot caused byBipolariszeicolawith ISSR markers

Zhang Xiaofei, Li Xiao, Cui Lina, Zou Chengjia, Yang Xiaorong, Xiang Yunjia

(Institute of Plant Protection, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southwest, Ministry of Agriculture, P.R.China, Chengdu 610066, China)

Genetic diversity of 24Bipolariszeicolaisolates, isolated from different locations in Southwest China, were analyzed with ISSR (inter-simple sequence repeats) markers. The results showed that a total of 47 bands were amplified using 9 primers. The length of these bands ranged from 250-2 000 bp, and 33 of the bands were polymorphic, accounting for 70.21% of the total. At a similar level of 0.91, all isolates were clustered into six distinct groups. ISSR analysis could reveal the phylogenetic relationships and difference between the tested isolates ofB.zeicola. In addition, there was a correlation between the groups divided by molecular markers and the pathogenic types identified by host reaction type, but the correlation was not significant.

Bipolariszeicola; inter-simple sequence repeats; genetic diversity; cluster analysis

2014-04-23

2014-07-23

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(玉米)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-02-15);四川省財政創(chuàng)新能力提升工程項目(2015QNTG-011)

S 435.131

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.006

* 通信作者 E-mail:lixiaomaize@163.com