盧彩鴿, 張殿朋, 劉 霆, 董紅平, 王俊麗, 劉偉成*

(1. 北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所, 北京 100097; 2. 廣東海洋大學農(nóng)學院, 湛江 524088)

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研究報告ResearchReports

解淀粉芽胞桿菌MH71的生防活性及脂肽類抗生素基因檢測

盧彩鴿1, 張殿朋1, 劉 霆1, 董紅平1, 王俊麗2, 劉偉成1*

(1. 北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所, 北京 100097; 2. 廣東海洋大學農(nóng)學院, 湛江 524088)

從漠河多年永凍土層采集的凍土樣品中分離的拮抗菌解淀粉芽胞桿菌MH71,對多種植物病原真菌和細菌具有較強的拮抗作用。本文對該菌株的生防活性相關(guān)特性及其對番茄灰霉病的離體防效進行了研究,同時,應用特異性引物對MH71中脂肽類抗生素合成有關(guān)基因進行檢測。結(jié)果表明,該拮抗菌產(chǎn)生嗜鐵素、蛋白酶、纖維素酶和吲哚-3-乙酸(IAA),不產(chǎn)生磷酸酯酶和幾丁質(zhì)酶;番茄離體葉片第5天調(diào)查結(jié)果表明該菌發(fā)酵液對番茄灰霉病的防效為92.8%,而在番茄果實上第7天和第11天調(diào)查的結(jié)果表明,與清水對照對比,發(fā)酵原液、發(fā)酵液5倍稀釋液與50%啶酰菌胺1 000倍液化學農(nóng)藥對番茄灰霉病均有良好的防治效果,防效均為100%;從該菌的基因組DNA中擴增得到了fenB、mycB、ituA、sfp等脂肽類抗生素合成酶基因。此研究結(jié)果為該拮抗菌生防潛力的深入評價及活性物質(zhì)的分離、鑒定和番茄灰霉病的生物防治提供了重要的參考資料。

解淀粉芽胞桿菌; 番茄灰霉病; 脂肽類抗生素; 生防活性

由非核糖體途徑合成的脂肽類抗生素是芽胞桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)中最常見的一類,主要包括surfactins、iturins和fengycins 3個家族[1-3],由于脂肽類物質(zhì)為親油親水的兩親分子,對其他細菌為非特定作用模式,因此不會產(chǎn)生抗藥性細菌,可作為新一代抗生素,已經(jīng)成為當今研究開發(fā)的熱點[4],且這些抗生素由于具有抑菌譜廣、熱穩(wěn)定性強、持效期長等優(yōu)點,在植物病害防治中具有重要的作用[5]。

北京市農(nóng)林科學院植保所的生防微生物研究室自2011年9月份從中國黑龍江省漠河北極村附近的多年永凍土層采集的凍土樣品中分離出一株拮抗細菌MH71,經(jīng)鑒定該菌株為解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens),該菌株已于2012年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏編號為CGMCC 6978。該菌株具有廣譜抗菌活性,對鐮刀病菌、褐腐病菌、灰霉病菌等植物病原真菌和平菇褐斑、黃瓜角斑、大白菜黑腐病菌等植物病原細菌等均具有較強的抑菌活性[6]。

本研究以農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)生嚴重的番茄灰霉病為靶標病害,主要報道解淀粉芽胞桿菌MH71生防相關(guān)性狀測定及生防效果評價研究結(jié)果,即利用平板活性檢測生防相關(guān)特性,PCR檢測基因組中脂肽類抗生素合成相關(guān)基因,以及在番茄葉片和果實上離體檢測對番茄灰霉病的防治效果,該研究結(jié)果將為進一步認識產(chǎn)脂肽菌株在植病生防領(lǐng)域的應用潛力和深入開發(fā)利用該菌株提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

拮抗菌解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)MH71和靶標指示菌番茄灰霉病原菌(BotrytiscinereaPers.)均由北京市農(nóng)林科學院植保所生防微生物研究室自行分離和保存。

番茄灰霉病菌和MH71活化和保存分別用PDA培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基,參考文獻[7]的方法配制。MH71發(fā)酵采用改良的LB液體培養(yǎng)基(葡萄糖10.0 g,蛋白胨 10.0 g,NaCl 5.0 g,牛肉膏 3.0 g,MnSO4·H2O 5.0 mg,蒸餾水 1 000 mL,pH 7.2～7.4)。

CAS培養(yǎng)基[8]：溶液1(CAS/HDTMA溶液),把CAS溶液(60.5 mg鉻天青溶解在50 mL水中)與10 mL鐵溶液(1 mmol/L FeCl3·6H2O溶解于10 mmol/L HCl中,pH為2.0)混合后加入HDTMA溶液(72.9 mg溴化十六碳烷基三甲氨溶解于40 mL水中)并攪拌均勻后滅菌,得到的藍黑色液體即CAS/HDTMA溶液;溶液2(Salts/Buffer溶液),將30.24 g PIPES溶解于750 mL Salts溶液(KH2PO40.3 g,NaCl 0.5 g,NH4Cl 1.0 g)中,以50%(W/V)KOH調(diào)節(jié)pH 至6.8,加入15.0 g瓊脂定容至800 mL,高壓滅菌;溶液3(750 mL),葡萄糖 2.0 g,甘露醇 2.0 g,MgSO4·7H2O 493.0 mg,CaCl211.0 mg,H3BO31.4 mg,ZnSO4·7H2O 1.2 mg,MnSO4·2H2O 1.17 mg,Na2MoO4·2H2O 1 mg,CuSO440 μg,高壓滅菌。溶液3冷卻至50 ℃后加入溶液2與30 mL經(jīng)過0.22 μm微孔膜過濾除菌的10%(W/V)casamino acid混合,再加入溶液1,緩慢搖勻后鋪平板。

膠態(tài)幾丁質(zhì)培養(yǎng)基[9]：膠體幾丁質(zhì) 2.5 g,K2HPO40.7 g,KH2PO40.3 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,瓊脂15.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0。

脫脂牛奶瓊脂培養(yǎng)基：進口脫脂奶粉40.0 g,瓊脂15.0 g,蒸餾水1 000 mL,115 ℃高壓滅菌20 min,與LB固體培養(yǎng)基1∶9混勻后鋪平板。

纖維素剛果紅培養(yǎng)基[10]：MgSO4·7H2O 0.25 g,K2HPO40.5 g,纖維素1.88 g,剛果紅0.2 g,瓊脂14.0 g,明膠2.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0。

Pikovskaya’s 瓊脂培養(yǎng)基[11]：酵母提取物0.5 g,葡萄糖10.0 g,Ca3(PO4)25.0 g,(NH4)2SO40.5 g,KCl 0.2 g,MgCl20.1 g,MnSO4·H2O 0.1 mg,FeSO40.1 mg,瓊脂15.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0。

DF培養(yǎng)基[12]：蛋白胨5.0 g,酵母提取物1.5 g,牛肉膏1.5 g,NaCl 5.0 g,色氨酸0.5 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0;DF-培養(yǎng)基中不含色氨酸。

除特別標注外,培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃高壓滅菌20 min后備用。

1.2 拮抗菌MH71與生防相關(guān)的產(chǎn)素/酶的檢測

將拮抗菌MH71經(jīng)28 ℃在LB培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)24 h后,以無菌牙簽接種于1.1中制備好的各種產(chǎn)素/酶檢測培養(yǎng)基(包括嗜鐵素、幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、纖維素酶和磷酸酯酶)平板上,28 ℃培養(yǎng)48～72 h后,直接觀察拮抗菌MH71菌落周圍是否產(chǎn)生暈圈或水解透明圈,若有暈圈或透明圈的產(chǎn)生,表明產(chǎn)素陽性,以暈圈或透明圈直徑的大小來初步判斷拮抗菌產(chǎn)素能力的大小。

吲哚-3-乙酸(IAA)檢測：配制IAA純品水溶液,檢測不同濃度IAA溶液在A530nm處吸光值,繪制IAA含量標準曲線。將活化的MH71菌株接種于IAA檢測培養(yǎng)基(DF+和DF-)中,于30 ℃ 180 r/min搖培至少48 h,吸取5 mL培養(yǎng)液,10 000 r/min離心15 min,取2 mL上清液于試管中,加入100 μL 10 mmol/L磷酸及4 mL反應液(1 mL 0.5 mol/L FeCl3溶于50 mL 35% HClO4中)。混合液于室溫下反應25 min,檢測A530nm的吸光值并根據(jù)標準曲線計算IAA產(chǎn)量。

1.3 脂肽類抗生素合成酶相關(guān)基因PCR檢測

采用細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取MH71菌株的基因組DNA。擴增所選基因的引物序列及PCR擴增程序等見表1。本研究中的引物合成和序列測定均由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司完成。PCR均采用25 μL擴增體系：10 pmol/L上下游引物各1 μL,超純dNTP mixture(10 mmol/L)1 μL,2.5 UTaqDNA聚合酶0.5 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,基因組DNA模板(10 ng)1 μL,ddH2O 18 μL。PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,目標條帶經(jīng)切膠回收后,將各目的基因插入pMD18-T載體上,獲得的陽性克隆送往公司測序。所得序列利用DNAMAN 5.2.2軟件和NCBI數(shù)據(jù)庫的相關(guān)在線軟件進行同源性檢索和序列分析。

表1 擴增基因及引物序列

1.4 離體葉片和果實上的生防效果測定

番茄葉片上的離體檢測。選用葉齡相同的新鮮健康番茄葉片(品種為‘佳粉19’),將葉片用自來水流水清洗干凈后放入鋪有3～5層吸水濾紙的培養(yǎng)皿(d=270 mm)中。將拮抗菌MH71在LB固體培養(yǎng)基上28 ℃活化培養(yǎng)24 h,接種一環(huán)于改良LB液體培養(yǎng)基(100 mL裝量/500 mL三角瓶)中30 ℃ 180 r/min搖培48～72 h,然后用無菌生理鹽水將發(fā)酵液稀釋到A=0.6,制備成約 1.0×108cfu/mL的菌懸液,用無菌小型噴霧器在番茄葉片上均勻噴灑菌懸液,靜止20 min待葉片上菌懸液晾干后,將在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)了4～5 d的番茄灰霉病菌(B.cinerea)制備成d=5 mm的菌餅,將B.cinerea菌餅菌絲面朝下接種在番茄葉片上。以不接種拮抗菌,只接種B.cinerea菌餅作陽性對照,以只接種無菌水不接B.cinerea菌餅的為空白對照,共設3個處理,每處理至少3次重復。

番茄果實上的離體檢測。挑選成熟度、物理狀態(tài)盡量一致的新鮮番茄果實,用無菌水沖洗果實表面后再用75%乙醇棉球?qū)麑嵄砻嫦?待晾干后,先用無菌接種針在每個番茄果實腰周圍等距離刺4個約4 mm(深)×3 mm(寬)的傷口,待傷口晾干后,每個果實上的4個傷口處分別接種10 μL的MH71發(fā)酵液、5倍稀釋發(fā)酵液、50%啶酰菌胺水分散粒劑1 000倍液及清水對照,待發(fā)酵液及處理液被完全吸收后,所有處理均接種10 μL濃度為106個孢子/mL的番茄灰霉病菌孢子懸浮液,以清水處理做空白對照,50%啶酰菌胺水分散粒劑(德國巴斯夫股份有限公司)1 000倍液為化學農(nóng)藥對照。共設4個處理,每處理至少選擇3個番茄果實。

將處理過的番茄葉片和果實均放置在20～22 ℃、晝夜光照、濕度為90%以上的環(huán)境條件下保濕培養(yǎng),一般根據(jù)清水對照的發(fā)病情況,在第5～7天開始調(diào)查,用帶有1 mm2小格的標尺測量病斑的直徑,用病斑的面積計算對番茄灰霉病的防效。計算公式如下：防效=(C-T/C)×100%,其中C為清水對照病斑的平均面積,T為各處理的病斑平均面積。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.5進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,用Duncan’s新復極差多重比較法進行顯著差異性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌MH71生防相關(guān)性狀測定結(jié)果

在檢測的生防相關(guān)性狀中,拮抗菌MH71能夠產(chǎn)生嗜鐵素、蛋白酶和纖維素酶(見圖1),不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和磷酸酯酶。且隨著培養(yǎng)時間延長,產(chǎn)素的有色暈圈或透明圈的直徑也在持續(xù)增加。MH71菌株在含有色氨酸的培養(yǎng)基中產(chǎn)生IAA的量為4.098 μg/mL,在不含有色氨酸的培養(yǎng)基中產(chǎn)生IAA的量為1.559 μg/mL。

2.2 離體生防效果測定結(jié)果

在離體番茄葉片上檢測了拮抗菌MH71對番茄灰霉病的防治效果,在檢測的90片番茄葉片中(30片葉子拮抗菌MH71發(fā)酵液處理后接種番茄灰霉病菌,30片葉子清水處理后接種番茄灰霉病菌,30片葉子只用清水處理),結(jié)果表明,在接種后第5天調(diào)查時,經(jīng)過拮抗菌MH71發(fā)酵液處理的番茄葉片上出現(xiàn)較小的水漬狀病斑(病斑平均直徑在0.3 cm以下)甚至沒有病斑,而對照組葉片發(fā)病嚴重,凡病原菌菌絲觸及的地方葉片表現(xiàn)出皺縮和腐爛的癥狀,病斑平均直徑達1.0 cm以上,表明MH71的發(fā)酵液能夠明顯抑制番茄灰霉病病斑的擴展,對番茄灰霉病葉部防效達到92.8%(表2和圖2)。

圖1 MH71菌株生防相關(guān)性狀檢測結(jié)果(培養(yǎng)72 h)Fig.1 Biocontrol-related traits of strain MH71 (culture for 72 h)

處理Treatment5d時病斑平均面積/cm2Averageareaoflesion5daysaftertreatment防效/%Controlefficiency噴施清水后接種病原菌Inoculationafterwaterspraying0.06b-噴施MH71發(fā)酵液后接種病原菌InoculationaftersprayingwiththefermentationbrothofstrainMH710.83a92.8

1) 表中數(shù)據(jù)為3次重復的平均值,同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

The data in the table are the average of three replicates; values followed by the different letters are significantly different (P<0.05).

圖2 在離體葉片上對番茄灰霉病的防效測定(第5天調(diào)查結(jié)果)Fig.2 The efficacy of fermentation broth of Bacillus amyloliquefaciens strain MH71 in controlling Botrytis cinerea on tomato leaves

在番茄果實上檢測了MH71菌株的發(fā)酵液對番茄灰霉病的防治效果,在檢測的12個番茄果實中,MH71菌株的發(fā)酵液和5倍稀釋發(fā)酵液能夠明顯地抑制番茄灰霉病病斑的擴展,具體見表3和圖3。其中,在接種后的第7天調(diào)查時,MH71菌株的發(fā)酵原液、5倍稀釋發(fā)酵液和50%啶酰菌胺水分散粒劑1 000倍液處理后的番茄均未出現(xiàn)病斑,而清水對照(病斑平均直徑達2.57 cm以上)中在每個番茄的多個接種處出現(xiàn)明顯的病斑和灰霉病菌的霉層。在接種后的第11天調(diào)查時,MH71菌株的發(fā)酵原液、5倍稀釋液和50%啶酰菌胺水分散粒劑1 000倍液處理過的所有番茄仍未出現(xiàn)任何病斑,每個番茄上的接種處已經(jīng)完全皺縮為一個干的小孔,而經(jīng)清水對照處理過的番茄果實上大多接種處的周圍幾乎已經(jīng)完全被濃密灰色的灰霉病菌霉層覆蓋,有的接種處病斑十分明顯且呈水漬狀和凹陷狀態(tài)。由上述結(jié)果可以看出,MH71的發(fā)酵液對灰霉病的發(fā)生和蔓延起到了有效的控制作用,其防治效果等同于目前生產(chǎn)上公認的應用較為廣泛且效果較優(yōu)的化學農(nóng)藥,即巴斯夫公司的50%啶酰菌胺水分散粒劑。

表3 不同處理在番茄果實上對番茄灰霉病的離體防效測定結(jié)果1)

1) 表中數(shù)據(jù)為3次重復的平均值,同列的相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

The data in the table are the average of three replicates; values followed by the same letters are not significantly different (P>0.05).

圖3 MH71菌株發(fā)酵液對番茄灰霉病的防效測定結(jié)果Fig.3 The efficacy of fermentation broth of Bacillus amyloliquefaciens strain MH71 in controlling Botrytis cinerea on tomatoes

2.3 PCR檢測脂肽類抗生素合成相關(guān)基因

利用4對引物,分別對解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)MH71的基因組DNA進行PCR擴增,獲得各目標片段(圖4)。將目標片段分別回收純化后送至公司測序,將測序獲得的部分序列在NCBI上分別進行BLAST同源性分析。比對分析的結(jié)果表明,從解淀粉芽胞桿菌MH71中擴增的fenB基因,經(jīng)測序獲得該部分基因片段序列(GenBank基因登錄號：KJ452559)與Bacillussp.916(WP007408572.1)、B.amyloliquefaciens(AER29830.1, AFP20616.1, ACE68434.1等)的fengycin synthetase B合成酶基因同源性均為98%;擴增的mycB基因部分片段(GenBank基因登錄號：KJ452561)與B.amyloliquefaciensAS43.3(CP003838.1)中的IturinA 合成酶基因ituB同源性為95%,同時與B.amyloliquefaciensFZB42(CP000560.1)中的BmyB合成酶基因bmyB同源性為95%;擴增的ituA部分基因(GenBank基因登錄號：KJ452560)與B.subtilisstrain 916(FJ194462.1)中的bacillorin operon基因同源性為97%,同時與B.amyloliquefaciensYAU B9601-Y2(HE774679.1)中的bacillomycin D 合成酶基因bamA同源性也為97%;擴增的sfp基因(GenBank基因登錄號：KJ452562)與B.amyloliquefaciensstrain 96-79(EU882344.1)的sfp基因同源性為99%,與B.amyloliquefaciensCAU B946(HE617159.1)的sfp基因同源性也為99%。

圖4 PCR檢測脂肽類抗生素基因Fig.4 PCR detection of lipopeptide antibiotics-related genes

3 結(jié)論與討論

通過平板產(chǎn)素或產(chǎn)酶的活性定性測定,結(jié)果表明解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)MH71能夠分泌嗜鐵素、蛋白酶、纖維素酶和IAA,不產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和磷酸酯酶。生防菌MH71具有嗜鐵菌的功能,嗜鐵素(siderophore)是由嗜鐵菌產(chǎn)生的一種小分子量、能特異螯合Fe3+的一種螯合因子,已有許多研究報道利用嗜鐵菌產(chǎn)生的嗜鐵素來防治植物病害和促進植物生長[15-19];MH71菌株還具有較強的分泌蛋白酶和纖維素酶的能力,辛雅芬等[20]指出,大量證據(jù)已表明許多由真菌和細菌產(chǎn)生的胞外酶都參與了微生物在植物病害生物防治的生防活動,為了獲得有效的生物防治效果,通常需要酶和其他次生代謝物,尤其是抗生素的協(xié)同作用。這些酶除了在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應用,在工業(yè)、醫(yī)藥、食品、飼料等多個行業(yè)都有應用,這也可以說明MH71菌株具有在多個研究領(lǐng)域開發(fā)的潛力。而關(guān)于定量檢測MH71菌株的嗜鐵素、蛋白酶和纖維素酶的產(chǎn)量及其各自在抑菌作用中發(fā)揮了多大的作用,尚需進一步研究。而且生防菌MH71在有無色氨酸的培養(yǎng)基中都能檢測到IAA的產(chǎn)生,且在有色氨酸的培養(yǎng)基中產(chǎn)量比無色氨酸培養(yǎng)基中產(chǎn)量提高了近3倍,IAA是通過促進植物根系的生長從而提高植物生長量的[12],這需要進一步研究來驗證生防菌MH71所產(chǎn)IAA對植物是否有真正的促生長作用。

解淀粉芽胞桿菌MH71的發(fā)酵液在離體番茄葉片和果實上對番茄灰霉病均有較明顯的抑制效果,表明該菌在番茄灰霉病的防治方面具有較大生防潛力。國外已有解淀粉芽胞桿菌的成熟產(chǎn)品用于植物病害的生防上,如由美國Taensa公司開發(fā)已商品化的B.amyloliquefaciensFZBZ24,施用于溫室或室內(nèi)栽培樹苗、灌木和裝飾植物根部可防治Fusarium和Rizoctonia引起的根腐病[21]。目前國內(nèi)利用解淀粉芽胞桿菌來防治番茄灰霉病有較多報道,但大多也是處于實驗室研究階段,如錢英等[22]報道解淀粉芽胞桿菌BW-13的發(fā)酵液對啤酒酵母和植物病原真菌灰霉菌具有顯著的平板抑菌活性。宗志友等[23]報道解淀粉芽胞桿菌IMAUB1034活性物質(zhì)的理化性質(zhì)和盆栽試驗中對甜瓜疫霉菌引起的病害的防治效果進行研究,其中該菌發(fā)酵液能夠明顯抑制灰葡萄孢的生長。而對于解淀粉芽胞桿菌MH71在溫室和田間對番茄灰霉病穩(wěn)定的防治效果以及對其發(fā)酵工藝、制劑生產(chǎn)及應用方式等多個方面尚需進行更為深入的研究。

利用抗生素合成基因的特異性引物PCR擴增目標菌株的基因組DNA,可以快速明確該菌株是否含有產(chǎn)生脂肽類抗生素的基因,基因克隆測序的結(jié)果可以為后期研究脂肽類抗生素提供重要的參考依據(jù)。根據(jù)本研究結(jié)果推測,解淀粉芽胞桿菌MH71的基因組中可能存在豐原素、桿菌抗霉素D、伊枯草菌素A和表面活性素的代謝合成操縱子序列,該菌株可能代謝產(chǎn)生上述幾類脂肽類抗生素。這對后續(xù)的活性物質(zhì)分離、純化鑒定及作用機制等的相關(guān)研究提供了重要數(shù)據(jù)。而解淀粉芽胞桿菌MH71對灰霉病菌的生防抑制作用中,對于其分泌的嗜鐵素、各種酶類及脂肽類抗生素,是其中的某一種類單獨在起作用,抑或是多個種類在協(xié)同起作用,這需要進一步設計試驗來驗證。

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(責任編輯：田 喆)

Detection of the genes encoding lipopeptide antibiotics and biocontrol activity ofBacillusamyloliquefaciensMH71

Lu Caige1, Zhang Dianpeng1, Liu Ting1, Dong Hongping1, Wang Junli2, Liu Weicheng1

(1. Institute of Plant and Environmental Protection, Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Beijing 100097, China; 2.College of Agriculture, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

An antagonisticBacillusamyloliquefaciensMH71, originally isolated from the permafrost soil samples collected from Mohe, showed a strong biocontrol activity against a large number of phytopathogenic fungi and bacteria. In this study, the biocontrol activity ofB.amyloliquefaciensMH71 was characterized and the effects of the strain in controlling grey mold on tomato leaves and fruits were examined by treating them with the fermentation broth of MH71. Moreover, the lipopeptide synthesis-related genes were detected by using specific primers. The results showed that the strain had the capability of producing siderophore, protease, cellulase and IAA, but not phosphatase and chitinase. Biocontrol tests indicated that, compared with water-control, the biocontrol efficacy of the fermentation broth of strain MH71 was 100% on tomato fruits 7 days and 11 days after inoculation, the same as that of 50% boscalid chemical control, but the biocontrol efficacy of the fermentation broth of strain MH71 was 92.8% on tomato leaves 5 days after inoculation. The lipopeptide synthase genesfenB,mycB,ituA,sfpwere successfully amplified from genomic DNA of the strain MH71. These results may provide an important reference for further evaluating the biocontrol potential ofB.amyloliquefaciensMH71, and for guiding the separation and identification of the active substances from MH71.

Bacillusamyloliquefaciens;Botrytiscinerea; lipopeptide antibiotics; biocontrol activity

2014-03-26

2014-07-21

北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所創(chuàng)新基金(CXJJ2012A04)；北京市科技計劃課題(Z121100001212002)；北京市農(nóng)林科學院科技創(chuàng)新專項(KJCX20140101)；北京市農(nóng)林科學院科技創(chuàng)新基金(CXJJ2013-13)

S476

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.003

* 通信作者 E-mail: liuwich@163.com