梁 娟，俞金龍，2，巫水欽，吳佳驊，李江渝，熊 琴，俞 洋

(1.浙江美之奧種業(yè)有限公司,浙江嘉興 314000;2.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江金華 321000)

甘藍(lán)DH系構(gòu)建技術(shù)體系的建立

梁 娟1，俞金龍1，2，巫水欽1，吳佳驊1，李江渝1，熊 琴1，俞 洋1

(1.浙江美之奧種業(yè)有限公司,浙江嘉興 314000;2.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江金華 321000)

以26份不同葉球類型及熟性的雜種1代及自交2代甘藍(lán)為材料,探討了花蕾長(zhǎng)度、甘藍(lán)類型、供體植株生長(zhǎng)狀況、供體植株花期等因素對(duì)甘藍(lán)小孢子胚胎發(fā)生的影響,研究了DH植株的田間移栽方案,為建立高效、完善的結(jié)球甘藍(lán)DH技術(shù)體系提供依據(jù)。

甘藍(lán);DH系;小孢子;胚狀體

文獻(xiàn)著錄格式:梁娟,俞金龍,巫水欽,等.甘藍(lán)DH系構(gòu)建技術(shù)體系的建立[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,56(5):669-674.

DOI 10.16178/j.issn.0528-9017.20150533

甘藍(lán)(Brassica oleracea L.var.capitata L.)原產(chǎn)于地中海沿岸,為十字花科蕓薹屬二年生異花授粉作物,其雜種優(yōu)勢(shì)十分明顯,雜交種在國(guó)內(nèi)外已普遍應(yīng)用于生產(chǎn)。近年來(lái),隨著小孢子培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展,應(yīng)用花粉粒培養(yǎng)獲得純合二倍體分離群體即雙單倍體(DH)成為可能[1]。甘藍(lán)雜種1代的親本選育采用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù),比傳統(tǒng)的自交純化方法省時(shí)3～5年,顯著提高了育種效率,縮短了育種周期[2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)上已取得了一定進(jìn)展[3-7]。但小孢子培養(yǎng)的胚胎發(fā)生頻率、基因型的反應(yīng)范圍仍存在非常大的差異,尤其在目標(biāo)基因型中難以獲得胚狀體,這些問題限制了小孢子培養(yǎng)在甘藍(lán)遺傳育種和基礎(chǔ)研究中的進(jìn)一步應(yīng)用。本研究以26個(gè)不同品種的甘藍(lán)為試材,對(duì)甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)過程中影響胚狀體產(chǎn)生的幾個(gè)關(guān)鍵因素及田間移栽配套技術(shù)進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍(lán)為浙江美之奧種業(yè)有限公司甘藍(lán)育種組選育或引進(jìn)的國(guó)內(nèi)外不同葉球類型及熟性的雜種1代及自交2代,共26個(gè)品種,均種植于嘉興美奧農(nóng)場(chǎng)基地。于2013年8月播種,9月定植于大田, 12月割球,然后每個(gè)品種各選5株移植于營(yíng)養(yǎng)缽,置于溫室大棚。分別于2014年3月下旬至5月下旬進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 花蕾選取

供試植株抽薹開花后,于晴天上午9:00～11: 00選取主花序和分枝上外形飽滿、大小不同的花蕾作為游離小孢子的供體花蕾,裝入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室,于4℃保存?zhèn)溆?。測(cè)量花蕾長(zhǎng)度,并將長(zhǎng)度一致的花蕾歸類。各類長(zhǎng)度花蕾隨機(jī)選取3～5個(gè)壓片,顯微鏡下觀察該花蕾小孢子的發(fā)育時(shí)期,以單核靠邊期的長(zhǎng)度花蕾為標(biāo)準(zhǔn)選取花蕾游離小孢子。

1.2.2 小孢子游離和培養(yǎng)

將花蕾用75%的酒精消毒30～40 s,然后用2%NaClO消毒15 min(可在搖床上振蕩以充分消毒),最后用無(wú)菌水清洗3次,每次5 min。

將滅過菌的花蕾放置于50 mL離心管中,加入1～2滴B5液體培養(yǎng)液,用玻璃棒輕輕擠壓使花粉散出,再加入10 mL B5溶液,倒入過濾器過濾;花粉濾液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管(用封口膜封口), 800 r·min-1,離心5 min,棄去上清液,加入B5抽提液再次懸浮離心,重復(fù)3次,最后一次用NLN-13培養(yǎng)液清洗。

離心結(jié)束,加入5 mL NLN-13培養(yǎng)液制成孢子懸浮液,調(diào)整濃度至1.0×105mL-1,隨后再把小孢子懸浮液分裝于直徑60 mm的培養(yǎng)皿中,每皿3 mL,封口膜膜封口,置于32℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)1～2 d,然后溫度調(diào)至25℃繼續(xù)暗培養(yǎng),直至形成肉眼可見胚。

1.2.3 胚狀體植株再生

出胚培養(yǎng)皿移至恒溫?fù)u床,50 r·min-1, 25℃繼續(xù)暗培養(yǎng)。暗培養(yǎng)25 d左右,將獲得的子葉形胚移入固體培養(yǎng)基,在20℃,光照周期16 h光照/8 h黑暗,光照度2 000 lx條件下進(jìn)行再生苗的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.4 再生植株倍性鑒定和移植

利用流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6)對(duì)獲得的再生苗進(jìn)行倍性檢測(cè)。染色體加倍植株一般先從組培瓶移栽到裝有土壤和蛭石或泥炭的缽中煉苗1～2周,再移植到大田。本研究采用3種定植方式,以便摸索出最適宜的DH植株田間移栽技術(shù)。3種種植方式分別為(1)直接定植于露地;(2)鋪設(shè)地膜,定植于塑料大棚;(3)移植到50 cm×50 cm營(yíng)養(yǎng)缽中,放置于塑料大棚。

2 結(jié)果與分析

2.1 花蕾長(zhǎng)度對(duì)小孢子出胚率的影響

前期花蕾染色結(jié)果表明,大部分品種3～6 mm的花蕾均含有不同比例的單核靠邊期小孢子,因此本研究將采集的花蕾混合,按照長(zhǎng)度大小歸類,分為3個(gè)等級(jí):(1)3.0～3.5 mm,(2)3.6～4.5 mm,(3)4.6～5.5 mm(圖1和2)。鏡檢和DAPI染色觀察,分別抽提小孢子進(jìn)行離體培養(yǎng)。

圖1 不同大小的花蕾進(jìn)行歸類分級(jí)

圖2 不同長(zhǎng)度花蕾的小孢子發(fā)育情況（10倍）

32℃熱激培養(yǎng)24 h和48 h后分別觀察小孢子變化,然后25℃繼續(xù)暗培養(yǎng)觀察是否有可見的顆粒狀胚形成。不同長(zhǎng)度花蕾游離小孢子培養(yǎng)結(jié)果表明, 4.6～5.5 mm大小的花蕾無(wú)論是32℃熱激培養(yǎng)24 h還是48 h,小孢子均可見到明顯的膨大(圖3),且在25℃暗培養(yǎng)5 d時(shí)就觀察到第1次分裂(圖4), 16 d時(shí)已形成肉眼可見胚狀體,而3.0～3.5 mm和3.6～4.5 mm的花蕾在熱激階段就遇到阻礙,最終沒有獲得胚狀體(圖5),這可能和不同長(zhǎng)度花蕾小孢子的發(fā)育階段、比例、數(shù)量有關(guān)系,4.6～5.5 mm長(zhǎng)度的花蕾小孢子處在單核中期-雙核早期的比例較大且發(fā)育一致性較好(圖6和7)。

圖3 32℃熱激培養(yǎng)24 h和48 h后小孢子形態(tài)變化

圖4 25℃暗培養(yǎng)5 d各處理的小孢子形態(tài)變化

圖5 25℃暗培養(yǎng)16 d各處理的小孢子形態(tài)變化

圖6 4.6～5.5 mm大小的花蕾鏡檢和DAPI染色觀察結(jié)果（10倍）

圖7 4.6～5.5 mm大小的花蕾所含不同發(fā)育時(shí)期的小孢子（40倍）

2.2 不同品種甘藍(lán)的小孢子胚胎發(fā)生能力比較

從表1可以看出,供試的26份材料中,共有12個(gè)基因型產(chǎn)生了胚狀體,出胚率為46%,且在這12個(gè)基因型中,產(chǎn)胚率存在很大差異。在不同葉球類型甘藍(lán)中,17份圓球類型有8份出胚,出胚概率為47%,每蕾出胚范圍在0.41～4.20個(gè); 9份扁球類型中4份獲得胚狀體,出胚概率為44%,每蕾出胚范圍在0.10～0.50。由此可知,不同葉球類型的甘藍(lán)小孢子胚胎發(fā)生能力無(wú)明顯差異。此外,12份早熟甘藍(lán)的出胚率為50%,且每蕾出胚率大于1個(gè)的易出胚甘藍(lán)均為中早熟類型甘藍(lán);11份晚熟甘藍(lán)的出胚率為45%,與早熟甘藍(lán)相比無(wú)明顯差異,但每蕾成胚率較低,為0.10～0.50,推測(cè)甘藍(lán)的熟性及栽培季節(jié)與小孢子胚發(fā)生能力存在一定的相關(guān)性。

表1 不同類型甘藍(lán)誘導(dǎo)形成胚狀體結(jié)果

2.3 生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)小孢子胚胎發(fā)生能力影響

從3月21日供體植株進(jìn)入初花期開始采樣進(jìn)行游離小孢子試驗(yàn),至5月23日結(jié)束,共取樣32批次,其中出胚的花蕾采樣日期在4月7日至5月13日,出胚材料采樣日期及胚狀體誘導(dǎo)情況如表2所示。從4月初至5月中旬日平均氣溫基本維持在20～25℃,之后隨著天氣轉(zhuǎn)暖,氣溫逐漸升高達(dá)到30℃左右,這可能對(duì)小孢子成胚能力產(chǎn)生一定影響。此外,5月10日以后供體植株陸續(xù)進(jìn)入末花期,此時(shí)小孢子的活力逐漸衰退,且發(fā)育時(shí)期不同步。出胚率最高的品種杰出(F2)采樣日期在5月8日,小孢子培養(yǎng)獲得的胚狀體和胚狀體誘導(dǎo)再生情況見圖8。

表2 已出胚材料采樣日期及胚狀體誘導(dǎo)情況

2.4 再生植株倍性檢測(cè)

成活胚狀體轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行植株再生培養(yǎng),共獲得再生植株233株,采用流式細(xì)胞儀測(cè)定植株染色體是否加倍。結(jié)果表明,共124株單倍體,87株二倍體,17株四倍體以及5株嵌合體,加倍率達(dá)到44.6%(表3)。推測(cè)愈傷組織誘導(dǎo)成苗階段發(fā)生了染色體自然加倍,且加倍頻率較高。

表3 再生植株倍性檢測(cè)

2.5 再生植株的田間移植

因移植后期遇大幅度降溫,3種定植方法中,方法(1)的成活率只有91%,方法(2)和(3)移栽成活率均達(dá)到100%(圖9)。從成本角度考慮,方法(2)比(3)節(jié)省人力、財(cái)力,但方法(3)在溫肥水分管理上更易靈活操作。

圖8 杰出F2小孢子培養(yǎng)獲得的胚狀體（A）和胚狀體誘導(dǎo)再生（B）

圖9 DH植株的3種不同移栽方式

3 小結(jié)與討論

本研究對(duì)結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)中的幾個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行了初步研究,建立了一套切實(shí)可行的甘藍(lán)DH系構(gòu)建技術(shù)體系。

甘藍(lán)小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)中小孢子所處發(fā)育時(shí)期至關(guān)重要,處于單核靠邊期的小孢子誘導(dǎo)成胚概率較高[8-9]。研究結(jié)果表明,4.6～5.5 mm長(zhǎng)度的花蕾小孢子處在單核靠邊期的比例較大且發(fā)育一致性較好,熱激后無(wú)論是膨大數(shù)量還是分裂的細(xì)胞數(shù)目都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他長(zhǎng)度的花蕾。不同葉球類型及熟性的甘藍(lán)品種小孢子胚發(fā)生能力也有一定差異,可能是受供體植株基因型的影響。

供體植株生長(zhǎng)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件也對(duì)小孢子培養(yǎng)結(jié)果有較大影響。張鳳蘭等[10]研究表明,在長(zhǎng)日照(14～18 h)和15～20℃條件下培養(yǎng)的白菜小孢子,胚狀體發(fā)生數(shù)量及植株再生率高于短日照(12 h)和較高溫度(25℃)培養(yǎng)的白菜小孢子。方淑桂等[11]認(rèn)為氣溫對(duì)大白菜小孢子有明顯影響,供體植株適宜在10～25℃生長(zhǎng),最高氣溫超過28℃時(shí)小孢子誘導(dǎo)率大大降低。本研究中也觀察到類似現(xiàn)象,且能夠產(chǎn)胚的花蕾多處于初花期-盛花期,這可能與此期的供體植株?duì)I養(yǎng)狀況有關(guān),推測(cè)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期的光周期、溫度和營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)小孢子全能性有較大影響。

甘藍(lán)胚狀體再生培養(yǎng)中發(fā)生的高頻自然加倍現(xiàn)象與Chen等研究結(jié)果一致[12],自然加倍省去了繁瑣的人工加倍工作量,為純和二倍體植株的創(chuàng)制提供便利。后續(xù)研究可嘗試通過在小孢子暗培養(yǎng)階段添加秋水仙素的方法進(jìn)一步提高加倍率[13]。

甘藍(lán)胚植株再生率不同,同時(shí)反復(fù)繼代培養(yǎng)復(fù)壯造成DH植株從9-12月分多批從培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)出移栽。針對(duì)不同生長(zhǎng)情況的植株,可采用不同移栽方式來(lái)提高組培苗移植成活率并確保植株正常開花結(jié)實(shí)。應(yīng)季移植的植株,可采用常規(guī)大棚覆膜定植;錯(cuò)過生長(zhǎng)季節(jié)的組培苗可利用營(yíng)養(yǎng)缽種植,必要時(shí)轉(zhuǎn)入光溫水氣均自動(dòng)控制的人工氣候室中進(jìn)行低溫春化或越夏培養(yǎng)。

[1] 趙衛(wèi)國(guó),王灝,趙小萍,等.甘藍(lán)型油菜DH系主要性狀及SSR分子標(biāo)記分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,22 (11):32-36.

[2] 楊麗梅,方智遠(yuǎn),劉玉梅,等.利用小孢子培養(yǎng)選育甘藍(lán)自交系[J].中國(guó)蔬菜,2003(6):31-32.

[3] Duijs J G,Voorrips R E,Visser D L,et al.Microspore culture is successful in most crop types of Brassica oleracea L.[J]. Euphytica,1992(60):45-55.

[4] Dias J C S.Effect of activated charcoal on Brassica oleracea microspore culture embryogenesis[J].Euphytica,1999,108 (1):65-69.

[5] 陳文輝,方淑桂,曾小玲,等.甘藍(lán)和青花菜雜種小孢子培養(yǎng)[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),2006,14(4): 321-326.

[6] 方淑桂,陳文輝,曾小玲,等.結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)及植株再生[J].園藝學(xué)報(bào),2006,33(1):158-160.

[7] 方淑桂,曾小玲,朱朝輝,等.結(jié)球甘藍(lán)游離小孢子胚胎發(fā)生[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào),2005,23(6):530-534.

[8] Hansen M.ABA treatment and desiccation of microsporederived embryos of cabbage(Brassica oleracea ssp.capitata L.)improves plantdevelopment[J].JournalofPlant Physiology,2000,156(2):164-167.

[9] Petrova S,Antonova G.In vitro androgensis of Brassica oleracea var.capitata L.[J].Cruciferae Newsletter,1995(17):38.

[10] 張鳳蘭,釘貫靖久,吉川宏昭.環(huán)境條件對(duì)白菜小孢子培養(yǎng)的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),1994,9(1):95-100.

[11] 方淑桂,陳文輝,曾小玲,等.大白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究初報(bào)[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2003,18(2): 123-126.

[12] Chen Z Z,Snyder S,Fan Z G,et al.Efficient production of doubled haploid plants through chromosome doubling of isolated microspores in Brassica napus[J].Plant Breeding,2006,113 (3):217-221.

[13] 石淑穩(wěn),周永明,吳江生,等.甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)、染色體加倍、試管苗繼代越夏和田間移栽配套技術(shù)的研究及其在油菜育種中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2001,17 (2):57-59.

(責(zé)任編輯：侯春曉)

S 635.1

A

0528-9017(2015)05-0669-05

2015-02-11

梁 娟(1986-),女,安徽蚌埠人,碩士,主要從事甘藍(lán)育種工作。E-mail:liangjuan7674@163.com。