董志歡，李彤，張磊，楊帆

專題研究·代謝病

大鼠急性心肌梗死后期血清代謝輪廓研究

董志歡1，李彤2△，張磊2，楊帆1

目的建立急性心肌梗死（AMI）大鼠血清代謝輪廓模型，探尋對AMI預(yù)后及并發(fā)癥具有臨床治療價值的特征代謝物。方法選取健康雄性Wistar大鼠20只，隨機平均分為對照組和AMI 1周組。AMI 1周組進行冠狀動脈前降支結(jié)扎，建立AMI模型，1周后心臟取血處死。利用代謝組學(xué)研究平臺對大鼠的血液樣本進行代謝輪廓分析，建立大鼠AMI后血液的正交偏最小二乘判別模型及主成分分析模型，結(jié)合SPSS 19.0軟件的數(shù)據(jù)處理最終得到特征代謝產(chǎn)物。結(jié)果成功建立了主成分分析模型及正交偏最小二乘判別模型，同時從模型中篩選并鑒定了27種在AMI 1周組與對照組具有差異的特征代謝物，在這27種特征代謝物中溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺等差異明顯。結(jié)論構(gòu)建的代謝輪廓模型很好地擬合了AMI后期大鼠機體的代謝紊亂狀態(tài)，篩選出的特征代謝產(chǎn)物可為該疾病治療以及并發(fā)癥的預(yù)防等提供參考和幫助。

心肌梗死；大鼠,Wistar；色譜法,高壓液相；質(zhì)譜分析法；血清代謝組學(xué)

急性心肌梗死（AMI）是由于冠脈的某種原因造成心肌的急性缺血壞死，因其發(fā)病突然，病情急劇，往往造成嚴(yán)重的后果。近些年來伴隨著人們生活水平的提高和生活方式的轉(zhuǎn)變，我國AMI發(fā)病率逐漸升高［1］，隨著對AMI研究的深入和醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，雖然在一定程度上降低了AMI的死亡率，但其后期的并發(fā)癥給患者及社會造成較大的負(fù)擔(dān)。代謝組學(xué)是一種定量描述生物體內(nèi)動態(tài)參數(shù)變化的一門新的組學(xué)技術(shù)，能反映機體疾病的動態(tài)變化，且在肝臟等臨床疾病的動態(tài)研究中已經(jīng)取得了較大的進展［2-4］。本研究利用代謝組學(xué)的研究平臺構(gòu)建疾病區(qū)分模型，篩選AMI后期特征代謝產(chǎn)物，為AMI預(yù)后期并發(fā)癥的早期預(yù)防和并發(fā)癥的治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料正常雄性Wistar大鼠20只，SPF級，體質(zhì)量

225～250 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司。甲酸、乙腈、甲醇購自德國Merck KGaA公司，均為HPLC純；vevo 2100 view高分辨率小動物超聲系統(tǒng)（英國sonic公司）；低溫高速離心機Multifoge X1R型、Accela超高效液相色譜儀、LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組將大鼠按隨機數(shù)字表法分為AMI 1周組、對照組，各10只。

1.2.2 模型制備參照Watson等［5-6］的方法并加以改進。大鼠禁食10 h后，稱質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉（100 μL/100 g體質(zhì)量）腹腔注射麻醉，然后進行開胸手術(shù)，輔助通氣，快速進行冠狀動脈前降支的結(jié)扎，以結(jié)扎部位以下心肌發(fā)白、顏色變淺為手術(shù)成功指征，最后縫合關(guān)胸。術(shù)后進行超聲心動檢查，觀察大鼠心梗狀況，正常組心臟前后壁收縮正常，心梗組前壁收縮明顯減弱甚至消失，結(jié)合射血分?jǐn)?shù)等作為入選標(biāo)準(zhǔn)，見圖1。排除術(shù)中死亡及術(shù)后感染因素，最終篩選1周生存期心梗模型大鼠6只作為研究對象，同期飼養(yǎng)健康組大鼠排除意外死亡及感染等因素，選取體質(zhì)量與心梗模型大鼠接近的健康大鼠6只作為對照。

1.2.3 標(biāo)本的采集和預(yù)處理AMI 1周組術(shù)后1周處死，采集血液，靜置50 min后離心提取血清，將上清液中加入3倍體積的甲醇沉淀蛋白，置10 min后，4℃10 000 r/min，離心30 min，將得到的上清液真空離心蒸干得干粉，然后以等樣本體積的水與乙腈混合溶液（5%乙腈）重新溶解，上樣。

1.2.4 樣本分析參照本中心張立等［7］處理方法：質(zhì)譜系統(tǒng)為LTQ Orbitrap XL雜交質(zhì)譜，結(jié)合正離子掃描模式，離子源電壓4.5 kV，毛細(xì)管電壓30 V，錐孔電壓150 V，去溶劑化溫度設(shè)定為350℃，輔氣流速5 arb（99.999%氮氣），鞘氣流速為30 arb（99.999%氮氣）。數(shù)據(jù)采集貫穿20 min的色譜洗脫，質(zhì)譜分辨率設(shè)定為100 000，采集范圍在質(zhì)核比（m/z）50～1 000。二級質(zhì)譜檢測采用碰撞誘導(dǎo)解離模式（CID），碰撞氣為高純氦氣（99.999 9%），能量設(shè)定在35（標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量）。液相色譜系統(tǒng)為Accela超高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Thermo Hypersil GOLD反相C18柱（2.1 mm i.d.×50 mm. 1.9 μm）。色譜洗脫方式為二元溶劑梯度洗脫，流動相B為0.1%甲酸乙腈混合溶液，流動相A為0.1%甲酸水溶液，色譜洗脫過程為15 min，進樣量為10 μL，自動進樣器溫度設(shè)定在4℃，進樣后流動相流速設(shè)定200 μL/min，色譜柱溫設(shè)定在20℃，起始梯度為5%，流動相B維持2.5 min，從2.5 min至8.5 min將流動相B線性增至95%，維持此梯度3 min后迅速將其降至5%，此后維持該梯度組成3.5 min以平衡色譜柱。

1.2.5 數(shù)據(jù)預(yù)處理將得到的數(shù)據(jù)輸入MZmine 2.0［8］軟件進行數(shù)據(jù)前處理，提取離子色譜峰強度信噪比S/N＞30，m/z值偏差不超過±0.02的方法進行峰的識別等預(yù)處理。以SIM?CA-P+12.0.1.0［9］進行數(shù)據(jù)分析。通過構(gòu)建主成分分析（PCA）和具有監(jiān)督模式的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型［10］，初步篩選出具有潛在的可能性的產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)輸入SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行兩個獨立樣本的非參數(shù)檢驗分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig.1Cardiac echocardiography of rats圖1 超聲心動圖

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)的總離子流圖和質(zhì)控分析以AMI和正常血清樣本為依托，結(jié)合超高效液相色譜與質(zhì)譜連用系統(tǒng)平臺成功得到標(biāo)本的總離子流圖（TIC），見圖2。經(jīng)過MZmine軟件處理AMI1周組與對照組血清標(biāo)本后，共提取出442個代謝產(chǎn)物。

實驗過程中通過質(zhì)控液在系統(tǒng)中的具體表現(xiàn)評估超高效液相色譜與質(zhì)譜連用系統(tǒng)的穩(wěn)定性［11］，對實驗過程中15個質(zhì)控溶液的數(shù)據(jù)進行主成分分析后得到1個擁有2個主成分的PCA模型：模型參數(shù)為R2X=43.3%，Q2=18.8%，其在上樣順序（Num）及第一主成分（t［1］）上的打分圖，見圖3?？梢钥闯鱿?/p>

統(tǒng)通過前8個逐漸達到平衡，后7個樣本穿插在12個樣本中，結(jié)果沒有出現(xiàn)界外值，可見系統(tǒng)在整個實驗過程中是穩(wěn)定的。根據(jù)文獻提出的超高效液相色譜與質(zhì)譜連用系統(tǒng)平臺可重復(fù)性的合格標(biāo)準(zhǔn)［12］，本實驗穿插于15個樣本分析過程中的質(zhì)控樣本全部合格，可靠的離子峰分布在81.2%到95.3%之間，合格質(zhì)控品比例為100%，可以認(rèn)為本批樣品分析結(jié)果可靠。

2.2 代謝輪廓對疾病的區(qū)分能力將進行預(yù)處理后的數(shù)據(jù)結(jié)果輸入SIMCA軟件中建立PCA模型，該模型具有2個主成分，模型參數(shù)為R2X=55.7%，Q2=27.1%。其在第一（t［1］）第二（t［2］）主成分上的打分圖顯示，該模型在第一主成分上（x軸方向）具有一定的區(qū)分聚類趨勢，且模型沒有界外值出現(xiàn)，表明儀器系統(tǒng)在分析過程中能夠保持穩(wěn)定，無偏倚性，見圖4A。同時構(gòu)建了OPLS-DA模型，該模型擁有1個預(yù)測主成分及8個正交主成分，模型參數(shù)為R2X=97.2%，R2Y=100%，Q2=97%，該模型在第一預(yù)測主成分（t［1］）與第一正交主成分（t0［1］）上的打分圖，見圖4B。其在第一預(yù)測主成分方向具有很好的區(qū)分聚類趨勢，該模型僅有的1個預(yù)測主成分能夠代表左冠狀動脈前降支血供喪失，導(dǎo)致心肌梗死所造成大鼠預(yù)后期血清代謝輪廓改變。

Fig.2Total ion chromatogram of serum metabolic profile圖2 總離子流圖

Fig.3Score plot of the principal component（t［1］）in quality control principal component analysis.（Each point represents a quality control sample.）圖3 質(zhì)控溶液PCA模型第一主成分（t［1］）的打分圖（每個點代表1個樣本）

Fig.4The metabolic profile of serum samples圖4 血清樣本代謝輪廓模型

2.3 特征離子的篩選和鑒定首先根據(jù)構(gòu)建的OPLS-DA模型中各代謝離子的影響權(quán)重（VIP）值篩選特征離子，選取VIP＞1的離子中排除置信區(qū)間和系數(shù)圖上包含零的變量，同時結(jié)合載荷圖篩選出同時具有較高的可靠性和較大的變化程度的離子，利用SPSS 19.0軟件進行非參數(shù)檢驗，最后得到63個

特征代謝產(chǎn)物。

部分特征代謝物經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品比對得到鑒定結(jié)果，無標(biāo)準(zhǔn)品進行比對的代謝物鑒定參照文獻報道的方法［13-14］，首先利用差異代謝物精確m/z值查找人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB,http://hmdb.ca/），按照m/z數(shù)值的偏差不超過0.01的原則，結(jié)合準(zhǔn)確的電荷數(shù)與相符的電離方式對檢索的結(jié)果進行校驗。同時將得到的二級質(zhì)譜圖與Thermo Fisher數(shù)據(jù)庫Mass Fronti?cr 6.0得到的HMDB鑒定的結(jié)果進行比對，Ion trap質(zhì)譜CID模式下產(chǎn)生的碎片與理論碎片比對不超過0.2，理論碎片應(yīng)與特征離子的三強峰匹配符合。而且80%的二級質(zhì)譜碎片峰能夠覆蓋特征離子。有鑒定結(jié)果的特征代謝物共計27個，且在2組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

Tab.1The screened results of significant metabolites表1 特征代謝物鑒定結(jié)果

3 討論

本研究成功構(gòu)建了AMI大鼠預(yù)后生存模型，并對篩選出的特征代謝物進行分析，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)主要與脂類、氨基酸類等代謝有關(guān)，特別是與細(xì)胞膜的代謝關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示7種溶血磷脂酰膽堿（LPC）類物質(zhì)與對照組比較呈明顯增高趨勢，該類物質(zhì)主要是與細(xì)胞膜的水解代謝有關(guān)，在正常的血液中很少，但是據(jù)文獻報道其在心肌組織缺血、缺氧時水平會明顯增加［15］，LPC在血液中相對于對照組增高明顯，應(yīng)該與AMI預(yù)后期心肌細(xì)胞壞死導(dǎo)致細(xì)胞膜水解破壞后大量釋放于血液中有關(guān)。LPC水平的增高會給機體帶來巨大的危害，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)LPC參與心血管內(nèi)皮的損傷以及炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致血管硬化［16］。大量的LPC儲存在體內(nèi)還會引起心肌細(xì)胞膜的電信號紊亂，引發(fā)嚴(yán)重的心律失常，進而影響心肌的收縮功能［17］，臨床表現(xiàn)為AMI患病期間常伴隨不同程度的心電生理信號改變，進而發(fā)生室速及室顫等高危癥狀，因此提示臨床工作者應(yīng)將LPC作為心梗疾病不良預(yù)后結(jié)果的監(jiān)測指標(biāo)。

溶血磷脂酸（LPA）類物質(zhì)與多種心血管疾病有關(guān)［18］，其水平高低和LPC有直接的關(guān)系。有文獻報道LPC在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化成LPA，并且LPA可以在一定程度上反映機體患血栓性疾病的風(fēng)險［19］。本研究顯示心梗1周組LPA較對照組大量增高，提示存在血栓的風(fēng)險，與臨床上AMI患者后期再次發(fā)生各種血栓事件相符，LPA可以作為AMI患者二次血栓的風(fēng)險因子。

溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）是磷脂酰乙醇胺（PE）的代謝產(chǎn)物之一，主要通過磷脂酶A2水解PE而產(chǎn)生［20］。在正常情況下體內(nèi)水平較低，本研究顯示LPE水平的大量增加應(yīng)與AMI過程中長時間缺血缺氧致細(xì)胞代謝紊亂相關(guān)。LPE還會影響細(xì)胞間信號傳導(dǎo)，特別是鈣離子通道［21］，進一步影響心肌的收縮功能。

除此之外，值得關(guān)注的是脯氨酰-酪氨酸、L-苯丙氨酸、腦酮酸、山崳酸、1-溶血-2-花生四烯酰磷脂、脫氧腺苷等特征代謝物在心梗1周組相對于對照組呈顯著增高趨勢，這些變化主要反映AMI大鼠氨基酸、脂類、腺苷等代謝紊亂。心梗后心肌組織中

存在超負(fù)荷的氨基酸代謝［6］，心梗發(fā)生初期氨基酸類的代謝紊亂應(yīng)該引起臨床重視。脫氧腺苷是嘌呤代謝產(chǎn)物的一種，與機體炎癥反應(yīng)相關(guān)，其水平升高會使心?；颊卟l(fā)感染的概率增大［22］，對此類產(chǎn)物進行臨床監(jiān)測可以為AMI的診斷與后期并發(fā)癥防治提供幫助。

綜上所述，對于AMI血清代謝輪廓的研究并對特征代謝物代謝途徑進行分析，可為臨床改善AMI預(yù)后及并發(fā)癥防治提供新的思路。

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（2015-03-30收稿 2015-05-07修回）

（本文編輯 李國琪）

Investigation of serum metabolic profiling in late-stage of acute myocardium infarction in rats

DONG Zhihuan1,LI Tong2△,ZHANG Lei2,YANG Fan1
1 The Third Central Clinical College of Tianjin Medical University，Tianjin 300170，China；2 Tianjin Third Central Hospital△

ObjectiveA serum metabolic profiling in acute myocardial infarction（AMI）rat was established to screen potential metabolic markers of AMI prognosis and complication.MethodsMale Wistar rats（n=20）were divided randomly into AMI 1 week group and control group.Anterior descending coronary was ligated in rats in AMI 1 week group to establish AMI model.After one week,these rats were sacrificed and the blood was collected from heart.And metabolomics platform was used to analyze serum metabolic profile.After PCA（principal component analysis）and OPLS-DA（Orthogonal partial least squares-Discriminant Analysis）were established,SPSS 19.0 was used to analysis data to get the potential metabolic markers.ResultsThe PCA and OPLS-DA were established successfully and 27 metabolites present differently in levels between AMI 1 week group and the control group.Among these metabolites,LysoPC（lysophosphatidylcholine）and LysoPE（lysophosphatidyl ethanolamine）demonstrate significant differeance between these two groups.ConclusionThe metabolic disorder in AMI patients can be reflected from the serum metabolic profiling.And these significant metabolites provide sup?port and reference for the prevention of AMI complication and its treatment.

myocardial infarction；rats,Wistar；chromatography,high pressure liquid；mass spectrometry；serum me?tabolomics

R541.4

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.022

天津市自然科學(xué)基金資助項目（10JCYBJC14000）

1天津醫(yī)科大學(xué)三中心臨床學(xué)院（郵編300170）；2天津市第三中心醫(yī)院

董志歡（1989），男，碩士研究生，主要從事心血管代謝研究

△通訊作者E-mail:Litongtj@163.com