曹嫚，趙紅，何軍，戴利，殷小成，姚平波

MicroRNA-21對肺成纖維細胞增殖和分化的影響

曹嫚，趙紅△，何軍，戴利，殷小成，姚平波

目的探討小鼠肺成纖維化細胞模型中microRNA（miR）-21對肺成纖維細胞增殖和分化的影響。方法24只SPF級C57BL/6小鼠隨機分為假手術組和肺纖維化模型組，各12只。經(jīng)氣管內注入博萊霉素建立小鼠肺纖維化模型，采用熒光定量PCR檢測各組肺組織miR-21的表達。提取小鼠成纖維細胞，胰酶消化，接種于6孔板，使細胞濃度達到30%～50%。設隨機對照組、空白對照組和miR-21 mimic組。各組分別在50 μL Opti-MEM加入2.5 μL PBS、陰性對照儲存液和miR-21 mimic儲存液（20 μmol/L）。采用細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法檢測細胞增殖活性，蛋白質印跡法檢測成纖維細胞含Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS-1）和轉化生長因子（TGF）-β1的表達。結果與假手術組比較，肺纖維化模型組小鼠肺組織中miR-21的表達量明顯上調。與隨機對照組和空白對照組比較，miR-21 mimic組成纖維細胞miR-21基因表達顯著上調，成纖維細胞增殖率增加，ADAMTS-1蛋白表達明顯下降，而TGF-β1表達顯著上調；空白對照組與隨機對照組ADAMTS-1及TGF-β1蛋白表達無明顯差異。結論在小鼠肺成纖維化細胞模型中上調的miR-21可通過ADAMTS-1/TGF-β1信號通路促進肺纖維化。

肺纖維化；成纖維細胞；轉化生長因子β1；微RNAs；細胞增殖；細胞分化；ADAMTS-1；microRNA-21

肺纖維化疾病的特征為肺間質過多的膠原及細胞外基質（ECM）沉積，是不同病因學所致肺部疾病的共同表型，因此研究如何改善肺纖維化后肺組織的修復能力具有重要的臨床意義［1-2］。miRNA（miR）

是一類抑制靶基因的翻譯過程并參與許多重要的生物學過程的非編碼小分子RNA。研究表明miR-21在博萊霉素處理的小鼠肺內表達增加，抑制miR-21后肺纖維化程度明顯減輕，過表達miR-21通過轉化生長因子（TGF）-β1/Smad信號通路促進肺纖維化［3-4］。本研究成功復制肺纖維化模型，檢測肺組織miR-21的表達情況，并利用miR-21的模擬物（miR-21 mimic）轉染小鼠原代肺成纖維細胞，觀察過表達miR-21對肺成纖維細胞增殖與分化的影響，為肺纖維化的發(fā)病機制和篩選出關鍵miRNA作為肺纖維化疾病的治療靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料（1）實驗動物。SPF級C57BL/6小鼠24只，雄性，體質量20～26 g，由南華大學實驗動物部提供。（2）試劑和儀器。RNA反轉錄試劑盒和SYBR試劑、脂質體2000、實時熒光定量PCR儀均購自瑞士羅氏公司；DMEM培養(yǎng)基購自Sigma-Aldrich美國公司；胎牛血清（FBS，20%）購自Gibco美國公司；化學修飾的miR-21 mimic、蛋白提取試劑盒、CCK-8細胞增殖檢測試劑盒均購自廣州市銳博生物科技有限公司；兔抗鼠含Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a distintegrin and metalloprotease with thrombospondin type 1 motifs，ADAMTS-1）多克隆抗體、TGF-β1單克隆抗體及HRP-標記的羊抗兔二抗及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組按照隨機數(shù)字表法分為假手術組和肺纖維化模型組，每組12只，均為普通飼料飼養(yǎng)，自由飲水。2組小鼠體質量分別為（23±3）、（24±2）g，組間差異無統(tǒng)計學意義（t=0.961，P=0.347）。

1.2.2 小鼠肺纖維化模型的建立以1%氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉，無菌操作下鈍性分離暴露氣管，氣管內一次性注入博萊霉素生理鹽水溶液0.2～0.5 mL（5 mg/kg），注射后將小鼠直立并旋轉，假手術組在相同條件下給予生理鹽水。

1.2.3 動物模型制備及鑒定1%氯胺酮100 mg/kg麻醉處死，去除結締組織，截取肺組織，迅速放入-80℃液氮中凍存?zhèn)溆?，用于提取肺組織總RNA。然后取右肺上葉置體積分數(shù)為40 g/L甲醛中固定24 h以上，石蠟包埋、切片。分別行微波改良Masson三色法、VG染色法。

1.2.4 miR-21的檢測（1）肺組織總RNA提取與定量。用TRIzol法提取肺組織總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量，紫外分光光度計測定總RNA濃度及純度。（2）反轉錄。按照miScriptⅡ反轉錄試劑盒說明，經(jīng)反轉錄合成cDNA?？偡磻w系20 μL，反應條件為孵育37℃60 min，95℃5 min。并使用無酶水稀釋后-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩＃?）qRT-PCR。引物由MRC Gene公司設計合成，按照miScript SYBR Green Kit說明配制反應混合物，每個反應體系為10 μL，使用羅氏LightCycler480/熒光定量PCR儀檢測，反應條件：95℃30 s預變性；95℃5 s，60℃30 s，重復40個循環(huán)進行擴增反應；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s制備融解曲線。每個樣品設3個復孔。采用標準曲線法計算mRNA表達量，并計算其相對表達量（U6和β-actin校正值）。具體操作參照說明書。引物序列見表1。

Tab.1The stem-loop and PCR primers of targeted genes表1 各基因引物序列

1.2.5 成纖維細胞的提取無菌條件下取出0.1 g肺組織于培養(yǎng)皿中，Hank's液漂洗，剪碎肺組織放入15 mL離心管中，加入5倍體積0.05%胰酶，37℃水浴6 min，反復吹打、靜置，沉降后棄去上清液。沉淀加入約5倍體積0.08%胰蛋白酶及0.1%膠原酶Ⅱ混合液，反復吹打15 min，離心取沉淀后以15 mL胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，接種于6 cm培養(yǎng)皿中。每隔60～90 min后更換新鮮胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

1.2.6 miR-21 mimic的轉染轉染前24 h，胰酶消化成纖維細胞，接種到6孔板中，使轉染前細胞濃度達到30%～50%。實驗設隨機對照組、空白對照組和miR-21 mimic組（均n= 5）。各組分別在50 μL Opti-MEM加入2.5 μL PBS、陰性對照儲存液和miR-21 mimic儲存液（20 μmol/L），常溫孵育5 min。用50 μL Opti-MEM稀釋1 μL lipo2000，溫和混勻并恒溫孵育5 min。將以上兩液體溫和混勻，室溫孵育20 min。將混合液加入含有細胞1 mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中，柔和混勻，培養(yǎng)5 h后，將孔中含mimic-lipo2000混合液的培養(yǎng)基移去，替換新鮮胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)1 d，采用熒光定量PCR技術檢測miR-21的含量。

1.2.7 Western blot法測定成纖維細胞ADAMTS-1及TGF-β1蛋白的表達肺原代成纖維細胞培養(yǎng)1周后，按試劑盒說明提取蛋白，并測定蛋白濃度。10%SDS-PAGE行電泳及PVDF膜轉印3 h。電泳結束后用半干轉電轉移法將凝膠中蛋白轉至硝酸纖維素膜。轉膜后將膜置于5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入人一抗（1∶100、1∶750稀釋）4℃孵育過夜，采用ECL顯色。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，PhotoshopCS 5.0軟件測定各組灰度值，分別以ADAMTS-1、TGF-β1與GAPDH顯影條帶灰度值的比值表示相對表達水平。實驗重復3次。

1.2.8 CCK-8檢測成纖維細胞的增殖取對數(shù)生長期成纖維細胞，以每孔細胞數(shù)量2×107/L密度接種于96孔板（100 μL/L）中，預培養(yǎng)后，每孔加入15 μL CCK-8溶液，飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)2 h，上酶標儀測定460 nm處的吸光度（A460）。通過以下公式計算增殖率：增殖率（%）=［1-（miR-21 mimic組A460-對照組A460）/對照組A460］×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料用均數(shù)±標準差表示，2組間比較采用t檢驗，

多組間比較采用單因素方法分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；相關分析采用Pearson相關。計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺纖維化的形態(tài)結構假手術組肺泡結構正常，極少炎性細胞浸潤。肺纖維化模型組肺結構紊亂，肺泡間隔內成纖維細胞明顯增多，纖維組織增生，呈條索樣、斑片狀分布，肺泡間隔破壞，微波改良Masson染色可見大量染成綠色的膠原纖維，膠原纖維增生明顯，表明肺纖維化模型復制成功，見圖1。

Fig.1Histopathological changes of lung tissue between two groups（Microwave modified Masson staining，×100）圖1 2組大鼠肺組織病理改變（微波改良Masson染色，×100）

2.2 miR-21基因的表達肺纖維化模型組miR-21基因的表達量為（6.05±0.24）×10-4，明顯高于假手術組的（1.62±0.45）×10-4（n=12，t=12.20，P＜0.01）。

2.3 成纖維細胞中miR-21基因表達及增殖率比較miR-21 mimic組成纖維細胞中的miR-21基因表達及增殖率均明顯高于隨機對照組和空白對照組（P＜0.05），而后兩組組間差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

Tab.2Comparison of gene expression of miR-21 and proliferation in fibroblast between control group，blank group and miR-21 group表2 成纖維細胞miR-21基因表達及增殖率比較（n=5，）

Tab.2Comparison of gene expression of miR-21 and proliferation in fibroblast between control group，blank group and miR-21 group表2 成纖維細胞miR-21基因表達及增殖率比較（n=5，）

＊＊P＜0.01；a與隨機對照組比較，b與空白對照組比較，P＜0.05

增殖率（%）12.48±1.23 13.98±1.61 27.89±1.66ab 32.62＊＊組別隨機對照組空白對照組miR-21 mimic組F miR-21/U6（×10-4）1.14±0.07 1.03±0.20 4.87±0.71ab 14.82＊＊

2.4 ADAMTS-1及TGF-β1蛋白表達水平的變化與隨機對照組和空白對照組相比，miR-21 mimic組ADAMTS-1蛋白的表達明顯下調，條帶灰度減弱；而TGF-β1蛋白的表達顯著上調，條帶灰度增強；空白對照組與隨機對照組ADAMTS-1及TGF-β1蛋白表達無明顯差異，見圖2。

Fig.2The expressions of ADAMTS-1 and TGF-β1in fibroblast between three groups shown by Western blot圖2 Western blot檢測肺成纖維細胞ADAMTS-1和TGF-β1蛋白的表達情況

3 討論

肺纖維化是由多因素所致的慢性、漸進性、致命性肺間質性疾病，以成纖維細胞過度分化增殖、ECM膠原蛋白過度積聚、瘢痕組織形成引起肺結構不可逆破壞為特征［5］。大量研究表明TGF-β1是公認最關鍵的誘導肺纖維化的調控因子，使成纖維細胞過度增殖分化，ECM在肺間質過度積聚，促進肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展［1］。ADAMTS-1是ADAMTS金屬蛋白酶家族的第一個成員，成纖維細胞、血管內皮細胞、巨噬細胞等細胞可產(chǎn)生ADAMTS-1，ADAMTS-1分泌后通過C末端3個血小板結合蛋白基序和間隔區(qū)錨定在ECM中，參與ECM蛋白的調控［2］。文獻報道m(xù)iRNA參與肺纖維化過程中肌成纖維細胞增殖分化的病理過程［6］。單編碼基因miR-21是進化上高度保守的miRNA，與ADAMTS-1存在靶向結合作用［6-7］。研究表明在博萊霉素誘導小鼠肺纖維化模型和肺纖維化患者肺組織中，miR-21主要在肌成纖維細胞集中表達并上調［7］。本研究成功復制大鼠肺纖維化模型，微波改良Masson染色可見大量染成綠色的膠原纖維，膠原纖維增生明顯。qRT-PCR結果發(fā)現(xiàn)miR-21在小鼠肺纖維化模型組表達較假手術組顯著上調，提示miR-21參與肺纖維化后肺損傷和修復過程。

成纖維細胞的增殖與分化在肺纖維化過程中扮演重要角色。研究表明miR-21在博萊霉素處理的小鼠體內及特發(fā)性肺纖維化患者肺內表達均增加，抑制miR-21后肺纖維化程度明顯減輕。miR-21在纖維化組織中表達上調是通過TGF-β1/Smad信號通路實現(xiàn)的，TGF-β1可以通過增強miR-2l的轉錄及轉錄后加工使其表達上調［8］。本研究證實：過表達miR-21可明顯激活成纖維細胞的增殖和分化，提示miR-21與肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關。ADAMTS-1基因是TGF-β1信號轉導通路的抑制蛋白，其可與細胞膜上TGF-β1受體競爭性結合，阻斷TGF-β1信號在胞漿內的傳導，下游信號紊亂是TGF-β1信號轉導通路失活的機制之一。而抑制TGF-β1/ADAMTS-1信號通路可以減輕博萊霉素導致的肺纖維化。筆者預測ADAMTS-1為miR-21

的下游靶基因，本研究結果顯示，在成纖維細胞中過表達miR-21可以明顯抑制ADAMTS-1的表達，提示在小鼠肺纖維化模型下，miR-21可以通過抑制ADAMTS-1的表達，進而促進TGF-β1對成纖維細胞的分化而導致肺纖維化。

綜上所述，在小鼠肺纖維化模型中，miR-21在肺纖維化組織中的表達明顯上調，通過抑制靶基因ADAMTS-1的表達，促進成纖維細胞的增殖和分化而導致肺纖維化，為有效預防肺纖維化提供了新的線索和治療分子靶點。

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（2014-12-15收稿 2015-04-16修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effect of microRNA-21 on proliferation and differentiation of pulmonary fibroblasts of mice

CAO Man，ZHAO Hong△,HE Jun,DAI Li,YIN Xiaocheng,YAO Pingbo
Pediatrics of the Affiliated Nanhua Hosital of University of South China，Hengyang 421001，China△

ObjectiveTo investigate the effect of microRNA（miR）-21 on proliferation and differentiation of murine pulmonary fibroblasts.MethodsC57BL/6 mice of SPF grade（n=24）were randomly divided into Sham group and Pulmo?nary fibrosis model group with 12 mice in each group.Pulmonary fibrosis model was established by trans-tracheal jet ventila?tion of bleomycin into mice.The transcription levels of miR-21 were examined by quantitative real-time PCR in various pul?monary fibrosis tissues.Primary fibroblast were isolated and digested by Trypsin then inoculated into 6 well plate to reach confluence of 30%-50%.PBS（2.5 μL）,negative control stock solution and miR-21 mimic stock solution（20 μmol/L）were added into Opti-MEM（50 μL）as control group,blank group and miR-21 mimic group respectively.The cell viability was as?sessed by CCK-8.Expressions of ADAMTS-1 and TGF-β1in the pulmonary fibroblasts were tested using Western blot.ResultsThe expression of miR-21 was significantly increased in lungs of mice in pulmonary fibrosis model group than that in sham group.Expression of miR-21 was higher in miR-21 mimic group than that in control group and blank group.Expres?sion of miR-21 was significantly higher with better cell viability in miR-21 mimic group than that in control group and blank group.The expression of ADAMTS-1 was significantly decreased in miR-21mimic group,while the expression of TGF-β1,a target gene of miR-21,was significantly increased in miR-21 mimic group compared with the other two groups.There is no significant different in expressions of ADAMTS-1 and TGF-β1between control group and blank group.ConclusionOver?expression of miR-21 in pulmonary fibroblasts disrupts TGF-β1signaling pathway by reducing expression of ADAMTS-1, which promotes the proliferation and differentiation of pulmonary fibroblast.

pulmonary fibrosis；fibroblasts；transforming growth factor beta1；microRNAs；cell proliferation；cell differ?entiation；ADAMTS-1；microRNA-21

R563

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.014

湖南省自然科學基金資助項目（14JJ7044）；湖南省教育廳青年項目（14B156）

湖南衡陽，南華大學附屬南華醫(yī)院兒科（郵編421001）

曹嫚（1981），女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)肺間質性疾病研究

△通訊作者E-mail：zhaohong779900@sina.com