李浩，馬勃，李志強，王啟弘

犬動脈瘤動物模型的血流動力學(xué)分析

李浩1，2，馬勃3，李志強2△，王啟弘4

目的探討建立穩(wěn)定、理想、快捷的顱內(nèi)動脈瘤模型的方法，為動脈瘤的相關(guān)研究提供可靠的動脈瘤模型。方法在改良的外科顯微技術(shù)條件下制作側(cè)壁型、分叉部、末端型和真性合并假性囊狀動脈瘤，每種類型各7只。術(shù)后2周行彩色多普勒超聲儀、磁共振成像（MRI）、磁共振血管成像（MRA）、數(shù)字減影動脈血管造影（IADSA）檢查，進行動脈瘤模型的計算機流體力學(xué)（CFD）模擬分析。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，對動脈瘤壁的組織生物力學(xué)特性進行分析，以微彈簧圈（MC）緊密填塞動脈瘤并再次進行上述檢查。結(jié)果所有模型均獲得成功，MC瘤腔栓塞能取得良好效果。培養(yǎng)證實血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的體外增殖情況良好，并成功將VEC貼附于高分子可降解材料表面，進而生長成VEC層結(jié)構(gòu)。對栓塞前后的動脈瘤模型進行了血流動力學(xué)分析，獲得了相關(guān)的血流動力學(xué)參數(shù)，動脈瘤內(nèi)的血流速度為2～7 cm/s，動脈瘤載瘤動脈內(nèi)的血流速度為8～26 cm/s。結(jié)論建立了穩(wěn)定、理想、快捷的顱內(nèi)動脈瘤模型，可為動脈瘤的相關(guān)研究提供可靠的動脈瘤模型。

血流動力學(xué)；顱內(nèi)動脈瘤；動物模型

顱內(nèi)動脈瘤（aneurysm,AN）是動脈管壁病理性局限性擴張產(chǎn)生的腦血管瘤樣突起，其破裂是引起人類自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的首位原因（約占79%～89%），占顱內(nèi)出血的25%［1］，其病死率及致殘率極高，嚴(yán)重影響著人們的健康和生命，是人類猝死的重要原因之一［2］。動脈瘤一旦產(chǎn)生，便存在生長、

血栓形成和破裂的風(fēng)險，稱之為“動脈瘤行為”。動脈瘤行為與其內(nèi)部的血流動力學(xué)的一些因素如血流狀態(tài)、切應(yīng)力、動脈壓、搏動性血流等與血管壁本身的支撐力均有密切關(guān)系［1］，是多個力學(xué)因素相互作用的結(jié)果。顱內(nèi)動脈瘤的血流動力學(xué)研究對于疾病的控制和治療具有重要意義。用人體作為實驗材料進行研究很難實施，相關(guān)顱內(nèi)動脈瘤動物模型已有研究，但較為復(fù)雜，可操作性不強。因此建立一個能夠科學(xué)使用的、可供實驗要求選擇的、穩(wěn)定理想的動脈瘤動物模型具有重要的現(xiàn)實意義［3］。本研究建立了4種不同類型的動脈瘤模型，并在不同血流模式下研究血流狀態(tài)、切應(yīng)力、壓力及速度等參數(shù)與不同類型動脈瘤生長和破裂的關(guān)系，以確定不同類型動脈瘤腔內(nèi)的血流動力學(xué)參數(shù)，以期為提高手術(shù)和介入栓塞動脈瘤的治療效果提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 建立不同類型的動脈瘤模型9～12 kg雜種犬28只，雌雄不限，4%戊巴比妥鈉（1 mL/kg體質(zhì)量）腹腔注射麻醉后仰臥位固定，暴露頸部皮下的頸外靜脈（EJV）及左右兩側(cè)深部的頸總動脈（CCA）。取出EJV備用，阻斷CCA的遠(yuǎn)近端血流，在顯微鏡下，將犬的EJV囊吻合到CCA側(cè)壁，參照文獻［4］制作成4類動脈瘤模型：側(cè)壁型、分叉部、末端型以及真性合并假性囊狀動脈瘤，每種類型7只。

1.2 血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的培養(yǎng)以及微彈簧圈（MC）的構(gòu)建取犬的頸靜脈，應(yīng)用組織貼塊法進行原代培養(yǎng)，經(jīng)凝血Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色證實，用傳3～5代的細(xì)胞進行實驗。噻唑藍(lán)（MTT）法測光吸收值以檢測VEC的增殖活性。擴增VEC，培養(yǎng)于多孔復(fù)合膜（MC）上，測算出VEC在聚合結(jié)構(gòu)中最佳的細(xì)胞密度。將培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞種在Aga?rose上，24 h后，內(nèi)皮細(xì)胞聚集成團。吸出內(nèi)皮細(xì)胞至離心管內(nèi)，離心后，小心吸出上清。用DMEM（含0.05 mol/L NaOH、200 mmol/L HEPES以及260 mmol/L NaHCO3）重懸細(xì)胞，接種于高分子可降解材料表面。次日檢測細(xì)胞黏附情況。參照Zund方法［3］，MTT法測定深紫色產(chǎn)物甲臜含量，以反映VEC的黏附與生長情況。

1.3 在不同血流動力學(xué)條件下進行動脈瘤血流動力學(xué)分析彩超檢查后，對形成動脈瘤模型的犬行股動脈穿刺，通過微導(dǎo)管進入動脈瘤內(nèi)，測量4類動脈瘤內(nèi)的壓力并行數(shù)字減影血管造影（DSA）檢查腔內(nèi)形態(tài)改變。控制性低血壓：采用吸入性麻醉劑異氟醚，用量隨血壓的控制而增減，控制平均動脈壓（MAP）由基礎(chǔ)值的17 kPa降至6 kPa。保持低血壓水平30～60 min后檢查。

1.4 栓塞后動脈瘤模型的血流動力學(xué)研究（1）影像學(xué)檢查：對形成側(cè)壁型、分叉部和末端型動脈瘤模型的犬行股動脈穿刺，通過微導(dǎo)管將MC緊密填塞于動脈瘤內(nèi)，DSA檢查填塞瘤腔情況。（2）栓塞后動脈瘤的力學(xué)評價：觀察內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)中的生長、代謝及生物力學(xué)改變。（3）進行動脈瘤模型的計算機流體力學(xué)（CFD）模擬分析：根據(jù)不同類型動脈瘤動物模型的血液流動特性的流線圖和速度梯度圖，分析瘤口的近端、瘤頂和遠(yuǎn)端壁面受到的壓力和切應(yīng)力。

2 結(jié)果

2.1 建模結(jié)果術(shù)后所有動物全部存活，術(shù)后1周行DSA血管造影檢查發(fā)現(xiàn)成功長出動脈瘤。成功地建立了側(cè)壁型、分叉部、末端型以及真性合并假性囊狀動脈瘤（操作真性合并假性囊狀動脈瘤時，血管壁出現(xiàn)一個血泡，故沒有拍照），最大直徑約5.0 mm，見圖1。

2.2 VEC培養(yǎng)及MC構(gòu)建結(jié)果VEC體外增殖情況良好，見圖2。VEC體外血管形成實驗證實VEC能夠貼附于高分子可降解材料表面，見圖3。

2.3 栓塞前后動脈瘤模型的血流動力學(xué)結(jié)果動脈瘤內(nèi)的血流速度為2～7 cm/s，動脈瘤載瘤動脈內(nèi)的血流速度為8～26 cm/s。適當(dāng)角度能夠清楚顯示AN和動脈，見圖4。能夠檢測到血流從右至左流動，顏色由深至淺代表速度由快至慢。對動脈瘤模型CFD模擬分析后，獲得速度梯度圖（示動脈瘤及其附近的血流速度變化），見圖5。遠(yuǎn)端、瘤頂、近端壁面受到的壓力和切應(yīng)力的測得數(shù)值見圖6、7?？梢?，動脈瘤瘤頂?shù)膲毫Ω?、切?yīng)力最低；近端流入道部分的壓力普遍較高，壓力的最高值也出現(xiàn)在這一段，而且切應(yīng)力最高。同樣對栓塞后的動脈瘤分析獲得速度梯度圖，見圖8。左CCA造影顯示左CCA側(cè)壁型囊狀A(yù)N，在附近可看到合并假性AN，見圖9。

Fig.4DSA angiography of canine aneurysm models圖4 犬動脈瘤模型DSA血管造影

Fig.5Constant speed gradient map of canine aneurysm model圖5 犬動脈瘤模型定常速度梯度圖

Fig.6Distribution curve of bifurcation aneurysm wall pressure（absolute value）that changes along curve of tumor wall（distal→tumor top→proximal）圖6 分叉部動脈瘤瘤壁上壓力（絕對值）隨瘤壁曲線長度（由遠(yuǎn)端→瘤頂→近端）變化的分布曲線

Fig.7Distribution curve of bifurcation aneurysm tumor wall shearing stress（absolute value）that changes along curve of tumor wall（distal→tumor top→proximal）圖7 分叉部動脈瘤瘤壁上切應(yīng)力（絕對值）隨瘤壁曲線長度（由遠(yuǎn)端→瘤頂→近端）變化的分布

Fig.8Constant speed gradient map of genuine combined with pseudo canine aneurysm model圖8 犬真性合并假性動脈瘤模型定常速度梯度圖

Fig.9Saccular intracranial aneurysm of the left common carotid artery（side wall type indicated by straight arrow）which combined false intracranial aneurysm（curved arrow）detected by the left carotid artery angiography圖9 左頸總動脈側(cè)壁型囊狀顱內(nèi)動脈瘤（直箭頭）合并假性顱內(nèi)動脈瘤（彎箭頭）

3 討論

顱內(nèi)動脈瘤是中老年人群常見的神外急癥。它引起的蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦血管意外的發(fā)生率日漸升高。為探尋人類顱內(nèi)動脈瘤的病因，很多研究者設(shè)計了多種動脈瘤模型，如靜脈囊袋移植動脈瘤模型［5］，利用彈性蛋白酶消化頸動脈殘端動脈瘤模型［6-7］，但這些模型與人類動脈瘤生成沒有因果關(guān)系，僅適合栓塞材料等方面的研究，不適合病因?qū)W研究。此外，還有利用血流動力學(xué)改變?nèi)缃Y(jié)扎頸總動脈，結(jié)合誘導(dǎo)高血壓和破壞彈力纖維誘導(dǎo)大鼠、小鼠顱內(nèi)動脈瘤模型［8-9］，但這些小動物模型的腦血管過于細(xì)小，無法進行血流動力學(xué)研究。而靈長類如猴動脈瘤動物模型因倫理問題及費用昂貴等問題難以廣泛應(yīng)用［10］。犬頸總動脈直徑與人類大腦中動脈起始段非常接近，同時凝血系統(tǒng)與人類相當(dāng)接近；單純改變血流動力學(xué)從病因?qū)W上更符合人類動脈瘤的發(fā)病特點［11］。

本研究選取28只健康犬，在雙側(cè)頸動脈成功制作4種囊性動脈瘤模型。術(shù)后實驗動物均健康成活，無明顯神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。顱內(nèi)動脈血管壁由完整的內(nèi)彈力層、相對薄的中膜及外膜構(gòu)成。這種結(jié)構(gòu)特征一旦出現(xiàn)完整性破壞很容易形成動脈瘤［12-13］。血流動力學(xué)不穩(wěn)定是早期顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生和破裂的重要因素［14］。制作這種動脈瘤模型可行性高，術(shù)后

存活率較高，適合常規(guī)實驗研究。通過犬頸總動脈結(jié)扎，增加基底動脈頂端血流動力學(xué)，不附加其他任何危險因素，能夠誘導(dǎo)出顱內(nèi)動脈瘤。這與人顱內(nèi)血管偶然閉塞或外科手術(shù)閉塞后其他血管血流增加，逐漸形成顱內(nèi)動脈瘤的機制一致［15］。

本實驗采用多種影像學(xué)技術(shù)檢查該模型，不僅能顯示動脈瘤的位置、形態(tài)、類型、瘤頸和瘤體的伸展方向，而且可明確動脈瘤內(nèi)的血流方向、狀態(tài)和與周圍動脈的關(guān)系。微彈簧圈栓塞和血栓閉塞動脈瘤后可阻止載瘤動脈的血流繼續(xù)進入瘤體，清除異常血流，使整個瘤體不再顯影。各種影像學(xué)技術(shù)相比較，DSA既能清楚地顯示AN，又能清晰地反映其與載瘤動脈的關(guān)系。

腦內(nèi)動脈血管組織結(jié)構(gòu)上的特點為中層平滑肌較少，彈力纖維貧乏，外膜很薄，這種血管的收縮力較弱，而擴張性卻很強［16］。彩超可以診斷AN，也可以觀察其大小及空間位置，并同時了解顱內(nèi)血流動力學(xué)的改變。從彩超和定常速度梯度圖可以看出，末端型AN中的血流沿動脈的中心線經(jīng)AN口流入，沿AN的對側(cè)邊緣流出，幾乎全部流進最接近AN口邊緣的那支動脈。瘤腔內(nèi)血流速度快，且呈旋轉(zhuǎn)方式，其中心沒有慢速的渦流。這種模型更易接受載瘤動脈血流的沖擊，因而有生長和破裂的傾向，故血流動力學(xué)方面能模仿相對多發(fā)的顱內(nèi)分叉部AN和基底動脈頂端AN。本實驗對于4種動脈瘤進行了影像學(xué)和血流動力學(xué)方面的研究，為這類疾病的臨床診治提供了參考。

（圖1～3見插頁）

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（2015-02-26收稿 2015-05-01修回）

（本文編輯 閆娟）

Haemodynamic analysis in canine aneurysm model

LI Hao1，2,MA Bo3,LI Zhiqiang2△,WANG Qihong4
1 Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2 Fengxian Hospital Affiliated to Southern Medical University；3 Anhui Science and Technology University，Department of Pathogenology and Immunology；4 Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine△

ObjectiveTo explore a way to establish a stable,ideal and handy intracranial aneurysm model for related studies.MethodsModified microsurgery technology was applied to establish sidewall,bifurcation,terminal and merged types of aneurysm（n=7 in each type）.Two weeks after operation,color Doppler ultrasound,magnetic resonance imaging（MRI）,magnetic resonance angiography（MRA）and intra-arterial digital subtraction angiography（IADSA）were performed and computational fluid dynamics（CFD）was used for simulation analysis of aneurysm models.Biomechanical properties of aneurysm wall tissues was analyzed by cell culture,then the above examinations were performed again after the aneurysm was embolized by micro coil（MC）.ResultsAll models were successfully established,and the MC embolization of aneurysm cavity achieved good efficacy.Vascular endothelial cells（VECs）proliferate well in vitro,and the VECs adhered to the sur?face of biodegradable polymeric materials successfully and grow into VEC layer structure.Hemodynamics analysis was per?formed in aneurysms model before and after embolization and relevant hemodynamic parameters was obtained.,Blood flow velocity are 2-7 cm/s in aneurysm and 8-26 cm/s in its parental artery.ConclusionA stable,ideal and handy intracranial aneurysm model was established and are essential in aneurysm related research.

hemodynamics；intracranial aneurysm；animal models

R743.4

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.013

國家自然科學(xué)基金資助項目（30872676）

1南方醫(yī)科大學(xué)，廣州（郵編510515）；2南方醫(yī)科大學(xué)附屬奉賢醫(yī)院（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院）神經(jīng)外科；3安徽理工大學(xué)病原免疫學(xué)教研室；4上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院神經(jīng)外科

李浩（1988），男，碩士在讀，主要從事腦血管病和腦腫瘤基礎(chǔ)與臨床研究

△通訊作者E-mail:zhiqiangli2013@126.com