馬菲菲，郝彥強(qiáng)，王國(guó)強(qiáng)，張?chǎng)?，郅程，冀天?/p>

上調(diào)miR-34c-5p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞HONE-1增殖和侵襲的影響

馬菲菲1，郝彥強(qiáng)2，王國(guó)強(qiáng)3，張?chǎng)?，郅程5，冀天星6?

目的探討上調(diào)miR-34c-5p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞HONE-1增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。方法利用定量PCR分析miR-34c-5p在鼻咽癌細(xì)胞株HONE-1和正常鼻咽細(xì)胞株NP69中的表達(dá)情況；利用克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分析上調(diào)miR-34c-5p表達(dá)對(duì)miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組、miR-34c-5p對(duì)照序列組和未處理組增殖和侵襲能力的影響。結(jié)果miR-34c-5p在鼻咽癌細(xì)胞株HONE-1的表達(dá)水平低于正常鼻咽細(xì)胞株NP69；miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組鼻咽癌細(xì)胞HONE-1的克隆形成和侵襲能力明顯低于miR-34c-5p對(duì)照序列組和未處理組（均P＜0.05）。結(jié)論miR-34c-5p的下調(diào)與鼻咽癌的生物學(xué)功能增殖和侵襲能力相關(guān)，是鼻咽癌治療的潛在靶點(diǎn)。

鼻咽腫瘤；細(xì)胞增殖；腫瘤侵潤(rùn)；體外研究；miR-34c-5p；HONE-1

鼻咽癌在我國(guó)華南地區(qū)的發(fā)病率為萬(wàn)分之一～萬(wàn)分之三［1］。近年來鼻咽癌患者經(jīng)放化療后5年存活率有所提高，但術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等仍嚴(yán)重威脅著患者的生命［2］。miR-34家族成員包括miR-34a、miR-34b、miR-34c-5p、miR-34c-3p，其在多種腫瘤中呈較低表達(dá)水平，且miR-34家族成員的低表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤治療的潛在靶標(biāo)［3］。不同腫瘤中miR-34家族成員的失調(diào)的種類不同，如在鼻咽癌組織中miR-34b和miR-34c的表達(dá)水平低于正常鼻咽部組織，而miR-34a無差異性［4］。miR-34c-5p在鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，但有關(guān)其具體作用及機(jī)制仍未明確。本研究旨在探討miR-34c-5p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株HONE-1增殖和侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料鼻咽癌細(xì)胞株HONE-1和正常鼻咽部細(xì)胞株NP69由廣東醫(yī)學(xué)院李濤老師惠贈(zèng)；胎牛血清、RPMI-

1640 BPE、r-EGF的K-SFM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；miR-34c-5p mimic和miR-34c-5p對(duì)照序列購(gòu)自中國(guó)銳博生物公司；脂質(zhì)體2000和Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Real-time PCR試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司；matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理鼻咽癌細(xì)胞株HONE-1接種于10%胎牛血清含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液，正常鼻咽部細(xì)胞株NP69接種于含有BPE、r-EGF的K-SFM培養(yǎng)液，均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一部分細(xì)胞用于驗(yàn)證miR-34c-5p在鼻咽癌細(xì)胞株HONE-1和正常鼻咽部細(xì)胞株NP6中的表達(dá)量差異；另一部分設(shè)立miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組、miR-34c-5p對(duì)照序列組和未處理組來確定miR-34c-5p表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株HONE-1增殖、侵襲的影響。

1.2.2 定量PCR分析miR-34c-5p表達(dá)量利用Trizol法提取miR-34c-5p總RNA；利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，最后利用Real-time PCR試劑盒定量分析miR-34c-5p的表達(dá)情況。以RNU6b作為內(nèi)參對(duì)照，樣本靶miR-34c-5p含量以相對(duì)樣品模板量即2△Ct表示，其中△Ct=Ct靶miRCtRNU6b。引物均由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)，見表1。

Tab.1Primer sequences for real time PCR of miR-34c-5p and U6表1 用于定量分析miR-34c-5p和U6表達(dá)的引物序列

1.2.3 miR-34c-5p mimic和對(duì)照序列轉(zhuǎn)染以大約3×105個(gè)/孔，將HONE-1鼻咽癌細(xì)胞接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)平板內(nèi)；細(xì)胞匯合達(dá)到70%～90%后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基（1 600 μL/孔）；miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組加入400 μL miR-34c-5p mimic和脂質(zhì)體2000復(fù)合物，miR-34c-5p對(duì)照序列組加入400 μL miR-34c-5p對(duì)照序列和脂質(zhì)體2000復(fù)合物，輕輕混勻后，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h；將轉(zhuǎn)染液移出，更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 克隆形成能力分析取miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組、miR-34c-5p對(duì)照序列組和未處理組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以約200個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔平板，置37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。倒去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，拍照并計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆團(tuán)數(shù)。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組算術(shù)平均數(shù)。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力取40 μL稀釋Matrigel加入小室中，37℃孵育2 h使Matrigel凝固；吸走小室中多余的液體，并在上室、下室分別加入100和600 μL無血清培養(yǎng)基，37℃平衡過夜；取miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組、miR-34c-5p對(duì)照序列組和未處理組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)1×105個(gè)細(xì)胞，用100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，加入Transwell小室上室，在下室加入600 μL完全培養(yǎng)基；在37℃、5%CO2孵育24 h，取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌1次，結(jié)晶紫染色10 min，并拍照（×200）計(jì)數(shù)。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組算術(shù)平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-34c-5p在鼻咽癌細(xì)胞株HONE-1和NP69中的表達(dá)miR-34c-5p在HONE-1中的表達(dá)水平低于NP69（2.49±0.81 vs 164.6±1.15，t=203.631,P＜0.05）。

2.2 上調(diào)miR-34c-5p對(duì)HONE-1克隆形成能力的影響miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組、miR-34c-5p對(duì)照序列組和未處理組的克隆形成能力分別為56.33±6.51、92.33±6.81及94.00±12.17，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.224,P＜0.05），其中miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組低于miR-34c-5p對(duì)照序列組和未處理組（均P＜0.05），后2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

Fig.1The effect of up-regulating miR-34c-5p on the clone formation capacity of nasopharyngeal cancer cell line HONE-1圖1 上調(diào)miR-34c-5p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞HONE-1克隆形成能力的影響

2.3 上調(diào)miR-34c-5p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞HONE-1侵襲能力的影響miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組、miR-34c-5p對(duì)照序列組和未處理組的穿過小室的細(xì)胞數(shù)（單位：個(gè)）分別為46.67±8.39、90.00±22.91及93.33±24，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.206，P＜0.05），其中miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組低于miR-34c-5p對(duì)照序列組和未處理組（均P＜0.05），后2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

3 討論

研究認(rèn)為，鼻咽癌組織中的miR-34c-5p表達(dá)水平低于正常鼻咽部組織［4］。本研究證實(shí)，miR-34c-5p在鼻咽癌細(xì)胞株HONE-1中的表達(dá)水平低于正常鼻咽細(xì)胞株NP69?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)和Tran?swell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組克隆形成和細(xì)胞侵襲能力低于miR-34c-5p對(duì)照序列組和未處理組，表明上調(diào)miR-34c-5p的表達(dá)可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞HONE-1的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲能力，提示miR-34c-5p的下調(diào)參與了鼻咽癌的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲功能特性。

同樣與正常組織比較，miR-34c-5p在其他腫瘤中也呈較低表達(dá)水平，如直腸癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、喉癌等［5］。miR-34c-5p的下調(diào)與多種腫瘤的生物學(xué)功能如增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、轉(zhuǎn)移侵襲和放化療抵抗性密切相關(guān)［6］。多種miR-34c-5p直接靶向基因如E2F3、BCL-2、c-MET、KITLG、cyclin-E等參與其抑癌作用。但在不同腫瘤中，參與miR-34c-5p抑癌的直接靶向基因有所不同［7-8］。因此，與鼻咽癌相關(guān)的miR-34c-5p直接靶向基因有待于進(jìn)一步闡明。另外，與其他腫瘤不同，miR-34a在鼻咽癌中的表達(dá)未見異常，而miR-34c-5p、miR-34c-3p和miR-34b在鼻咽癌中的表達(dá)均降低［6］。這與miR-34b/c基因定位區(qū)域染色體11q23是鼻咽癌的常見缺失位點(diǎn)相一致，而且在此區(qū)域也發(fā)現(xiàn)多種與鼻咽癌相關(guān)的抑癌基因，如抑癌基因TSLC1（tumor sup?pressor in lung cancer）［9］。同時(shí)，有研究認(rèn)為，啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化是TSLC1在鼻咽癌中低表達(dá)的主要原因，與其在其他腫瘤低表達(dá)的相關(guān)機(jī)制一樣，miR-34b/c在鼻咽癌中低表達(dá)與其基因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化有關(guān)［3］。鑒于miR-34家族各成員具有不同靶基因［10-11］，因此miR-34c-5p、miR-34c-3p和 miR-34b在鼻咽癌中的抑癌作用是否具有協(xié)同性以及相關(guān)的分子機(jī)制仍值得探索。

綜上所述，miR-34c-5p下調(diào)參與了鼻咽癌的形成和進(jìn)展，是鼻咽癌治療的潛在靶點(diǎn)，miR-34c-5p和miR-34b在鼻咽癌形成和進(jìn)展中的作用和相關(guān)分子機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

（圖2見插頁(yè)）

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（2015-01-23收稿 2015-05-12修回）

（本文編輯 陸榮展）

The effect of up-regulating miR-34c-5p on the proliferation and invasion of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1

MA Feifei1,HAO Yanqiang2,WANG Guoqiang3,ZHANG Xin4,ZHI Cheng5,JI Tianxing6△
1-3，5-6 The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China；2 Guangdong Provincial Maternity and Child Care Center；4 The First People′s Hospital of Foushan△

ObjectiveTo investigate the effect of up-regulating miR-34c-5p on cloning formation and migration of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1 in vitro.MethodsExpression levels of miR-34c-5p in nasopharyngeal cell line NP69 and nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1 were investigated by real time quantitative PCR；Cloning Forma?tion Test and Transwell Migration Assay were used to explore the effect of up-regulating miR-34c-5p on proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1.ResultsThe expression of miR-34c-5p in nasopharyngeal car?cinoma cell line HONE-1 was lower than that in normal nasopharyngeal cell line NP69.Up-regulating miR-34c-5p signifi?cantly suppressed the cloning formation and migration capacity,compared to those of NP69 cell line and HONE-1 with nor?mal level of miR-34c-5p（P＜0.05）.ConclusionDown-regulating miR-34c-5p involve in proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma and may be a used as a new therapeutic target for nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal neoplasms；cell proliferation；neoplasm invasiveness；in vitro；miR-34c-5p；HONE-1

R739.6

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.003

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導(dǎo)項(xiàng)目（2014A010074）；廣州醫(yī)學(xué)院科研基金項(xiàng)目（2012A08）

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院VIP產(chǎn)科（郵編510260），3胃腸外科，5病理科，6檢驗(yàn)科；2廣東省婦幼保健院；4佛山市第一人民醫(yī)院

馬菲菲（1983），主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤相關(guān)分子機(jī)制和臨床分子診斷研究

△通訊作者E-mail：jitianxing7021@163.com