馬菲菲，郝彥強，王國強，張鑫，郅程，冀天星

上調(diào)miR-34c-5p對鼻咽癌細胞HONE-1增殖和侵襲的影響

馬菲菲1，郝彥強2，王國強3，張鑫4，郅程5，冀天星6?

目的探討上調(diào)miR-34c-5p對鼻咽癌細胞HONE-1增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。方法利用定量PCR分析miR-34c-5p在鼻咽癌細胞株HONE-1和正常鼻咽細胞株NP69中的表達情況；利用克隆形成實驗和Transwell實驗分析上調(diào)miR-34c-5p表達對miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組、miR-34c-5p對照序列組和未處理組增殖和侵襲能力的影響。結(jié)果miR-34c-5p在鼻咽癌細胞株HONE-1的表達水平低于正常鼻咽細胞株NP69；miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組鼻咽癌細胞HONE-1的克隆形成和侵襲能力明顯低于miR-34c-5p對照序列組和未處理組（均P＜0.05）。結(jié)論miR-34c-5p的下調(diào)與鼻咽癌的生物學功能增殖和侵襲能力相關(guān)，是鼻咽癌治療的潛在靶點。

鼻咽腫瘤；細胞增殖；腫瘤侵潤；體外研究；miR-34c-5p；HONE-1

鼻咽癌在我國華南地區(qū)的發(fā)病率為萬分之一～萬分之三［1］。近年來鼻咽癌患者經(jīng)放化療后5年存活率有所提高，但術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移等仍嚴重威脅著患者的生命［2］。miR-34家族成員包括miR-34a、miR-34b、miR-34c-5p、miR-34c-3p，其在多種腫瘤中呈較低表達水平，且miR-34家族成員的低表達與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，是腫瘤治療的潛在靶標［3］。不同腫瘤中miR-34家族成員的失調(diào)的種類不同，如在鼻咽癌組織中miR-34b和miR-34c的表達水平低于正常鼻咽部組織，而miR-34a無差異性［4］。miR-34c-5p在鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，但有關(guān)其具體作用及機制仍未明確。本研究旨在探討miR-34c-5p對鼻咽癌細胞株HONE-1增殖和侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料鼻咽癌細胞株HONE-1和正常鼻咽部細胞株NP69由廣東醫(yī)學院李濤老師惠贈；胎牛血清、RPMI-

1640 BPE、r-EGF的K-SFM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；miR-34c-5p mimic和miR-34c-5p對照序列購自中國銳博生物公司；脂質(zhì)體2000和Trizol購自美國Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；Real-time PCR試劑盒購自日本TOYOBO公司；matrigel膠購自美國BD公司；6孔細胞培養(yǎng)板和Transwell細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組處理鼻咽癌細胞株HONE-1接種于10%胎牛血清含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液，正常鼻咽部細胞株NP69接種于含有BPE、r-EGF的K-SFM培養(yǎng)液，均置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期。一部分細胞用于驗證miR-34c-5p在鼻咽癌細胞株HONE-1和正常鼻咽部細胞株NP6中的表達量差異；另一部分設(shè)立miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組、miR-34c-5p對照序列組和未處理組來確定miR-34c-5p表達對鼻咽癌細胞株HONE-1增殖、侵襲的影響。

1.2.2 定量PCR分析miR-34c-5p表達量利用Trizol法提取miR-34c-5p總RNA；利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，最后利用Real-time PCR試劑盒定量分析miR-34c-5p的表達情況。以RNU6b作為內(nèi)參對照，樣本靶miR-34c-5p含量以相對樣品模板量即2△Ct表示，其中△Ct=Ct靶miRCtRNU6b。引物均由上海生工生物工程公司設(shè)計，見表1。

Tab.1Primer sequences for real time PCR of miR-34c-5p and U6表1 用于定量分析miR-34c-5p和U6表達的引物序列

1.2.3 miR-34c-5p mimic和對照序列轉(zhuǎn)染以大約3×105個/孔，將HONE-1鼻咽癌細胞接種在6孔細胞培養(yǎng)平板內(nèi)；細胞匯合達到70%～90%后，將細胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基（1 600 μL/孔）；miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組加入400 μL miR-34c-5p mimic和脂質(zhì)體2000復合物，miR-34c-5p對照序列組加入400 μL miR-34c-5p對照序列和脂質(zhì)體2000復合物，輕輕混勻后，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h；將轉(zhuǎn)染液移出，更換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 克隆形成能力分析取miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組、miR-34c-5p對照序列組和未處理組對數(shù)生長期細胞，以約200個細胞/孔接種于6孔平板，置37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。倒去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，拍照并計數(shù)細胞克隆團數(shù)。各組實驗重復3次，計算各組算術(shù)平均數(shù)。

1.2.5 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力取40 μL稀釋Matrigel加入小室中，37℃孵育2 h使Matrigel凝固；吸走小室中多余的液體，并在上室、下室分別加入100和600 μL無血清培養(yǎng)基，37℃平衡過夜；取miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組、miR-34c-5p對照序列組和未處理組對數(shù)生長期細胞，計數(shù)1×105個細胞，用100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，加入Transwell小室上室，在下室加入600 μL完全培養(yǎng)基；在37℃、5%CO2孵育24 h，取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌1次，結(jié)晶紫染色10 min，并拍照（×200）計數(shù)。各組實驗重復3次，計算各組算術(shù)平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件進行分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-34c-5p在鼻咽癌細胞株HONE-1和NP69中的表達miR-34c-5p在HONE-1中的表達水平低于NP69（2.49±0.81 vs 164.6±1.15，t=203.631,P＜0.05）。

2.2 上調(diào)miR-34c-5p對HONE-1克隆形成能力的影響miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組、miR-34c-5p對照序列組和未處理組的克隆形成能力分別為56.33±6.51、92.33±6.81及94.00±12.17，差異有統(tǒng)計學意義（F=17.224,P＜0.05），其中miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組低于miR-34c-5p對照序列組和未處理組（均P＜0.05），后2組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

Fig.1The effect of up-regulating miR-34c-5p on the clone formation capacity of nasopharyngeal cancer cell line HONE-1圖1 上調(diào)miR-34c-5p對鼻咽癌細胞HONE-1克隆形成能力的影響

2.3 上調(diào)miR-34c-5p對鼻咽癌細胞HONE-1侵襲能力的影響miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組、miR-34c-5p對照序列組和未處理組的穿過小室的細胞數(shù)（單位：個）分別為46.67±8.39、90.00±22.91及93.33±24，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.206，P＜0.05），其中miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組低于miR-34c-5p對照序列組和未處理組（均P＜0.05），后2組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

3 討論

研究認為，鼻咽癌組織中的miR-34c-5p表達水平低于正常鼻咽部組織［4］。本研究證實，miR-34c-5p在鼻咽癌細胞株HONE-1中的表達水平低于正常鼻咽細胞株NP69?？寺⌒纬蓪嶒灪蚑ran?swell實驗結(jié)果顯示，miR-34c-5p mimic轉(zhuǎn)染組克隆形成和細胞侵襲能力低于miR-34c-5p對照序列組和未處理組，表明上調(diào)miR-34c-5p的表達可明顯抑制鼻咽癌細胞HONE-1的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲能力，提示miR-34c-5p的下調(diào)參與了鼻咽癌的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲功能特性。

同樣與正常組織比較，miR-34c-5p在其他腫瘤中也呈較低表達水平，如直腸癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、喉癌等［5］。miR-34c-5p的下調(diào)與多種腫瘤的生物學功能如增殖、細胞周期進展、轉(zhuǎn)移侵襲和放化療抵抗性密切相關(guān)［6］。多種miR-34c-5p直接靶向基因如E2F3、BCL-2、c-MET、KITLG、cyclin-E等參與其抑癌作用。但在不同腫瘤中，參與miR-34c-5p抑癌的直接靶向基因有所不同［7-8］。因此，與鼻咽癌相關(guān)的miR-34c-5p直接靶向基因有待于進一步闡明。另外，與其他腫瘤不同，miR-34a在鼻咽癌中的表達未見異常，而miR-34c-5p、miR-34c-3p和miR-34b在鼻咽癌中的表達均降低［6］。這與miR-34b/c基因定位區(qū)域染色體11q23是鼻咽癌的常見缺失位點相一致，而且在此區(qū)域也發(fā)現(xiàn)多種與鼻咽癌相關(guān)的抑癌基因，如抑癌基因TSLC1（tumor sup?pressor in lung cancer）［9］。同時，有研究認為，啟動子區(qū)域高甲基化是TSLC1在鼻咽癌中低表達的主要原因，與其在其他腫瘤低表達的相關(guān)機制一樣，miR-34b/c在鼻咽癌中低表達與其基因啟動子區(qū)域高甲基化有關(guān)［3］。鑒于miR-34家族各成員具有不同靶基因［10-11］，因此miR-34c-5p、miR-34c-3p和 miR-34b在鼻咽癌中的抑癌作用是否具有協(xié)同性以及相關(guān)的分子機制仍值得探索。

綜上所述，miR-34c-5p下調(diào)參與了鼻咽癌的形成和進展，是鼻咽癌治療的潛在靶點，miR-34c-5p和miR-34b在鼻咽癌形成和進展中的作用和相關(guān)分子機制仍需進一步闡明。

（圖2見插頁）

［1］Yoshizaki T,Ito M,Murono S,et al.Current understanding and man?agement of nasopharyngeal carcinoma［J］.Auris Nasus Larynx, 2012,39（2）:137-144.doi:10.1016/j.anl.2011.02.012.

［2］Xu T,Tang J,Gu M,et al.Recurrent nasopharyngeal carcinoma:a clinical dilemma and challenge［J］.Curr Oncol,2013,20（5）:e406-e419.doi:10.3747/co.20.1456.

［3］Misso G,Di Martino MT,De Rosa G,et al.Mir-34:a new weapon against cancer［J］？Mol Ther Nucleic Acids,2014,3:e194.doi: 10.1038/mtna.2014.47.

［4］Luo Z,Zhang L,Li Z,et al.An in silico analysis of dynamic chang?es in microRNA expression profiles in stepwise development of na?sopharyngeal carcinoma［J］.BMC Med Genomics,2012,5:3.doi: 10.1186/1755-8794-5-3.

［5］Hagman Z,Haflidadottir BS,Ansari M,et al.The tumour suppres?sor miR-34c targets MET in prostate cancer cells［J］.Br J Cancer, 2013,109（5）:1271-1278.doi:10.1038/bjc.2013.449.

［6］Yang S,Li WS,Dong F,et al.KITLG is a novel target of miR-34c that is associated with the inhibition of growth and invasion in colorectal cancer cells［J］.J Cell Mol Med,2014,18（10）:2092-2102.doi:10.1111/jcmm.12368.

［7］Xu M,Jin H,Xu CX,et al.MiR-34c inhibits osteosarcoma metasta?sis and chemoresistance［J］.Med Oncol,2014,31（6）:972.doi: 10.1007/s12032-014-0972-x.

［8］Catuogno S,Cerchia L,Romano G,et al.miR-34c may protect lung cancer cells from paclitaxel-induced apoptosis［J］.Oncogene, 2013,32（3）:341-351.doi:10.1038/onc.2012.51.

［9］Tong JH,Ng DC,Chau SL,et al.Putative tumour-suppressor gene DAB2 is frequently down regulated by promoter hypermethylation in nasopharyngeal carcinoma［J］.BMC Cancer,2010,10:253.doi: 10.1186/1471-2407-10-253.

［10］Ebner OA,Selbach M.Quantitative proteomic analysis of gene regu?lation by miR-34a and miR-34c［J］.PLoS One，2014,9（3）:e92166. doi:10.1371/journal.pone.0092166.

［11］Wang LG,Ni Y,Su BH,et al.MicroRNA-34b functions as a tumor suppressor and acts as a nodal point in the feedback loop with Met［J］.Int J Oncol，2013，42（3）:957-962.doi:10.3892/ijo.2013.

（2015-01-23收稿 2015-05-12修回）

（本文編輯 陸榮展）

The effect of up-regulating miR-34c-5p on the proliferation and invasion of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1

MA Feifei1,HAO Yanqiang2,WANG Guoqiang3,ZHANG Xin4,ZHI Cheng5,JI Tianxing6△
1-3，5-6 The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China；2 Guangdong Provincial Maternity and Child Care Center；4 The First People′s Hospital of Foushan△

ObjectiveTo investigate the effect of up-regulating miR-34c-5p on cloning formation and migration of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1 in vitro.MethodsExpression levels of miR-34c-5p in nasopharyngeal cell line NP69 and nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1 were investigated by real time quantitative PCR；Cloning Forma?tion Test and Transwell Migration Assay were used to explore the effect of up-regulating miR-34c-5p on proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cell line HONE-1.ResultsThe expression of miR-34c-5p in nasopharyngeal car?cinoma cell line HONE-1 was lower than that in normal nasopharyngeal cell line NP69.Up-regulating miR-34c-5p signifi?cantly suppressed the cloning formation and migration capacity,compared to those of NP69 cell line and HONE-1 with nor?mal level of miR-34c-5p（P＜0.05）.ConclusionDown-regulating miR-34c-5p involve in proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma and may be a used as a new therapeutic target for nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal neoplasms；cell proliferation；neoplasm invasiveness；in vitro；miR-34c-5p；HONE-1

R739.6

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.10.003

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導項目（2014A010074）；廣州醫(yī)學院科研基金項目（2012A08）

1廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院VIP產(chǎn)科（郵編510260），3胃腸外科，5病理科，6檢驗科；2廣東省婦幼保健院；4佛山市第一人民醫(yī)院

馬菲菲（1983），主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤相關(guān)分子機制和臨床分子診斷研究

△通訊作者E-mail：jitianxing7021@163.com