魏艷青，王江平，王勤章，錢彪，丁國富

經(jīng)尿道灌注慢病毒轉(zhuǎn)染豚鼠膀胱的研究

魏艷青，王江平，王勤章△，錢彪，丁國富

目的觀察慢病毒介導(dǎo)綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)染膀胱的效果，并確定取得較好轉(zhuǎn)染效果的病毒量。方法豚鼠經(jīng)尿道灌注及靜脈注射不同量的攜帶GFP基因的慢病毒，飼養(yǎng)7 d后取膀胱、肝、肺、腎等組織冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察各組織GFP分布。結(jié)果滴度為4×108的慢病毒，經(jīng)尿道膀胱灌注30 μL時(shí)可見組織黏膜下有綠色熒光，40 μL時(shí)組織肌層有廣泛綠色熒光分布，50 μL時(shí)組織肌層有更強(qiáng)綠色熒光分布，靜脈注射25 μL時(shí)組織肌層可見有廣泛綠色熒光分布；經(jīng)尿道灌注各病毒量下未在膀胱外組織見有明顯綠色熒光分布，靜脈注射下在肝、肺等組織見有較膀胱更強(qiáng)綠色熒光。結(jié)論慢病毒可以成功介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染豚鼠膀胱，并且經(jīng)尿道灌注可以避免靜脈注射帶來的病毒在膀胱外組織廣泛分布，能夠?yàn)榘螂准膊〉呐R床治療帶來新的研究方向和手段。

慢病毒感染；膀胱；轉(zhuǎn)染；綠色熒光蛋白質(zhì)類；豚鼠

基因治療是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)界研究的重要方向之一。能否將目的基因高效而穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到靶器官，直接關(guān)系到基因在體內(nèi)的表達(dá)水平，也是決定其治療疾病是否可行的關(guān)鍵。越來越多的膀胱疾病被直接或間接地證實(shí)與基因突變或者表達(dá)異常有關(guān)。本研究采用膀胱灌注慢病毒來介導(dǎo)綠色熒光蛋白（GFP）轉(zhuǎn)染膀胱組織，并觀察其轉(zhuǎn)染效果，為膀胱疾病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料2月齡荷蘭種普通級(jí)雄性豚鼠（400～450 g）18只，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；攜帶綠色熒光蛋白慢病毒CON145及轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑（ENi.S.）購自上海吉?jiǎng)P基因公司；豚鼠用尿管由麻醉用硬膜外導(dǎo)管改良制成；冰凍切片（ICIROM325，德國）由石河子大學(xué)一附院病理科協(xié)助完成；熒光觀察部分在石河子大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室激光共聚焦顯微鏡（Leica TCSSP5，德國）下完成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及病毒液配制將豚鼠稱質(zhì)量后按質(zhì)量大小編號(hào)，并用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組。Ⅰ～Ⅳ組超凈臺(tái)下取20、30、40和50 μL滴度為4×108的慢病毒分別加ENi.S.至400 μL混勻后分兩等份，Ⅴ組取400 μL ENi.S.分兩等份，Ⅵ組取25 μL慢病毒加ENi.S.至200 μL混勻備用。

1.2.2 膀胱灌注將Ⅰ～Ⅴ組豚鼠禁食、禁水6 h后用100 g/L水合氯醛按200 mg/kg腹腔注射，完成麻醉后固定豚鼠四肢于操作臺(tái)上，暴露陰莖，碘伏消毒后鋪一次性洞巾，插入尿管8～10 cm后向外輕拉，感覺到阻力后說明尿管進(jìn)入膀胱，注射器抽吸膀胱內(nèi)尿液，并反復(fù)注入0.4 mL生理鹽水沖洗膀胱，待抽出液清亮后分別注入1.2.1中制備好的慢病毒液，灌注結(jié)束后結(jié)扎尿管保留慢病毒液2 h，待豚鼠蘇醒后撥出尿管并回籠繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)；第3天進(jìn)行第2次膀胱灌注。

1.2.3 靜脈注射Ⅵ組在其他組第2次膀胱灌注同時(shí)靜脈注射慢病毒液。由助手固定豚鼠并拉直后肢，去毛消毒后壓迫靜脈近心端使其充盈，并穿刺注入1.2.1中制備好的慢病毒液。

1.2.4 取材切片及觀察膀胱灌注及靜脈注射完成繼續(xù)飼養(yǎng)7 d后脫臼法處死豚鼠，取膀胱、肝及肺組織凍存于液氮中，后冰凍連續(xù)切片，厚度7 μm，甘油封片后激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP的分布。

2 結(jié)果

2.1 膀胱中GFP分布Ⅰ組膀胱全層未見有明顯GFP分布；Ⅱ組僅有膀胱黏膜下層有GFP表達(dá)；Ⅲ組可見膀胱肌層有廣泛GFP表達(dá)；Ⅳ組GFP廣泛分布于肌層，并且表達(dá)較Ⅲ組更強(qiáng)；Ⅴ組（陰性對(duì)照）膀胱未見有綠色熒光蛋白的分布；Ⅵ組膀胱可見肌層有廣泛GFP分布，見圖1。

Fig.1Distribution of GFP in bladder under different volumes of perfusion and methods of injection（×200）圖1 不同灌注量與注射方式下GFP在膀胱的分布（×200）

Fig.2Distribution of GFP in liver/lung/kidney under different methods of injection（×200）圖2 膀胱灌注及靜脈注射下膀胱外組織中GFP分布（×200）

2.2 膀胱外組織GFP分布見圖2。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ

膀胱灌注組在肝、肺、腎等組織切片中均未見有GFP分布；Ⅳ組在肝、腎等組織中僅有微弱綠色熒光；Ⅵ組在肝、肺、腎等組織可見有廣泛極強(qiáng)綠色熒光分布，且較膀胱明顯。

3 討論

目前不同臨床學(xué)科的科研工作者已經(jīng)證實(shí)多種腫瘤的發(fā)生與基因突變有關(guān)［1-2］，膀胱腫瘤的發(fā)生亦有可能與多種基因的突變相關(guān)［3］。而當(dāng)前對(duì)于腫瘤的治療仍停留在手術(shù)、放化療及生物治療階段［4］，而基因治療仍處于研究階段。

通過將外源基因?qū)牖蛲蛔兊慕M織細(xì)胞，從而來逆轉(zhuǎn)其已發(fā)生改變的形態(tài)或者功能，這將為因基因突變或者表達(dá)缺乏而導(dǎo)致的腫瘤或非腫瘤疾病提供新的治療方法［5］。目前常用的基因載體有脂質(zhì)體、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒［6］。Yu等［7］將一受雄性激素調(diào)控且僅在前列腺特異性表達(dá)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因插入慢病毒載體中，后分別轉(zhuǎn)染正常前列腺細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞，結(jié)果EGFP只在癌細(xì)胞中表達(dá)，且雄激素可以促進(jìn)EGFP的表達(dá)而不改變其表達(dá)特異性。周建民等［8］通過構(gòu)建干細(xì)胞白血?。⊿CL）基因重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)的形態(tài)和功能發(fā)生改變的Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC），發(fā)現(xiàn)可以上調(diào)C-kit蛋白的表達(dá)，并且顯著改善了ICC形態(tài)和功能的損害。從以上報(bào)道可以看出，如果上述基因工程應(yīng)用于疾病的臨床治療，可能會(huì)為疾病的治療方式帶來新的進(jìn)展。本研究采用的慢病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒，具有高效而穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移效率［9］，也是當(dāng)前多數(shù)學(xué)者研究的選擇。通過經(jīng)尿道灌注慢病毒載體介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染膀胱組織，發(fā)現(xiàn)慢病毒可以成功介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染組織，并且不同的病毒量表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)染效果；通過冰凍切片激光共聚焦顯微鏡下觀察肝、肺、腎等組織發(fā)現(xiàn)，隨著病毒量的增加膀胱轉(zhuǎn)染效果增強(qiáng)的同時(shí)，在膀胱外組織中亦有GFP的表達(dá)，這有可能與慢病毒侵入膀胱組織后通過血運(yùn)擴(kuò)散至其他組織有關(guān)；實(shí)驗(yàn)中經(jīng)靜脈注射雖然也能成功介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染膀胱，但是由于血液的全身流動(dòng)也導(dǎo)致GFP在豚鼠全身均有分布，并且在血供豐富的組織中尤為明顯，且在與膀胱灌注相當(dāng)?shù)牟《玖繒r(shí)膀胱轉(zhuǎn)染效果無明顯差異，但是GFP在膀胱外組織的表達(dá)靜脈注射遠(yuǎn)比膀胱灌注廣泛且強(qiáng)度高。

此外，膀胱作為一個(gè)半開放性器官，不論是在實(shí)驗(yàn)操作過程中還是在未來的臨床治療中，都有著較其他組織器官無可比擬的優(yōu)勢(shì)，它可以通過插入尿管將病毒直接灌注入膀胱，避免了諸如神經(jīng)、心血管系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)組織的直接損傷及病毒的全身蔓延，也避免了慢病毒的過量使用。

因此慢病毒的高效而穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染能力及膀胱的解剖特點(diǎn)帶來的易操作性定能開辟膀胱疾病研究的新方向，也將為膀胱疾病治療帶來新的思路和手段。

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（2015-05-06收稿 2015-06-24修回）

（本文編輯 魏杰）

The study of transfection through perfusing bladder of guinea pig with lentivirus

WEI Yanqing，WANG Jiangping，WANG Qinzhang△，QIAN Biao，Ding Guofu
Department of Urology，the First Affiliated Hospital of Shihezi University，Shihezi 832000，China△

ObjectiveTo observe the effects of green fluorescence protein mediated by lentivirus in bladder，and to de?termine the amount of virus obtained good transfection effects.Methodslentivirus carring GFP gene was perfused using transurethral approach into bladder of guinea pigs.Samples of bladder，liver，kidney and lungs were collected for frozen sec?tions after feeding seven days.The distribution of green fluorescence was observed using laser confocal microscopy.Re?sultsThe titer of lentivirus was 4×108.GFP was found under the mucosa when the amount of lentivirus transurethral was 30 μL.GFP was distributed widely in muscle layer using 40 μL lentivirus.GFP was detected even stronger in muscle layer when the amount was 50 μL.GFP was found in muscle layer when 25 μL lentivirus was injected intravenously.GFP was not found in other tissues than in bladder via transurethral perfusion.There was higher GFP in liver，lungs and other organs than in bladder via intravenous injection.ConclusionLentivirus can mediate GFP transfecting bladder of guinea pig successful?ly and escape the distribution of GFP all over the body intravenously，which will bring new research direction and method for clinical treatment of diseases in bladder.

lentivirus infections；urinary bladder；transfection；green fluorescent proteins；guinea pigs

R694

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.014

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360120）

石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科（郵編832000）

魏艷青（1989），男，碩士在讀，主要從事泌尿外科學(xué)的臨床研究

△通訊作者E-mail:wyz1969@sina.com