劉燕秀，趙永忠，李彩，董勇，覃桂金，成秋宸，鄭清華

荔枝核總黃酮對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)NF-κB、α-SMA表達(dá)的影響

劉燕秀，趙永忠△，李彩，董勇，覃桂金，成秋宸，鄭清華

目的研究荔枝核總黃酮（TFL）對轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞T6（HSC-T6）細(xì)胞增殖的影響及其相關(guān)分子機(jī)制。方法0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM+5 μg/L TGF-β1培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液。（1）MTT法檢測細(xì)胞增殖活力。將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)TGF-β1組，對照組（含5‰DMSO），TFL80、160、320、640、800組（80、160、320、640、800 mg/L TFL），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。加藥24、48、72 h后，采用酶標(biāo)儀測定490 nm處各孔吸光度（A）值并計(jì)算細(xì)胞抑制率；根據(jù)半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50）確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度組及藥物作用時(shí)間。（2）采用PCR和Western blot分別檢測HSC-T6細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）mRNA和蛋白的表達(dá)。將細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，設(shè)TGF-β1組，對照組（含5‰DMSO），TFL125、250、500組（125、250、500 mg/L TFL），分組培養(yǎng)48h后測定。結(jié)果同一作用時(shí)間點(diǎn)，隨著TFL濃度的增高，HSC-T6細(xì)胞的A值基本逐漸降低，細(xì)胞抑制率逐漸上升。TGF-β1組NF-κB、α-SMAmRNA和蛋白表達(dá)量與對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TFL125組與TGF-β1組、對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著TFL濃度的增高，HSC-T6細(xì)胞NF-κB、α-SMAmRNA和蛋白表達(dá)量基本逐漸降低。結(jié)論TFL可抑制活化的HSC-T6細(xì)胞增殖，其可能通過抑制NF-κB、α-SMA的表達(dá)來發(fā)揮抗肝纖維化作用。

黃酮類；肝硬化；大鼠；NF-κB；荔枝核總黃酮；肝星狀細(xì)胞；α-平滑肌肌動蛋白

肝纖維化是指以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在肝臟內(nèi)過度沉積。而肝星狀細(xì)胞（Hepatic Stellate Cell，HSC）是肝纖維化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，是肝纖維化的效應(yīng)細(xì)胞，其活化是肝纖維化形成的開端［1-2］。目前，國內(nèi)外主要圍繞以抑制肝星狀細(xì)胞活化、促進(jìn)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡及膠原降解為靶標(biāo)的抗肝纖維化作用開展研究。荔枝核總黃酮（Total Flavone of Li?tchi Chinensis Sonn，TFL）屬于黃酮類提取物，是荔枝核中具有藥理活性的主要成分之一，研究結(jié)果表明TFL在抗肝損傷、抗病毒、抗氧化等方面具有較好的療效［3-5］。本課題組前期研究結(jié)果顯示，TFL對膽汁淤積性肝纖維化大鼠有較好的抗纖維化作用［6-7］。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，探討TFL對活化的大鼠肝星狀細(xì)胞T6（HSC-T6）細(xì)胞增殖的影響作用及相關(guān)分子機(jī)制，為抗肝纖維化中藥開發(fā)與應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器倒置相差顯微鏡（德國蔡司公司），全自動型酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司MLDEL680），梯度PCR儀（美國sigma公司），全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（上海培清JS-780），全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海Tanon 5200）。

1.1.2 HSC-T6細(xì)胞株購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。

1.1.3 藥品TFL購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度80%。

1.1.4 試劑DMEM高糖培養(yǎng)液購自GIBCO公司；胎牛血清FBS購自GEMINI公司；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）購自美國Peprotech公司；Trizol提取盒、Maker購自TIAN GEN公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKa?Ta公司；GAPDH、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear Factor-κB，NF-κB）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）引物由大連寶生物工程公司設(shè)計(jì)及合成；NF-κB單克隆抗體購自BD公司；α-SMA單克隆抗體購自abcan公司；GAPDH單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG抗體、山羊抗兔IgG抗體均購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑的配制（1）含TGF-β1因子培養(yǎng)液的配制。將TGF-β1粉末溶于pH 3.0檸檬酸鈉試劑中，配制成20 μg/L的儲存液（培養(yǎng)液中TGF-β1的終濃度是5 μg/L［8］）。0.22 μm微孔濾器過濾除菌，避光4℃保存。（2）含藥培養(yǎng)液的配制。將TFL粉末溶于二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）試劑中，用含10%FBS的DMEM配制成1 g/L的儲存液；將儲存液用含10%FBS的DMEM+20 μg/L TGF-β1培養(yǎng)液配制成不同藥物濃度（培養(yǎng)液中TGF-β1的終濃度是5 μg/L［8］）；0.22 μm微孔濾器過濾除菌，避光4℃保存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐中取出HSC-T6細(xì)胞凍存管，置于37℃水浴鍋中快速復(fù)溫直至完全融化，接種細(xì)胞于10% FBS的DMEM（含青霉素+鏈霉素）培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2及飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。采用0.25%胰蛋白酶消化傳代，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期即可開始實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測TFL對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM+5 μg/L TGF-β1培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔3 000個(gè)細(xì)胞。12 h后，分組干預(yù)細(xì)胞：（1）TGF-β1組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L TGF-β1。（2）對照組：10% FBS的DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L TGF-β1+5‰DMSO。（3）TFL80組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L TGF-β1+80 mg/L TFL。（4）TFL160組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L TGF-β1+160 mg/L TFL。（5）TFL320組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L TGF-β1+320 mg/L TFL。（6）TFL640組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L TGF-β1+640 mg/L TFL。（7）TFL800組：10%FBS的DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L TGF-β1+800 mg/L TFL。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。待藥物作用24、48、72 h后，分別吸去培養(yǎng)液，各孔加入20 μL的MTT溶液（5 g/L）混勻，37℃培養(yǎng)4 h后，小心吸去上清，于每孔加入DMSO 150 μL混勻，水平搖床振蕩15 min至沉淀完全溶解，用酶標(biāo)儀測定490 nm處各孔吸光度（A）值。依次記錄加藥后24、48、72 h A值并依此計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=（對照組A490值-藥物組A490值）/對照組A490值×100%。并根據(jù)細(xì)胞抑制率計(jì)算藥物對細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50，mg/L）。根據(jù)IC50確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物濃度組及藥物作用時(shí)間。

1.2.4 PCR檢測各組細(xì)胞中NF-κB、α-SMA mRNA的表達(dá)0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM+ 5 μg/L TGF-β1培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，每皿60萬個(gè)細(xì)胞。12 h后，分組干預(yù)細(xì)胞：（1）TGF-β1組。10%FBS的DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L TGF-β1。（2）對照組。10%FBS的DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L TGF-β1+5‰DMSO。（3）TFL125組。10%FBS的DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L TGF-β1+125 mg/L TFL。（4）TFL250組。10%FBS的DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L TGF-β1+250 mg/L TFL。（5）TFL500組。10% FBS的DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L TGF-β1+500 mg/L TFL。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，分別收集各組細(xì)胞，使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA。PCR引物：GAPDH上游序列為5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′，下游序列為5′-GTGGTTCACACCCATCACAA-3′；NF-κB上游序列為5′-CATGCGTTTCCGTTACAAGTG-3′，下游序列為5′-CCCGTGTAGCCATTGATCTT-3′；α-SMA上游序列為5′-GGACGTACAACTGGTATTGTG-3′，下游序列為5′-TCAG?CAGTAGTCACGAAGGAAT-3′。反應(yīng)條件：94℃1 min；94℃30 s，58℃（GAPDH為58℃，NF-κB為57℃，α-SMA為51℃）30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)（GAPDH為30個(gè)循環(huán)，NF-κB為32個(gè)循環(huán)，α-SMA為35個(gè)循環(huán)）；72℃2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色，目的條帶用上海培清JS-780全自動凝膠成像分析系統(tǒng)分析，獲得電泳條帶的灰度值，以NF-κB（α-SMA）與GAPDH的比值作為NF-κB（α-SMA）mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.5 Western blot檢測各組細(xì)胞中NF-κB、α-SMA蛋白表

達(dá)0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM+ 5 μg/L TGF-β1培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，每皿60萬個(gè)細(xì)胞。12 h后，分組（同1.2.4）干預(yù)細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸棄上清，PBS清洗1遍，加入適量RIPA蛋白裂解液（含PMSF），均勻鋪滿皿底，至冰上充分裂解。裂解完全后，采用細(xì)胞刮取皿中蛋白，收集于EP管中，4℃離心后，留取上清即為所提蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳（5%濃縮膠，10%分離膠），電泳完后，通過濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，裁取含目的蛋白的PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h，在目的條帶中加入對應(yīng)的NF-κB、α-SMA和內(nèi)參GAPDH的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，加入辣根過氧物酶標(biāo)記的IgG二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜6 min×5次。ECL化學(xué)發(fā)光顯色，采用上海天能5200全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，獲得目的條帶的灰度值，以NF-κB（α-SMA）與GAPDH的比值作為NF-κB（α-SMA）蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TFL對HSC-T6細(xì)胞增殖的影響分組干預(yù)HSC-T6細(xì)胞24、48、72 h后，TGF-β1組A值與對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在同一作用時(shí)間點(diǎn)，隨著TFL濃度的增高，HSC-T6細(xì)胞的A值基本逐漸降低，細(xì)胞抑制率逐漸上升，見表1。藥物作用HSC-T6細(xì)胞24、48、72 h，IC50分別為1 016、247、248 mg/L。本實(shí)驗(yàn)確定藥物作用時(shí)間為48 h，后續(xù)實(shí)驗(yàn)TFL組濃度為125 mg/L、250 mg/L、500 mg/L。

Tab.1The cell proliferation in different groups of HSC-T6 cells表1 各組HSC-T6細(xì)胞生長增殖情況（n=3，）

Tab.1The cell proliferation in different groups of HSC-T6 cells表1 各組HSC-T6細(xì)胞生長增殖情況（n=3，）

*P＜0.05；a與TGF-β1組比較，b與對照組比較，c與TFL80組比較，d與TFL160組比較，e與TFL320組比較，P＜0.05

組別T G F -β 1組對照組T F L 8 0組T F L 1 6 0組T F L 3 2 0組T F L 6 4 0組T F L 8 0 0組F A值2 4 h 0 . 4 0 ± 0 . 0 3 0 . 4 1 ± 0 . 0 9 0 . 4 1 ± 0 . 0 5 0 . 3 8 ± 0 . 0 5 0 . 3 4 ± 0 . 0 8 0 . 2 9 ± 0 . 0 4 a b c 0 . 2 2 ± 0 . 0 5 a b c d e 4 . 6 2 4 * 4 8 h 0 . 6 7 ± 0 . 1 7 0 . 6 3 ± 0 . 0 4 0 . 5 2 ± 0 . 0 4 a 0 . 3 8 ± 0 . 0 5 a b c e 0 . 2 4 ± 0 . 0 4 a b c d 0 . 1 8 ± 0 . 0 7 a b c d 0 . 1 4 ± 0 . 0 5 a b c d 2 3 . 8 1 7 * 7 2 h 0 . 8 3 ± 0 . 0 8 0 . 8 2 ± 0 . 0 5 0 . 6 6 ± 0 . 0 4 a b 0 . 4 9 ± 0 . 0 7 a b c 0 . 2 8 ± 0 . 0 6 a b c d 0 . 2 6 ± 0 . 0 6 a b c d 0 . 2 3 ± 0 . 0 5 a b c d 5 9 . 5 7 9 *細(xì)胞抑制率（%）2 4 h 4 8 h 7 2 h ------1 . 6 1 7 . 3 7 9 . 7 3 1 4 . 7 0 2 1 . 8 3 -1 7 . 8 1 4 0 . 2 1 6 2 . 4 3 7 0 . 8 9 7 7 . 7 8 -1 9 . 5 0 3 9 . 2 7 6 5 . 9 9 6 8 . 0 2 7 2 . 0 6 -

2.2 TFL對HSC-T6細(xì)胞NF-κB、α-SMAmRNA表達(dá)的影響TGF-β1組NF-κB、α-SMA mRNA表達(dá)量與對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TFL125組與TGF-β1組、對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著TFL濃度的增高，HSC-T6細(xì)胞NF-κB、α-SMA mRNA表達(dá)量基本逐漸降低。見表2、圖1。

Tab.2Comparison of expressions of NF-κB and α-SMA mRNA between different groups of HSC-T6 cells表2 各組HSC-T6細(xì)胞NF-κB、α-SMA mRNA表達(dá)量的比較（n=3，）

Tab.2Comparison of expressions of NF-κB and α-SMA mRNA between different groups of HSC-T6 cells表2 各組HSC-T6細(xì)胞NF-κB、α-SMA mRNA表達(dá)量的比較（n=3，）

*P＜0.05；a與TGF-β1組比較，b與對照組比較，c與TFL125組比較，P＜0.05

組別T G F -β 1組對照組T F L 1 2 5組T F L 2 5 0組T F L 5 0 0組F N F -κ B 0 . 5 5 ± 0 . 0 4 0 . 5 8 ± 0 . 0 6 0 . 5 3 ± 0 . 0 3 0 . 2 3 ± 0 . 0 1 a b c 0 . 1 4 ± 0 . 0 1 a b c 9 4 . 3 4 0 * α -S M A 0 . 3 6 ± 0 . 0 5 0 . 4 1 ± 0 . 0 3 0 . 3 5 ± 0 . 0 6 0 . 2 2 ± 0 . 0 2 a b c 0 . 1 8 ± 0 . 0 2 a b c 2 0 . 2 3 6 *

Fig.1Expressions of NF-κB and α-SMA mRNA in different groups of HSC-T6 cells圖1 PCR法檢測各組HSC-T6細(xì)胞內(nèi)NF-κB、α-SMA mRNA的表達(dá)

2.3 TFL對HSC-T6細(xì)胞NF-κB、α-SMA蛋白表達(dá)的影響TGF-β1組NF-κB、α-SMA蛋白表達(dá)量與對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TFL125組與TGF-β1組、對照組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著TFL濃度的增高，HSC-T6細(xì)胞內(nèi)NF-κB、α-SMA蛋白表達(dá)量基本逐漸降低。見表3、圖2。

3 討論

HSCs屬于肝間質(zhì)細(xì)胞，約占肝臟總細(xì)胞的5%～8%。靜止的HSCs處于非增殖狀態(tài)，不表達(dá)α-SMA。當(dāng)肝臟受到各種損傷時(shí)，處于靜止?fàn)顟B(tài)的HSCs發(fā)生表型改變，轉(zhuǎn)化為具有自身增殖能力的肌成纖維樣細(xì)胞，在損傷部位增殖、遷移，表達(dá)各種信

號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，產(chǎn)生大量ECM，最終導(dǎo)致肝纖維化［9］。目前研究認(rèn)為活化的HSCs是導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展的主要細(xì)胞［1-2］。因此，抑制HSCs的活化及促進(jìn)活化的HSCs凋亡是抗肝纖維化的一種有效途徑。本研究顯示，TFL對活化的HSC-T6細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，并在一定范圍內(nèi)基本呈時(shí)間及劑量依賴性；另外，隨著TFL濃度的增高，藥物組HSC-T6細(xì)胞α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)基本呈下降趨勢，與對照組α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)有明顯差異。而α-SMA是HSCs活化的重要標(biāo)志，以上結(jié)果提示TFL可抑制HSC-T6細(xì)胞的活化，但其具體分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

Tab.3Comparison of expressions of NF-κB and α-SMA between different groups of HSC-T6 cells表3 各組HSC-T6細(xì)胞NF-κB、α-SMA蛋白表達(dá)量的比較（n=3，）

Tab.3Comparison of expressions of NF-κB and α-SMA between different groups of HSC-T6 cells表3 各組HSC-T6細(xì)胞NF-κB、α-SMA蛋白表達(dá)量的比較（n=3，）

*P＜0.05；a與TGF-β1組比較，b與對照組比較，c與TFL125組比較，P＜0.05

α -S M A 0 . 6 7 ± 0 . 0 7 0 . 6 4 ± 0 . 1 3 0 . 5 5 ± 0 . 0 5 0 . 3 8 ± 0 . 1 0ab0 . 3 3 ± 0 . 1 3abc6 . 7 2 2*組別T G F -β 1組對照組T F L 1 2 5組T F L 2 5 0組T F L 5 0 0組F N F -κ B 0 . 4 6 ± 0 . 0 9 0 . 4 6 ± 0 . 0 6 0 . 4 4 ± 0 . 0 3 0 . 2 8 ± 0 . 0 7abc0 . 1 9 ± 0 . 0 1abc1 3 . 4 7 6*

Fig.2Expressions of NF-κB and α-SMA in different groups of HSCT6 cells detected by Western blot assay圖2 Western blot法檢測各組HSC-T6細(xì)胞內(nèi)NF-κB、α-SMA蛋白的表達(dá)

肝纖維化是肝臟損傷后發(fā)生的病理性修復(fù)階段，是眾多因素相互作用、相互影響的慢性炎癥反應(yīng)［10］。NF-κB信號通路是主要的炎癥通路之一，其異常激活與肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)系［11］。NF-κB是一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)因子，細(xì)胞外的許多信號如氧自由基、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1及紫外線等均可激活NF-κB?；罨腘F-κB可通過核孔進(jìn)入到細(xì)胞核，結(jié)合到靶基因的κ結(jié)構(gòu)域，引起相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB信號通路激活后可調(diào)控下游靶基因，如促炎因子、黏附因子、生長因子、趨化因子等的表達(dá)，從而加重炎癥反應(yīng)。靜止?fàn)顟B(tài)的HSCs核內(nèi)無NF-κB的表達(dá)，然而活化態(tài)的、α-SMA陽性的HSCs內(nèi)出現(xiàn)NF-κB的核轉(zhuǎn)位活性［12］。慢性肝病發(fā)生時(shí)，由于存在多種炎癥因子的誘導(dǎo)作用，NF-κB處于持續(xù)激活狀態(tài)，加重肝臟內(nèi)炎癥反應(yīng)，呈現(xiàn)正反饋效應(yīng)，形成肝損傷惡性循環(huán)，從而加快了肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

Wan等［13］報(bào)道自樺脂酸可明顯抑制腹腔注射硫代乙酰胺肝纖維化動物模型中NF-κB的活性，從而提出通過調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路達(dá)到預(yù)防及治療肝纖維化的作用。李倩［14］報(bào)道白藜蘆醇可明顯抑制經(jīng)LPS活化的肝星狀細(xì)胞增殖，并可明顯減少TLR4、MyD88蛋白的表達(dá)，最終減少NF-κB因子的轉(zhuǎn)錄與活化，以達(dá)到其抗肝纖維化的作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，HSC-T6細(xì)胞經(jīng)TGF-β1激活后大量表達(dá)NF-κB，給予TFL干預(yù)后，TFL250組及TFL500組HSC-T6細(xì)胞NF-κB mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低。因此，筆者推測TFL抑制HSC-T6細(xì)胞的活化可能是通過抑制HSC-T6細(xì)胞內(nèi)NF-κB因子的表達(dá)，以減輕HSC-T6細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮其抗肝損傷及抗肝纖維化的作用。

綜上所述，TFL可抑制HSC-T6細(xì)胞的活化。其機(jī)制可能與TFL靶向抑制NF-κB蛋白通路有關(guān)，但其具體作用機(jī)制仍不明確，尚有待于進(jìn)一步研究。

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（2015-05-08收稿 2015-06-13修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effects of the total flavone of litchi chinensis sonn on expressions of NF-κB and α-SMA in TGF-β1 activated rat hepatic stellate cells

LIU Yanxiu，ZHAO Yongzhong△，LI Cai，DONG Yong，QIN Guijin，CHENG Qiuchen，ZHENG Qinghua
Department of Digestive Medicine，The Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guangxi Guilin 541001，China△

ObjectiveTo investigate the effects of total flavonoids of litchi chinensis sonn（TFL）on cell proliferation and the molecular mechanism in rat hepatic stellate cells（HSC-T6）activated by growth factor-β1（TGF-β1）.MethodsHSC-T6 cells were treated by 0.25%Trypsin-EDTA and then were digested into single cell suspension by DMEM（10%FBS included），which were mixed with TGF-β1（5 μg/L）.（1）MTT method was used to detect the proliferation of HSC-T6 cells.Cells were cultured in 96-well plate and were treated by different concentrations of TFL including TGF-β1 group，the control group（5‰DMSO included），and different concentrations of TFL groups（80，160，320，640 and 800 mg/L TFL）.Each group has three wells.The absorbance（A）value was measured by enzyme standard meter at the 490 nm wavelength after 24 h，48 h and 72 h treatment.The cell inhibitory rate was calculated.The subsequent experimental drug concentration and drug treatment time were determined according to half inhibitory concentration（IC50）.（2）The expression levels of NF-κB and α-SMA mRNA were detected by PCR（for mRNA）and Western blot assay（for protein）.Cells were cultured in the 10 cm culture dish and were divided into different TGF-β1 groups，including TGF-β1 group，the control group（5‰DMSO included），and different concentrations of TFL groups（125，250 and 500 mg/L TFL）.After 48 h，related indicators were measured.ResultsAt the same treatment time point，with the increased concentrations of TFL，A values were gradually decreased，and the cell inhibitory rates were gradually increased. There were no significant differences in the expressions of NF-κB and α-SMA mRNA between TGF-β1 group and control group. And there were no significant differences in the expressions of NF-κB and α-SMA mRNA between TFL125 group，TGF-β1 group and control group.There was a gradually decrease in the expressions of NF-κB and α-SMA mRNA and protein with the increased concentrations of TFL.ConclusionTFL can inhibit TGF-β1-induced HSC-T6 cell proliferation，which is involved in the inhibited expressions of NF-κB and α-SMA to anti-fibrotic effects in liver fibrosis.

flavones；liver cirrhosis；rats；NF-kappa B；total flavone of litchi chinensis sonn；hepatic stellate cell；αsmooth muscle actin

R575

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.11.010

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360659）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012GXNSFAA053105）

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（郵編541001）

劉燕秀（1989），女，碩士在讀，主要從事慢性肝病的基礎(chǔ)與臨床研究

△通訊作者E-mail：13607736670@163.com