石曉雷，馬依拉·吐爾遜，劉春潔，米亞沙熱·迪里木熱提，田月珍，詹振宏，艾買提·買買提，黃錫霞，田可川

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830000）

遺傳育種

中國(guó)美利奴羊（新疆型）KRT27基因的多態(tài)性及其與毛細(xì)度性狀關(guān)聯(lián)分析

石曉雷1，馬依拉·吐爾遜1，劉春潔1，米亞沙熱·迪里木熱提1，田月珍1，詹振宏1，艾買提·買買提1，黃錫霞1，田可川2

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊 830000）

實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR-SSCP技術(shù),對(duì)中國(guó)美利奴羊（新疆型）KRT27基因的多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)不同基因型與中國(guó)美利奴羊（新疆型）羊毛細(xì)度性狀間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:外顯子5的一段長(zhǎng)度為122 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析后出現(xiàn)了兩種基因型AA和AB，存在兩種等位基因A和B；AA基因型和AB基因型在中國(guó)美利奴羊（新疆型）中的頻率分布分別為0.86和0.14，等位基因A、B的基因頻率分別為0.93和0.07，表明A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因；所研究群體在該位點(diǎn)上處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。不同基因型的個(gè)體間羊毛細(xì)度性狀沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。

中國(guó)美利奴羊（新疆型)；KRT27基因；多態(tài)性；羊毛細(xì)度

中國(guó)美利奴羊（新疆型）是以澳洲美利奴公羊與波爾華斯羊、新疆細(xì)毛羊通過(guò)雜交培育而成，自從1985年育成之后，逐漸成為新疆地區(qū)細(xì)毛羊的主要品種［1］。該品種體格大，呈長(zhǎng)方型；被毛白色，呈毛叢結(jié)構(gòu)，密度大，細(xì)度60～70支，以64～66支為主。利用動(dòng)物個(gè)體表型差異和基因型差異之間的關(guān)聯(lián)性來(lái)預(yù)測(cè)影響動(dòng)物性狀的主效基因已經(jīng)成為較為重要的現(xiàn)代育種方式之一。KRT是keratin intermediate filament的縮寫形式，又可寫為KRT-IF（角蛋白中間絲蛋白），是角蛋白家族的重要成員，是形成毛發(fā)、角和指甲的主要成分［2］。KRT-IF有I型（酸性）和Ⅱ型（堿性）兩種類型，I型KRT-IF基因含有4～5 kb個(gè)堿基對(duì)，有6個(gè)內(nèi)含子；II型KRT-IF基因含有7～9 kb個(gè)堿基對(duì)，有8個(gè)內(nèi)含子；KRT27基因?qū)儆冖裥突?。Bawden等［3］將帶有標(biāo)簽的毛角蛋白Ⅱ型中間絲（keratintypeⅡintermediate filament，KIFⅡ）基因?qū)刖d羊，獲得的轉(zhuǎn)基因綿羊羊毛品質(zhì)得到顯著改善，毛纖維具有較高的光澤和顯著的柔韌性。利用原位雜交對(duì)其研究表明，I型IFs在綿羊毛囊內(nèi)根鞘表達(dá)豐富，Ⅱ型KRT-IF在皮層高效表達(dá)，而改變羊毛纖維的微觀結(jié)構(gòu)和宏觀結(jié)構(gòu)，包括增加羊毛的光澤度和降低羊毛的彎曲度及細(xì)度［4］。Langbein L等［5］報(bào)道在人類毛發(fā)中角蛋白KRT38分布在皮質(zhì)層的皮質(zhì)細(xì)胞中，KRT38基因表達(dá)的角蛋白是低硫蛋白，它們形成了毛發(fā)纖維的微原纖維成分。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)綿、山羊KRT基因的研究主要集中在基因克隆和表達(dá)方面，Grant W等［6］采用PCR-SSCP技術(shù)研究5'非翻譯區(qū)（UTR）綿羊KRT2.13基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)不同類型的突變，并且影響基因表達(dá)和羊毛性狀。吳茜［7］構(gòu)建了新吉細(xì)毛羊皮膚組織全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，通過(guò)序列表達(dá)標(biāo)簽測(cè)序發(fā)現(xiàn)KRT27基因可能影響綿羊毛性能。本研究就是在此基礎(chǔ)上，將KRT27基因作為候選基因，采用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)中國(guó)美利奴羊（新疆型）的KRT27基因多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)不同基因型與中國(guó)美利奴羊（新疆型）的羊毛細(xì)度性狀之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了分析，以期探索是否存在與羊毛細(xì)度有關(guān)的SNP位點(diǎn)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與數(shù)據(jù)來(lái)源實(shí)驗(yàn)對(duì)象為中國(guó)美利奴羊（新疆型），由新疆鞏乃斯種羊場(chǎng)提供，共206只，均為成年母羊。靜脈采血3～5 mL，EDTA抗凝冷凍保存、備用。收集并整理在新疆鞏乃斯種羊場(chǎng)2007—2008年的中國(guó)美利奴羊（新疆型）羊毛細(xì)度鑒定記錄。

1.1.2主要試劑和設(shè)備Taq DNA聚合酶、dNTPs、10× PCR Buffer、Marker D2000等均為生工生物公司產(chǎn)品；My Cycler型PCR儀；DYY-6C型電泳儀；Gel Doc 2000型凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取采用常規(guī)的苯酚/氯仿法制備，所提取的基因組DNA利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取結(jié)果的完整性。用分光光度計(jì)測(cè)定其濃度值及OD260/OD280值，取濃度大于50 μg/mL，OD260/OD280值在1.8～2.0間的樣品-20℃冷凍備用。并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行完整性檢測(cè)，用分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)。

1.2.2引物設(shè)計(jì)合成根據(jù)牛的KRT27基因（GenBank登錄號(hào)-001075815）外顯子5序列，用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，序列為上游引物：5'-GCGGATGTCAGTAGTTTGC-3'；下游引物：5'-TCTCCTCCTCGTGGTTCTT-3'。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.3PCR反應(yīng)體系的建立及擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：基因組DNA 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 1.6 μL，上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，加滅菌純水至總體積為20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，50.3℃30 s，72℃30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用于SSCP分析。

1.2.4聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)適量PCR產(chǎn)物經(jīng)變性處理后，通過(guò)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠在0.5×TBE條件下進(jìn)行電泳。電壓180 V，電泳14～16 h。電泳結(jié)束后取下凝膠，進(jìn)行固定、銀染和顯色。觀察分析不同的帶型并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并保存。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)SSCP檢測(cè)結(jié)果判定基因型（AA型和AB型）。應(yīng)用EXCEL軟件分析其基因頻率、基因型頻率和其他遺傳特性。應(yīng)用SAS軟件分析KRT27不同基因型與中國(guó)美利奴羊（新疆型）羊毛細(xì)度之間的相關(guān)性。

2　結(jié)果與分析

2.1中國(guó)美利奴羊（新疆型）KRT27基因PCR檢測(cè)以綿羊基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為122 bp的特異條帶。從圖1可以看出，PCR擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致，而且沒(méi)有非特異性擴(kuò)增條帶，一致性較好，可以用于多態(tài)性檢測(cè)。

圖1　KRT27基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

2.2KRT27基因的SSCP多態(tài)性檢測(cè)

將擴(kuò)增的KRT27基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR-SSCP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該片段在中國(guó)美利奴羊（新疆型）群體中存在兩種基因型，分別命名為AA、AB型，見圖2。

圖2　KRT27基因擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR-SSCP電泳圖

2.3KRT27基因在中國(guó)美利奴羊（新疆型）的頻率分布

統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示，在中國(guó)美利奴羊（新疆型）品種中檢測(cè)到AA和AB兩種基因型，卡方檢驗(yàn)表明中國(guó)美利奴羊（新疆型）群體在該位點(diǎn)上處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05）。

表1　KRT27基因的基因型頻率和等位基因頻率

處理后的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)分析計(jì)算得到KRT27基因片段在樣本含量為206的中國(guó)美利奴羊群體中的遺傳特性為：基因純合度為0.87，基因雜合度為0.13，有效等位基因數(shù)為1.15，多態(tài)信息含量為0.122。根據(jù)確定位點(diǎn)多態(tài)性的標(biāo)準(zhǔn)：PIC<0.25，為低度多態(tài)位點(diǎn)；0.250.5，為高度多態(tài)位點(diǎn)。表明本試驗(yàn)中KRT27基因?qū)儆诘投榷鄳B(tài)位點(diǎn)。

2.4不同基因型與羊毛細(xì)度的關(guān)聯(lián)分析

實(shí)驗(yàn)對(duì)不同基因型與中國(guó)美利奴羊（新疆型）羊毛細(xì)度性狀的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：不同基因型個(gè)體細(xì)度性狀無(wú)顯著差異（P>0.05）。

表2　KRT27基因不同基因型之間差異顯著性檢驗(yàn)

3　討論

3.1實(shí)驗(yàn)分析方法的探討

PCR-SSCP技術(shù)是已經(jīng)相當(dāng)成熟的研究基因多態(tài)性的技術(shù)，如果已知基因及其可能的調(diào)控功能，則可以利用該技術(shù)進(jìn)行基因型和動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析，從而驗(yàn)證基因?qū)π誀畹挠绊?，從?cè)面反映基因的調(diào)控機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)PCR-SSCP分析，結(jié)果產(chǎn)生兩種帶型，AA和AB，這兩種基因型對(duì)中國(guó)美利奴羊（新疆型）細(xì)度性狀沒(méi)有顯著差異（P>0.05），因此，KRT27作為中國(guó)美利奴羊（新疆型）羊毛細(xì)度性狀的候選基因不合適。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)自鞏乃斯種羊場(chǎng)，采集的樣本較少、區(qū)域較集中，只能反映所研究群體的遺傳特性，不足以代表中國(guó)美利奴羊（新疆型）的群體特性。本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行PCR的引物設(shè)計(jì)時(shí)用牛的基因序列作為源序列，原因在于NCBI中的GenBank中尚未錄入綿羊的KRT27基因序列，因此選取近緣牛序列中作為引物設(shè)計(jì)的源序列，在理論上雖然誤差較大，但是是可行的。

3.2有關(guān)研究的探討

目前對(duì)KRT基因進(jìn)行的研究方面，在綿羊上，類型I（KRT1.n）和類型Ⅱ（KRT2.n）已經(jīng)被定位于11號(hào)和3號(hào)染色體上，這種物理圖譜已經(jīng)通過(guò)連鎖分析得到了證實(shí)［2］。田月珍［9］的研究結(jié)果顯示，KRT26可以作為羊毛細(xì)度性狀的候選基因，且在皮膚組織中的表達(dá)上調(diào)，即羊毛細(xì)度越細(xì)，基因的表達(dá)量越低。作為同樣為編碼羊毛纖維的結(jié)構(gòu)蛋白，KAP（keratin-associated proteins，KAPs）和KRT都作為了調(diào)控羊毛細(xì)度性狀的候選基因。許漢峰［10］以新疆不同毛品質(zhì)的綿羊?yàn)檠芯炕A(chǔ)，利用相似的技術(shù)對(duì)KAP基因進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析，結(jié)果表明不同基因型在羊毛長(zhǎng)度性狀上差異不顯著，但其推斷可能會(huì)在羊毛細(xì)度上存在差異。國(guó)外的研究結(jié)果表明，羊毛品質(zhì)的調(diào)控是在KRTⅠ、Ⅱ共同參與的［11］。因此推斷，KRT基因不是獨(dú)立的調(diào)控而是不同的KRT基因共同起調(diào)控作用，甚至也會(huì)和其他的某些基因也有相互作用，這方面還有待進(jìn)一步研究。

3.3下一步的實(shí)驗(yàn)思路

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的突變基因帶型過(guò)少，可能是引物擴(kuò)增的的片段不全。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果只能說(shuō)明引物擴(kuò)增的片段內(nèi)不同基因型在羊毛的細(xì)度上沒(méi)有顯著差異，但其他基因片段是否存在突變能夠影響羊毛細(xì)度，需擴(kuò)大KRT27基因的檢測(cè)范圍。進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)的目的是為了最終找到與羊毛性狀有關(guān)的SNP位點(diǎn)，而不同基因的多態(tài)性與羊毛生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)性分析在大樣本的情況下才具備可靠性。接下來(lái)的進(jìn)一步工作可以增加樣本數(shù)量，提高關(guān)聯(lián)性分析的可靠性；還可以在確定有顯著關(guān)聯(lián)的基因上進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)序分析其突變類型?；蛘邔?duì)不同品種相同基因進(jìn)行對(duì)比尋找其基因差異和性狀差異之間的關(guān)聯(lián)。當(dāng)前生物技術(shù)迅猛發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)使得全基因組測(cè)序或者全基因測(cè)序成為現(xiàn)實(shí)。這樣尋找SNP突變位點(diǎn)更加全面準(zhǔn)確，本實(shí)驗(yàn)中的基因型對(duì)毛細(xì)度影響不顯著，因此沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)序分析。

4　結(jié)論

KRT27基因中存在AA、AB兩種基因型?；蛐皖l率分別為0.86和0.14；等位基因A、B的基因頻率分別為0.93和0.07。KRT27基因中，基因純合度為0.87，雜合度為0.13，基因的PIC為0.122，屬于低度多態(tài)位點(diǎn)。中國(guó)美利奴羊（新疆型）中不同基因型個(gè)體羊毛細(xì)度性狀沒(méi)有顯著差異（P>0.05）。

［1］ 李武臣，宮平，高維明，等.中國(guó)美利奴羊（新疆型）毛密品系主要生產(chǎn)性能遺傳力估測(cè)［J］.新疆畜牧業(yè)，2009，5：25-26.

［2］ McLaren R J，Rogers G R，Davies K P，et al.Linkage mapping of wool keratin and keratin-associated protein genes in sheep［J］.Mammalian Genome，1997，8：938-940.

［3］ Bawden C S，Sivaprasad A V，Verma P J，et a1.Expression of bacterial cysteine biosynthesis genes in transgenic mice and sheep：toward a new invivo amino acid biosynthesis pathway and improved wool growth［J］. Transgenic Research，1995，4（2）：87-104.

［4］Bawden C S，McLaughlan C，Nesei A，et al.A unique type I keratin intermediate filament gene family is abundantly expressed in the inner roots heaths of sheep and human hair follicles［J］.The Journal of Investigative Dermatology，2001，116（1）：157-166.

［5］ Langbein L，Rogcrs MA，Winter H，et al.The catalogue of human hair keratins.Expression of the nine type Ⅰ members in the hair follicle［J］. Journal of Biological Chemistry，1999，274：19874-19884.

［6］ Grant W Mckenzie，Reena Arora，Jon G H Hickford.Genetic variation in the 5′UTR of the KRT2.13 gene of sheep［J］.Animal Science Journal，2012，83（3）：194-198.

［7］ 吳茜.新吉中國(guó)美利奴羊皮膚組織均一化全長(zhǎng)CDNA文庫(kù)的構(gòu)建及其ESTs的生物信息分析［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［8］ 劉桂芳.新疆優(yōu)質(zhì)中國(guó)美利奴羊遺傳多樣性及羊毛細(xì)度候選基因的分析［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［9］ 田月珍.中國(guó)美利奴羊（新疆型）羊毛細(xì)度相關(guān)候選基因的篩選及其關(guān)聯(lián)性分析［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［10］許漢峰.角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（KAP和KRT）與羊毛品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性研究［D］.石河子：石河子大學(xué)，2008.

［11］Herrmann H，Hesse M，Reichenzeller M，et a1.Functional complexity of intermediate filament cytoskeletons：from structure to assembly to gene ablation［J］.Int Rev Cytol，2003（223）：83-175.

《中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)》雙月刊

《中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)》是由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部主管、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所主辦的國(guó)家級(jí)科技核心期刊。于2012年4月由《中國(guó)草食動(dòng)物》更名而成?！吨袊?guó)草食動(dòng)物科學(xué)》為美國(guó)《化學(xué)文摘》（CA）收錄期刊，中國(guó)科技核心期刊，中國(guó)農(nóng)業(yè)核心期刊，RCCSE中國(guó)核心（擴(kuò)展板）學(xué)術(shù)期刊；是中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(kù)（CSCD）、中國(guó)科技論文與引文數(shù)據(jù)庫(kù)、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)（CAJCED）和中國(guó)生物學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)源期刊。

《中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)》在原《中國(guó)草食動(dòng)物》的基礎(chǔ)上，立足西部，充分利用研究所的區(qū)位優(yōu)勢(shì)，提高期刊核心競(jìng)爭(zhēng)力，建立適應(yīng)市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)體制的與國(guó)際接軌的全新辦刊理念，及時(shí)、準(zhǔn)確地反映草食動(dòng)物科技進(jìn)步的方向，增強(qiáng)在國(guó)內(nèi)外同行中的影響力和競(jìng)爭(zhēng)力，更好地滿足廣大科研、教學(xué)與畜牧生產(chǎn)者的需求，服務(wù)我國(guó)節(jié)糧型動(dòng)物養(yǎng)殖和畜牧業(yè)發(fā)展。

《中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)》主要刊登牛、羊、馬、駱駝、鹿、兔、鴨、鵝、駝鳥、魚等各種節(jié)糧型草食動(dòng)物的最新科研成果和科技成就。主要欄目：遺傳育種，繁殖與生理，營(yíng)養(yǎng)與飼料，草地與牧草，疾病防控，專論與綜述。

《中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)》為雙月刊，大16開，80頁(yè)碼，彩色封面，每期定價(jià)8.00元，全年48.00元，雙月1日出版。國(guó)內(nèi)統(tǒng)一刊號(hào)：CN62-1206/Q，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)刊號(hào)：ISSN2095-3887,郵發(fā)代號(hào):54—57,國(guó)外代號(hào):BM5133。全國(guó)郵局和本刊編輯部均可訂閱。

地址：甘肅省蘭州市七里河區(qū)鹼溝沿335號(hào)郵編：730050

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Polymorphism of KRT27 Gene and Its Relationship with Fineness Traits in Chinese Merino Sheep（Xinjiang Type）

Shi Xiaolei1，Huang Xixia1，Tian Kechuan2，et al
（1.College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China；2.Institute of Animal Science，Xinjiang Academy of Animal Sciences，Urumqi 830000，China）

In this study，PCR-SSCP analysis was used to identify genetic variation in KRT27 in Chinese Merino（Xinjiangtype），and the relationship with fineness traits were analyzed.The results showed that a PCR product of 122 bp corresponding to partial exon 5 had two genotypes，and the frequencies of the genotype AA，AB and allele A，B in Chinese Merino sheep（Xinjiang type）were 0.86，0.14 and 0.93，0.07 respectively，and the A allele was dominant allele.The polymorphic locus of KRT27 gene was at Hardy-Weinberg equilibrium（P>0.05）in the breed.The individuals of genotype AA，AB had no significant difference in the fineness traits（P>0.05）.

Chinese Merino（Xinjiangtype）；KRT27 gene；polymorphism；fineness

S826.2

A

2095-3887（2015）02-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.02.001

2014-12-10

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-40）；農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2012GB2G400493）；緊缺人才專業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（jqrcp32010021）

石曉雷（1989-），男，在讀碩士研究生。

黃錫霞（1963-），女，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：動(dòng)物遺傳育種；田可川（1963-），男，研究員。研究方向：細(xì)毛羊育種。