宋紅麗，鄭衛(wèi)萍，楊洋，劉濤，吳本娟，付楠楠，張友成，沈中陽

（1.天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植重點實驗室，天津 300192；2.天津市兒童醫(yī)院，天津 300074）

目前肝移植術(shù)后預防乙型肝炎（乙肝）復發(fā)的常用方案為小劑量乙肝免疫球蛋白（HBIG）聯(lián)合核苷類似物，并取得了良好的效果［1］。但是長期應用HBIG和核苷類似物藥物費用很高，對患者和社會來說負擔沉重；同時作為生物制品的HBIG日益短缺，使部分患者不能堅持有效預防乙肝復發(fā)的方案，而且長期使用核苷類似物容易導致病毒耐藥［2］。術(shù)后乙肝疫苗的應用，使患者看到了停用抗病毒藥物及HBIG的可能性，但是目前由于移植術(shù)后免疫抑制劑的使用，使乙肝疫苗治療有效性較差［3-4］。如果能夠?qū)ふ页鼋?jīng)濟有效的新方法，從而使乙肝患者移植術(shù)后徹底停用抗病毒藥物，將在該領(lǐng)域取得突破，獲得重大的經(jīng)濟和社會效應。

肝移植是各類終末期肝臟疾病的主要治療手段，在中國，其中70%～80%為乙型肝炎病毒（HBV）導致［5］，患者通常在等待肝移植手術(shù)時機的同時接受抗病毒治療以降低體內(nèi)HBV DNA的復制水平［6］，同時術(shù)前HBV DNA的水平也是術(shù)后HBV復發(fā)的重要預測指標。因此，提高患者主動免疫力、降低等待移植患者體內(nèi)HBV DNA水平，已成為預防術(shù)后乙肝復發(fā)的重要目標。樹突狀細胞（DC）是機體內(nèi)能激活初始T細胞主要的抗原呈遞細胞（APC），其強大的抗原呈遞能力是連接機體固有免疫和適應性免疫的橋梁［7］，因此，DC在各類病毒感染、腫瘤免疫中扮演著重要角色［8］。DC作為體內(nèi)功能最強大的APC，可以通過對抗原的攝取、加工處理呈遞給T細胞啟動相應性免疫應答，從而增強患者體內(nèi)特異性殺傷HBV的能力，提高患者的主動免疫力。T細胞亞群的調(diào)節(jié)紊亂，也是HBV在體內(nèi)持續(xù)復制的主要原因［9］。本研究主要通過觀察轉(zhuǎn)HBV基因小鼠DC刺激自體淋巴細胞對體外HBV復制，尤其對cccDNA的作用，來評價HBV感染后特異性免疫功能的變化及其與HBV復制水平的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑：FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；酶標儀（美國Biotek公司）；DC生成培養(yǎng)基DXF（德國PromoCell公司）；淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；胎牛血清（FBS，奧地利PAA公司）；干擾素（IFN）-γ-APC、白細胞介素（IL）-4-藻紅蛋白（PE）單抗（美國BD Pharmingen公司）；CD80-APC/CD86-FITC/CD11C-FITC MHC-Ⅱ-PE/CD83-PE（美國BD公司）；乙肝核心抗原/乙肝表面抗原（HBcAg/HBsAg）（英國 Peprotech公司）；IL-10、IL-2和IFN-γ的ELISA試劑盒（中國Biovalue公司）。

1.2 研究對象：HBV全基因轉(zhuǎn)基因C57 BL/6J小鼠［10］由上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司提供；HepG 2.2.15細胞株由北京軍區(qū)302醫(yī)院贈送。

1.3 實驗分組：A組為淋巴細胞（LC）+未成熟DC組；B組為HepG 2.2.15 +未成熟DC + LC組；C組為LC +負載HBV相關(guān)抗原刺激的成熟DC組（成熟DC組）；D組為HepG 2.2.15 +成熟DC + LC組；E組為HepG 2.2.15組。

1.4 實驗方法

1.4.1 淋巴細胞的獲?。簾o菌制備C57BL/6J小鼠脾和胸腺的細胞懸液，將淋巴細胞懸液移到離心管中的細胞分離液（Percoll）淋巴細胞分離液上面，使其具有明顯分層。以2 000 r/min離心20分鐘，吸取中間白膜層，再以1 000 r/min離心8分鐘，棄去上清。最后用含0.05%吐溫-20的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，計數(shù)后加入培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)板中共培養(yǎng)。

1.4.2 提取HBV轉(zhuǎn)基因鼠的DC進行培養(yǎng)及形態(tài)學觀察：取6～8周（體重18～22 g）的HBV全基因轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠，斷頸椎處死，按以下步驟進行操作：取股骨及脛骨骨髓，PBS沖洗，離心棄上清，收集骨髓細胞；加入5 ml已預熱37℃的紅細胞裂解液，除去紅細胞；加入5倍體積RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋，離心（1 500 r/min，5分鐘）；用含100 ml/L 胎牛血清（FCS）的RPMI 1640的完全培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細胞密度為1×109/L，加入到6孔板中，每孔2 ml；37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)液，同時添加rGM-CSF（終濃度為 10 ng/ml）和 rIL-4（1 ng/ml）于骨髓細胞中；第2天去除未貼壁的細胞；第4天半量換液，并補充細胞因子rGM-CSF和rIL-4（濃度同前）；第6天成為不成熟的DC，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和數(shù)量變化。

1.4.3 成熟的DC獲取：將培養(yǎng)至第8天的DC分別用HBV相關(guān)蛋白HBsAg（19.6 μg/ml）和HBcAg（10 μg/ml）誘導，第10天細胞即轉(zhuǎn)為帶有HBV的抗原成熟的DC。通過流式細胞儀檢測DC表面標志物CD80、CD86、CD83等的表達。

1.4.4 免疫效應細胞（IEC）的制備及檢測：成熟的DC刺激自體淋巴細胞（DC︰淋巴細胞＝1︰10），經(jīng)過10余天的培養(yǎng)及活化，制備成IE細胞（CD8+為主）并進行不斷的分裂與增殖。應用流式細胞儀測定淋巴細胞表面標志物。

1.4.5 ELISA法檢測上清中的IL-10/IFN-γ/IL-2的分泌：按照試劑盒說明書步驟來操作，顯色后在450 nm波長下檢測吸光度（A）值。

1.4.6 IEC與HepG 2.2.15細胞進行混合培養(yǎng)，并檢測免疫細胞對HepG 2.2.15細胞中cccDNA及HBV DNA水平的影響：免疫效應細胞與HepG 2.2.15細胞混合于6孔板，效靶比為1︰10，在37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24、48和72小時，每組設(shè)3個空白孔。收集混合細胞上清及細胞，進行cccDNA及HBV DNA水平的檢測。

1.4.7 流式細胞儀檢測DC表面分子：用流式細胞儀對DC表面標志物CD80/CD83/CD86、MHCⅡ/CD11C進行檢測，按試劑盒說明書進行操作。

1.4.8 生物化學方法檢測上清液的肝功能指標。

1.4.9 實時熒光定量PCR方法檢測血清及細胞內(nèi)HBV DNA：使用ABI 7500實時定量PCR儀（Applied Biosystems），操作按PCR試劑盒說明書進行（上海Kehua公司）。

1.4.10 HBV共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）檢測：采用實時定量PCR方法檢測細胞內(nèi)的cccDNA，具體方法見參考文獻［11］。

1.5 統(tǒng)計學處理：采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用GraphPad Prism5軟件做圖。

2 結(jié) 果

2.1 檢測HBV全基因轉(zhuǎn)基因C57BL/6J小鼠血清的HBsAg、HBeAg、HBV DNA均陽性，而肝細胞內(nèi)的cccDNA陰性。肝功能、腎功能等正常。

2.2 成功獲取轉(zhuǎn)HBV基因鼠骨髓中的DC細胞

2.2.1 DC形態(tài)學變化：第1天，鏡下觀察可見貼壁的圓形單核細胞，細胞體積小，數(shù)量多，無突觸；第3天，細胞體積逐漸變大，由規(guī)則的圓形向長條狀進展；第6天，細胞體積明顯增大，細胞表面伸出短的突觸（圖1a）。按第6天DC細胞是否負載HBsAg和HBcAg抗原肽分為負載抗原成熟組和未負載抗原未成熟組，第8天負載抗原成熟組的細胞大量懸浮，小而圓的單核細胞逐漸消失，細胞表面都伸出兩個或多個突觸，細胞體積大，突觸明顯，未分化的單核細胞較少（圖1b）。圖1c、1d顯示出由未成熟到成熟的DC表型的典型變化。

2.2.2 DC表面標志的變化（表1）：與培養(yǎng)6天未成熟DC相比，負載抗原成熟的DC表面標志物CD11c/MHC-Ⅱ、CD83、CD80、CD86的表達在成熟DC中均明顯增高（均P＜0.05），說明在體外環(huán)境HBV相關(guān)抗原可以刺激體外DC的成熟。

圖1 未成熟與成熟DC形態(tài)比較（a、b均為低倍放大）

表1 未成熟DC與成熟DC表型變化比較（±s）

表1 未成熟DC與成熟DC表型變化比較（±s）

注：與未成熟DC組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

標志物 樣本數(shù) 未成熟DC 成熟DC CD11c+MHC-Ⅱ+ 3 45.77±4.53 95.50± 4.07 CD80 3 20.07±2.66 64.00±10.66 b CD86 3 16.37±6.91 29.77± 4.48 a CD83 3 86.83±2.89 98.37± 0.97 b

2.3 特異性效應性淋巴細胞對HepG 2.2.15細胞的肝功能及上清HBV DNA的影響：

2.3.1 D組與B組細胞上清液HBV DNA變化 （表2；圖2）：D組在24、48和72小時細胞上清HBV DNA均較E組明顯下降（均P＜0.01），B組細胞上清HBV DNA水平也較E組有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。說明特異性的成熟DC刺激的淋巴細胞能有效地抑制體外HBV的釋放，但與B組相比，D組作用更顯著。

表2 各組不同時間點細胞上清液HBV DNA變化（±s）

表2 各組不同時間點細胞上清液HBV DNA變化（±s）

組別 樣本數(shù) HBV DNA（×106）24小時 48小時 72小時D 組 3 0.95±0.07 1.10±0.58 1.04±0.16 B 組 3 1.99±1.18 1.80±0.12 1.90±0.25 E 組 3 3.45±0.50 2.82±1.17 4.09±1.99

2.3.2 各組間肝臟酶學的變化（圖2）：在48和72小時B組和D組肝細胞丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平有下降趨勢，與E組相比差異有統(tǒng)計學意義。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平雖然有上升趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學意義。說明免疫細胞與異種肝細胞之間混合培養(yǎng)，并不能導致細胞間的排斥反應發(fā)生，可能有保護肝細胞膜的作用。

2.4 特異性免疫效應淋巴細胞對HepG 2.2.15細胞內(nèi)HBV DNA和cccDNA的影響（表3）：成熟DC與LC作用（C組）24、48和72小時后，HepG 2.2.15細胞內(nèi)的HBV DNA和cccDNA表達均明顯下降，與E組相比差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。未成熟DC與LC作用（A組）24、48和72小時后的HepG 2.2.15細胞內(nèi)的HBV DNA和cccDNA表達亦均有下降，但與E組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果提示由HBV相關(guān)蛋白刺激的轉(zhuǎn)HBV基因鼠的DC刺激自體淋巴細胞后對體外HepG 2.2.15細胞中的HBV有顯著的抑制作用，對細胞內(nèi)HBV cccDNA的復制及HBV DNA的分泌均有抑制作用。而未成熟DC組抑制HBV復制作用較成熟DC組作用弱。B組與D組在24、48和72小時對HBV DNA和cccDNA均有抑制作用，D組的作用更明顯，與E組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而B組與E組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組對HepG 2.2.15細胞上清的肝功能與HBV DNA的影響

表3 各組不同時間點對HepG 2.2.15細胞內(nèi)HBV DNA和cccDNA的影響

2.5 各組淋巴細胞亞群的變化（圖3）：將成熟DC或不成熟DC與淋巴細胞共刺激后再與HepG 2.2.15細胞共培養(yǎng)，觀察CD3+CD4+、CD3+CD8+及CD3+CD4+/ CD3+CD8+比值的變化，結(jié)果提示，隨著DC由不成熟到成熟，CD3+CD4+及CD4+/ CD8+比值先下降后升高；而CD3+CD8+比例變化不明顯。說明成熟DC刺激的淋巴細胞在24小時以CD3+CD8+作用為主發(fā)揮免疫作用，48小時以后則以CD3+CD4+陽性細胞作用為主。

對CD3+CD4+細胞的影響：B、C、D組在24、48和72小時分別與A組相比差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），A組與B組、C組與D組相比差異也均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），表現(xiàn)為24小時先下降，48小時以后升高，而CD3+CD8+比例各個時間點均無明顯變化。

CD4+/ CD8+比值：C組較A組CD4+/ CD8+比值明顯降低；D組較C組CD4+/ CD8+比值在24小時明顯降低，48小時和72小時上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；D組較B組CD4+/ CD8+比值在24小時明顯下降（P＜0.01），48 小時和72小時明顯升高，48小時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而72小時差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.6 IEC與HepG 2.2.15細胞共培養(yǎng)后上清液的細胞因子水平變化（圖4；表4）：A組與B組、C組與D組細胞上清液的IL-2和IFN-γ分泌水平在24、48和72小時均為上升趨勢，且差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；各個時間點D組與B組水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），且不隨時間而變化；C組與A組比較24小時時IFN-γ分泌量無明顯差異，而IL-2分泌量差異有統(tǒng)計學意義，其他時間點均有意義，但不隨時間變化而變化；C組與A組比較24和72小時IFN-γ無明顯差異。

圖3 各組C57BL/6小鼠淋巴細胞亞群的變化

圖4 各組細胞上清液的IL-2、IFN-γ和IL-10分泌量的變化

IL-10的變化卻相反。A組與B組24小時呈下降趨勢，48小時和72小時時均呈上升趨勢（均P＜0.05）；C組與D組24、48和72小時均呈下降趨勢（均P＜0.05）；C組與A組24小時IL-10分泌量無明顯差異，D組與B組則有顯著差異（P＜0.01）。但不隨時間變化而變化。

提示DC刺激淋巴細胞對體外HepG 2.2.15細胞作用后都能產(chǎn)生較高的IL-2、IFN-γ和較低的IL-10。但成熟DC較未成熟DC的作用更明顯。

表4 各組不同時間點、HepG 2.2.15細胞上清液細胞因子水平變化比較（±s）

表4 各組不同時間點、HepG 2.2.15細胞上清液細胞因子水平變化比較（±s）

注：B組與A組比較，aP＜0.05；D組與C組比較，bP＜0.05；C組與A組比較，cP＜0.05；D組與B組比較，dP＜0.05

組別 樣本數(shù) IL-2（pg/ml）24小時 48小時 72小時A 組 3 71.36±5.85 67.09±1.92 67.36±3.26 B 組 3 97.90±8.21a 92.60±2.43a 89.69±4.25a C 組 3 44.15±5.41c 50.36±4.26c 48.70±1.43c D組 3 80.09±4.54bd 85.74±4.91bd 82.62±3.07bd組別 樣本數(shù) IFN-γ（pg/ml）24小時 48小時 72小時A 組 3 416.87±24.01 396.73± 78.30 438.61±111.85 B 組 3 534.77±16.41a 595.45± 57.15a 678.58± 39.31a C 組 3 425.79±23.83 597.08± 88.69c 497.99±104.50 D 組 3 830.95±75.12bd 953.64±109.19bd 909.97±117.39bd組別 樣本數(shù) IL-10（pg/ml）24小時 48小時 72小時A 組 3 532.16±16.52 383.97±24.87 420.38±19.83 B 組 3 420.13±43.59a 444.92±10.53a 479.56±32.06a C 組 3 572.08±21.72 525.04±41.05c 560.78±33.48c D 組 3 338.95±31.37bd 323.65±22.55bd 333.38±33.67bd

3 討 論

多數(shù)學者認為，發(fā)生慢性病毒性肝炎及病毒持續(xù)感染的機制除了取決于病毒本身的生物學特性外，更重要的是與宿主自身的免疫功能狀態(tài)有關(guān)。利用自身的免疫細胞培養(yǎng)識別標靶特異抗原的淋巴細胞，以特定方法促使功能性淋巴細胞增殖，制成高純度、特異識別以及有殺傷標靶細胞（例如腫瘤、病毒感染的細胞等）功能的IEC。IEC的特點在于除了含有多種免疫活化所需的功能性細胞外，還可以促使免疫反應更加完整、活躍，達到高效清除病原的目的。有研究表明，提取患者自身DC，在體外經(jīng)過HBcAg刺激后回輸?shù)襟w內(nèi)能夠促進T細胞免疫，從而抑制病毒復制和改善肝功能［12］。而Weiwei等［13］發(fā)現(xiàn)，通過HBcAg活化的DC能夠產(chǎn)生針對于HBV特異性的CD8+細胞反應。

本研究提取轉(zhuǎn)HBV基因C57BL/6小鼠DC及淋巴細胞，通過不同的HBV蛋白刺激DC成熟，并通過成熟的DC與淋巴細胞共培養(yǎng)得到IEC，在體外HepG 2.2.15細胞（含有完整的HBV基因）共培養(yǎng)，結(jié)果顯示了細胞間并沒產(chǎn)生異種細胞間的排斥反應，肝細胞的ALT有變化，但與對照組比較差異沒有統(tǒng)計學意義，而ALT有下降趨勢，故免疫細胞療法不會造成肝細胞的嚴重損傷［14］，可能有修復肝細胞膜的作用。提示我們采用的體外處理方法對HBV的研究是可行的。其次我們發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)抗原刺激的成熟DC與淋巴細胞共刺激組較未成熟DC與淋巴細胞組HepG 2.2.15細胞上清HBV DNA水平明顯下降，同時細胞內(nèi)的HBV DNA和cccDNA水平也明顯下降。說明該種成熟DC作用后的淋巴細胞具有明顯的抑制HBV cccDNA的合成以及分泌的作用。

HBV cccDNA在HBV復制過程中起關(guān)鍵作用，是HBV復制的突出標志，很難被清除，監(jiān)測其水平被認為是目前評價抗HBV療效或臨床治愈的“金標準”。目前認為，機體通過免疫清除HBV cccDNA的途徑主要為：① 通過細胞溶解機制，清除感染的肝細胞，HBV被巨噬細胞吞噬或與抗-HBs抗體結(jié)合成為免疫復合物后被巨噬細胞吞噬并從尿中排出，破壞的肝細胞由新生肝細胞替代；② 通過Th1反應介導的依賴細胞因子的非細胞溶解機制，如IFN-γ、TNF-α和IL-2等細胞因子介導非細胞裂解機制清除細胞核內(nèi)的HBV cccDNA或阻斷合成新的HBV cccDNA，即通過細胞因子的作用“治療”感染［15-16］，從而清除HBV。目前在移植患者中發(fā)現(xiàn)可以通過供者針對HBV的過繼免疫而實現(xiàn)HBV的清除［17］。

為了解釋其原因及機制，我們檢測了致敏淋巴細胞的亞群變化，發(fā)現(xiàn)特異性IEC在作用HBV的早期主要以CD8+細胞為主，CD4+細胞水平明顯降低，CD4+/ CD8+比值顯著降低，48小時以后CD4+細胞明顯升高，表明IEC的抗HBV的早期作用主要是CD8+細胞發(fā)揮的，隨后以CD4+T細胞作用為主；隨著時間的延長，CD4+/CD8+比值上升，而細胞的HBV DNA水平明顯下降，可能與在抗HBV過程中CD4+和CD8+細胞直接參與有關(guān)［18-19］。HBV DNA水平降低，CD4+/ CD8+比值卻明顯升高，說明IEC的亞群改變首先是CD4+/ CD8+比值的降低，而后在HBV作用后升高，并且與異種細胞間的排異反應無關(guān)。有研究表明，IEC的CD8+淋巴細胞是決定HBV清除的關(guān)鍵細胞亞群，細胞溶解或非溶解機制（IFN-γ和TNF-α等）是CD8+T細胞清除HBV的主要方式，而CD4+淋巴細胞主要通過分泌Thl細胞因子來抑制HBV復制［20-21］，提示此種情況下加強急性CD4+T細胞應答的治療和疫苗的策略是有意義的。而DC是目前已知的唯一能激活Th0細胞向Thl細胞或Th2細胞分化的功能最強的抗原呈遞細胞［22］。為了進一步解釋其機制，我們對各組進行了細胞因子的檢測。

Th1和Th2兩個細胞亞群相互拮抗，Thl/Th2動態(tài)平衡是機體處于正常免疫狀態(tài)的保證［23］。Thl主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-3等細胞因子，這些細胞因子誘發(fā)細胞免疫反應，增強微生物對宿主的感染，尤其是病毒與細胞內(nèi)感染的免疫性和防御功能，達到清除病毒的目的；Th2主要分泌IL-10、IL-4、IL-5等細胞因子，這些細胞因子可刺激B細胞增生，產(chǎn)生相應抗體，誘發(fā)體液免疫反應［24］，并與感染的進展、慢性化有關(guān)。Thl/Th2的失衡應答可能是HBV感染慢性化的主要機制，這種失衡又體現(xiàn)在細胞因子失調(diào)方面［25］。IFN-γ、IL-2能正向調(diào)節(jié)免疫應答，清除侵入體內(nèi)的病毒抗原。IL-10是一種重要的抗炎細胞因子，也可抑制Th1成熟和產(chǎn)生相應細胞因子，故IFN-γ、IL-2、IL-10可大致代表 Th1 / Th2的功能［26-27］。我們檢測了IFN-γ、IL-2和IL-10，結(jié)果顯示，HBV DNA高表達時，IFN-γ和IL-2水平下降，而IL-10均升高，HBV DNA低表達時，IFN-γ和IL-2水平上升，而IL-10水平下降。由于IFN-γ分泌增加可使CD4+T細胞向Th1分化，抑制Th2形成，從而激活HBV特異的CTL克隆增殖，殺傷HBV［28］。IL-10含量升高，且伴隨病毒載量增高而增加，顯示HBV致病與免疫應答中Th2介導的體液免疫活性偏高有關(guān)系。IL-10水平升高抑制了Th1群細胞的功能，使Th1分泌IFN-γ和IL-2的量減少，細胞免疫效應降低，機體清除病毒能力減弱，導致病毒持續(xù)存在［29］。有研究報道HBV感染者血清IL-10濃度明顯高于正常對照組，HBV高載量組感染者血清IL-10濃度明顯高于正常對照組和低載量組［30］，說明細胞因子與肝細胞中HBV DNA的消長有一定關(guān)系，特別是與肝細胞中HBV cccDNA、HBV DNA的關(guān)系需要進一步研究，以探討cccDNA的清除與機體免疫的關(guān)系。

以往人們對血清及腹腔積液中細胞因子與HBV DNA的研究較多，但對細胞因子與肝細胞中HBV DNA及HBV cccDNA的關(guān)系卻研究較少。本研究結(jié)果證實，IEC對體外HBV DNA及HBV cccDNA均有明顯的抑制作用，這一結(jié)果也與其他報道［31-33］一致。通過對轉(zhuǎn)HBV基因小鼠的DC處理的淋巴細胞亞群檢測，可以證明體外IEC中HBV特異性的CD4+和CD8+細胞對HBV清除和疾病轉(zhuǎn)歸有重要影響，對體外HBV復制及分泌均有抑制作用。肝移植術(shù)后HBV再感染的病原來源于病肝釋放到循環(huán)中的病毒顆粒，或者淋巴系統(tǒng)及淋巴細胞等肝外組織中存在的病毒［34］。而移植術(shù)后，隨著大量免疫抑制劑的應用，肝移植受體術(shù)后外周血來源的DC呈遞乙肝表面抗原的能力低下，針對HBV的抗原特異性T細胞應答低下，此種功能缺陷是導致受體針對HBV的主動免疫反應性低的重要原因［35］。特異修飾的DC刺激淋巴細胞可以在很大程度上減少HBV的復制，不會造成肝功能的損傷。這種療法可能在不久的將來用于預防和治療移植術(shù)后乙肝復發(fā)患者。

綜上所述得出以下結(jié)論：① IEC與異種肝細胞體外混合培養(yǎng)，細胞間不產(chǎn)生排斥反應；② 轉(zhuǎn)HBV基因鼠DC誘導的IEC對體外HBV復制有明顯的抑制作用，為免疫細胞療法在臨床中的應用提供理論依據(jù)；③ Th1/Th2平衡可能在控制體外HBV復制及分泌過程中處于一個動態(tài)的平衡；④ 細胞因子在抗HBV中發(fā)揮重要作用，可能也是保護肝細胞損傷的重要因素。