肖穎，劉永亮

葡萄籽原花青素通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2途徑對放射性腦損傷大鼠海馬區(qū)生長相關(guān)蛋白-43活性的影響①

肖穎1，劉永亮2

目的觀察葡萄籽原花青素(GSPE)對放射性腦損傷大鼠的防治作用，并分析可能的保護(hù)機(jī)制。方法72只3月齡雄性Sprague-Daw ley大鼠隨機(jī)分為對照組(n=18)、模型組(n=18)、低劑量GSPE組(n=18)和高劑量GSPE組(n=18)。用直線加速器進(jìn)行腦部照射22Gy制作放射性腦損傷模型。采用穿梭箱實驗檢測大鼠學(xué)習(xí)能力；HE染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞組織形態(tài)變化；RT-PCR法檢測生長相關(guān)蛋白-43(GAP-43)mRNA表達(dá)，Western blotting檢測磷酸化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)表達(dá)。結(jié)果與模型組比較，各GSPE組動物穿梭箱主動回避反應(yīng)率顯著升高(P＜0.001)，被動回避潛伏期顯著縮短(P＜0.001)；海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷減輕；GAP-43mRNA和磷酸化ERK1/2表達(dá)水平增高(P＜0.001)。且高劑量GSPE組顯著優(yōu)于低劑量GSPE組(P＜0.001)。模型組中GAP-43mRNA表達(dá)水平與磷酸化ERK1/2水平呈正相關(guān)(r=0.764,P＜0.001)；低劑量GSPE組和高劑量GSPE組中GAP-43mRNA表達(dá)水平與磷酸化ERK1/2水平呈正相關(guān)(r=0.814,0.822,P＜0.001)。結(jié)論GSPE通過ERK1/2途徑提高大鼠海馬區(qū)GAP-43表達(dá)，發(fā)揮防治放射性腦損傷作用。

放射性腦損傷；學(xué)習(xí)；生長相關(guān)蛋白-43；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2；大鼠

[本文著錄格式]肖穎，劉永亮.葡萄籽原花青素通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2途徑對放射性腦損傷大鼠海馬區(qū)生長相關(guān)蛋白-43活性的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2015,21(12):1397-1401.

CITED AS:Xiao Y,Liu YL.Effectof grape seed proanthocyanidin on grow th associated protein-43 through extracellular signal regulated kinase 1/2 pathway in ratswith brain radiation injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(12):1397-1401.

1　材料和方法

1.1試劑和儀器

GSPE：天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司，用蒸餾水溶解成所需濃度。ZH-CSC型穿梭實驗視頻分析系統(tǒng)(Shuttle Box System)：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。西門子PRMUSM型直線加速器：德國。

1.2動物分組

72只3月齡雄性Sprague-Daw ley大鼠，體質(zhì)量(220±20)g，購自北京維通利華公司，合格證號SCXK(京)2003-003。隨機(jī)分成對照組(n=18)、模型組(n= 18)、高劑量GSPE組(n=18)和低劑量GSPE組(n=18)。各組又分別分為照射后7 d、14 d、28 d 3個亞組。

1.3方法

對照組只進(jìn)行常規(guī)麻醉，不進(jìn)行照射。

模型組常規(guī)麻醉，參考文獻(xiàn)[7]制作放射性腦損傷模型。用特制的固定盒固定大鼠，采用加速器產(chǎn)生的6MeV電子線對大鼠進(jìn)行單次全腦照射，源皮距為100 cm，吸收劑量率250 Mu/m in，吸收劑量為22 Gy；照射時僅頭部暴露于射線下，同時使用擋鉛保護(hù)眼睛、耳朵、頸部、身體。使用1.0 cm厚的組織補償膠體(Bolx)覆蓋頭皮，使劑量分布均勻。

高劑量GSPE組和低劑量GSPE組動物照射方法同模型組，于照射前2周開始每天灌胃給藥1次，持續(xù)至觀察時點。給藥劑量參考文獻(xiàn)[8]：高劑量GSPE組200mg/kg，低劑量GSPE組100mg/kg。

1.4學(xué)習(xí)能力評測

將各組大鼠按時間點分別放入穿梭箱，適應(yīng)5 m in消除探究反射后給予鈴聲刺激5 s，繼之給予電擊20 s，間隔10 s后進(jìn)入下一輪訓(xùn)練。訓(xùn)練中，如果在鈴聲刺激5 s內(nèi)大鼠逃向安全區(qū)，則為主動回避反應(yīng)，系統(tǒng)自動停止當(dāng)次訓(xùn)練；如果在鈴聲刺激5 s內(nèi)大鼠未逃向安全區(qū)，則給予1.5mA交流電20 s，如果在電擊后逃向安全區(qū)，則為被動回避反應(yīng)陽性，否則為主動、被動回避反應(yīng)陰性。每只大鼠電擊30次，記錄被動回避潛伏期(passiveavoidance latency,PAL)、主動回避反應(yīng)次數(shù)等參數(shù)。主動回避反應(yīng)次數(shù)占總訓(xùn)練次數(shù)的百分比即為主動回避反應(yīng)率(active avoidance reaction rate,AARR)；AARR越高，PAL越短，表明動物學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)。

1.5腦組織海馬區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

各組各時間點取3只大鼠，4%多聚甲醛灌注固定后，取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織。石蠟包埋、冠狀切片，片厚5μm，HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6RT-PCR法檢測GAP-43mRNA表達(dá)

各組各時間點取3只大鼠，致死后迅速取雙側(cè)海馬區(qū)組織，稱量0.6 g，加入RNAiso Plus溶液1m l勻漿，室溫靜置5m in后12000 r/m in 4℃離心5min，取上清移至新的1.5m l離心管內(nèi)，加入1/5RNAiso Plus溶液體積的氯仿，震蕩混勻后室溫靜置5m in，12000r/min 4℃離心15m in，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入0.5～1倍RNAiso Plus溶液體積的異丙醇，室溫靜置10 min，12000 r/m in 4℃離心10 m in，棄掉上清液，用與RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀，7500 r/min 4℃離心5m in，棄上清保留沉淀，干燥(不可加熱)，溶解于30μlDEPC處理水中，測量光密 度(OD)260/280， 根 據(jù) OD260計 算 RNA濃度，-80℃保存。

檢測步驟：GAP-43引物(F:CCCAAGCTTCCATGCTGTGCTGTATGAG;R:GGGTACCCTCAGGCATGTTCTTGGTC;上海生工生物技術(shù)有限公司合成)。進(jìn)行Real TimeOne Step RT-PCR反應(yīng)。Satge 1,2(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))：Reps：1，42℃5m in，95℃10 s；Stage 3 (PCR反應(yīng))：Reps：40，95℃5 s，60℃31 s；Stage 4(融解曲線分析)：Dissociation Protocol。

1.7Western blotting檢測磷酸化ERK1/2表達(dá)

取材方法同上。蛋白樣品40μg與等體積上樣緩沖液混合，煮沸10m in后進(jìn)行100 g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜；加封閉液，室溫下震蕩2～3 h后，加入磷酸化ERK1/2單克隆抗體(北京中山生物公司，1∶2000)，4℃孵育過夜，用TBST洗膜，加標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h后，再次TBST洗膜；ECL顯色，用圖像分析儀測定光密度。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。組間分析采用析因設(shè)計資料的方差分析，組內(nèi)分析采用SNK-q分析。數(shù)據(jù)以(±s)表示，顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

2.1穿梭實驗檢測

與對照組相比，模型組動物的AARR顯著減小，PAL顯著延長(P＜0.001)，且至照射后28 d時，AARR 和PAL恢復(fù)跡象不明顯。與模型組相比，GSPE組動物的AARR顯著增大，PAL顯著縮短(P＜0.001)，且28 d時AARR和PAL恢復(fù)跡象明顯。見表1、表2。

表1　各組大鼠AARR比較(%)

表2　各組大鼠PAL比較(s)

2.2神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變

對照組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)元胞體較大，胞核大而圓，核仁清晰。模型組可見神經(jīng)細(xì)胞變性水腫，細(xì)胞輪廓模糊，亦可見部分死亡神經(jīng)細(xì)胞，表現(xiàn)胞體收縮呈多角形或不規(guī)則。GSPE組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)減輕，在高劑量組變化尤為明顯。見圖1。

2.3RT-PCR

采用2-△△Ct計算法來顯示實時定量PCR實驗中基因表達(dá)的相對濃度。與對照組比較，模型組7 d、14 d GAP-43mRNA表達(dá)水平顯著增高，28 d有所降低，但仍顯著高于對照組(P＜0.001)；與模型組比較，GSPE組中各時間點GAP-43mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步顯著增高，高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至28 d，在高劑量GSPE組變化尤為明顯(P＜0.001)。見表3。

圖1　各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化(光鏡，400×)

表3　各組大鼠海馬區(qū)GAP-43mRNA表達(dá)水平比較

2.4Western blotting

以β-actin校準(zhǔn)后的蛋白條帶IOD值反映其蛋白水平。見圖2。與對照組比較，模型組7 d、14 d時間點磷酸化ERK1/2表達(dá)水平顯著增高，28 d有所降低，但仍高于對照組(P＜0.001)；與模型組比較，GSPE組中各時間點磷酸化ERK1/2表達(dá)水平進(jìn)一步顯著增高，高表達(dá)狀態(tài)持續(xù)至28 d，在高劑量組變化尤為明顯(P＜0.05)。見表4。

圖2　Western blotting檢測各組大鼠海馬區(qū)磷酸化ERK 1/2蛋白表達(dá)

表4　各組大鼠海馬區(qū)磷酸化ERK 1/2蛋白表達(dá)水平比較

2.5相關(guān)分析

模型組中GAP-43 mRNA表達(dá)水平與磷酸化ERK1/2水平呈正相關(guān)(r=0.764,P＜0.001)。低劑量GSPE組和高劑量GSPE組中GAP-43mRNA表達(dá)水平與磷酸化ERK1/2水平呈正相關(guān)(r=0.814,0.822,P＜ 0.001)。

3　討論

GSPE是一種理想的天然抗氧化劑和自由基清除劑，具有抗腫瘤、抗輻射、抗衰老等多種藥理作用，對癌癥、心血管疾病等具有一定的治療作用，且作用機(jī)制多與其強(qiáng)大的抗氧化和自由基清除能力相關(guān)[9]。張國瑜等發(fā)現(xiàn)GSPE能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞中半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3蛋白的表達(dá)，提示其可能通過線粒體通路促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，從而抑制其增殖[10]。

GSPE還具有一定的腦保護(hù)作用。目前GSPE腦保護(hù)作用的報道主要來自腦缺血、缺氧損傷。王紅陽等研究證實GSPE有提高阻塞性睡眠呼吸暫停模式下低氧大鼠腦組織耐受缺氧的作用，減輕大鼠腦組織結(jié)構(gòu)損傷和學(xué)習(xí)、記憶障礙[11]。劉文倩的研究顯示GSPE可抑制腦缺血模型大鼠腦內(nèi)5-羥色胺的含量，而改善動物學(xué)習(xí)行為[12]。亦有研究報道GSPE可抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)、抑制p8MAPK的激活及NF-кB向胞內(nèi)移位而降低腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮較強(qiáng)的腦保護(hù)作用[13]。本研究結(jié)果顯示，GSPE組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善，腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷減輕，說明GSPE對放射性腦損傷有較好的防治作用。

GAP-43是軸突生長因子的代表。腦損傷刺激后，未受損神經(jīng)細(xì)胞大量合成GAP-43，可通過與胞內(nèi)信息分子G蛋白等相互作用，提高興奮性氨基酸受體的反應(yīng)性，釋放鈣調(diào)素，促使軸突側(cè)枝出芽和形成，允許神經(jīng)元軸突繼續(xù)延伸，調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞骨架的重新裝配，有利于神經(jīng)通路的整合[14]。研究顯示，參芎化瘀膠囊可促使腦損傷后神經(jīng)再生和神經(jīng)功能恢復(fù)，其機(jī)制均與上調(diào)腦內(nèi)GAP-43表達(dá)有關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，GAP-43在GSPE組呈劑量依賴式增高，且高表達(dá)狀態(tài)時間延長，加之GSPE組動物學(xué)習(xí)記憶能力檢測指標(biāo)的變化，提示GSPE對放射性腦損傷的防治作用與提高海馬區(qū)GAP-43活性有關(guān)。

ERK1/2是迄今MAPKs家族中研究最為深入的成員。ERK1/2激活可通過基因表達(dá)、蛋白合成等影響神經(jīng)細(xì)胞增殖分化、突觸可塑性、軸突生長等，參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展[16]。如Zhong等發(fā)現(xiàn)外源性手段增加腦內(nèi)神經(jīng)生長因子均可擴(kuò)大或強(qiáng)化神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化能力，以補充或替代損傷的神經(jīng)細(xì)胞；而當(dāng)條件性敲除ERK1/2通路基因，則不能誘導(dǎo)神經(jīng)軸突生長[17]。

本研究結(jié)果顯示，磷酸化ERK1/2和GAP-43在GSPE組均呈劑量依賴式增高，且二者高表達(dá)時間都出現(xiàn)延長趨勢；相關(guān)分析顯示磷酸化ERK1/2和GAP-43在模型組和GSPE組均呈顯著正相關(guān)，說明GSPE通過調(diào)節(jié)ERK1/2信號途徑提高海馬區(qū)GAP-43活性。GSPE的基本作用是清除自由基和抗氧化，在此基礎(chǔ)上其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制包括改腦內(nèi)能量代謝、改善微環(huán)境和微循環(huán)、抑制炎癥反應(yīng)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等[18]。

本實驗結(jié)果表明，GSPE通過ERK1/2途徑提高放射性腦損傷大鼠海馬區(qū)GAP-43活性，減輕放射性腦損傷大鼠學(xué)習(xí)能力障礙，為GSPE抗腫瘤及抗輻射的應(yīng)用中提供了一定的理論依據(jù)。

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Effect of Grape Seed Proanthocyanidin on Grow th Associated Protein-43 through Extracellular SignalRegulated Kinase1/2 Pathway in Ratswith Brain Radiation Injury

XIAO Ying1,LIU Yong-liang2
1.Tangshan Worker Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China;2.Tangshan People's Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China

Objective To observe the effectof grape seed proanthocyanidin extract(GSPE)on grow th associated protein-43(GAP-43) through extracellular signal regulated kinase 1/2(ERK1/2)pathway in rats with brain radiation injury.Methods 72 3-month male Sprague-Daw ley ratswere divided into controlgroup(n=18),modelgroup(n=18),high dose GSPE group(n=18)and low dose GSPE group (n=18).The brain radiation injury modelswere established by linear accelerator irradiation with 22 Gy.The learning ability was assessed with shuttle box.Themorphological changesof neurons in hippocampuswereobservedwith HE staining;theexpression of GAP-43was detected by RT-PCR;and the expression of phosphorylated ERK1/2 was detected by Western blotting.Results Compared with the model group,the active avoidance reaction rate in the shuttle box test increased and the passive avoidance latency shortened in GSPE groups(P＜ 0.001);the nerve cellmorphological injury reduced and the expression of GAP-43 mRNA and phosphorylated ERK1/2 increased in the GSPE groups(P＜0.001),especially in the high dose GSPE group(P＜0.001).The GAP-43mRNA levelpositively correlated with phosphorylated ERK1/2 level in themodelgroup(r=0.764,P＜0.001),the low dose GSPEgroup(r=0.814,P＜0.001)and thehigh dose GSPEgroup(r= 0.822,P＜0.001).Conclusion GSPE could promote the expression of GAP-43 through ERK1/2 pathway in rats,and prevent the brain from radiation injury.

brain radiation injury;learning;grow th associated protein-43;extracellular signal regulated kinase1/2;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.12.007

R651.1

A

1006-9771(2015)12-1397-05

河北省科技廳資助項目(No.1327776D)。

1.唐山市工人醫(yī)院，河北唐山市063000；2.唐山市人民醫(yī)院，河北唐山市063000。作者簡介：肖穎(1974-)，女，漢族，河北唐山市人，副主任醫(yī)師，主要研究方向：腦轉(zhuǎn)移癌的治療。通訊作者：劉永亮，男，碩士，主任醫(yī)師。E-mail:zyning789@126.com。

放射性腦損傷(brain radiation injury)是顱面頸區(qū)腫瘤放射治療后的常見并發(fā)癥。臨床報道，接受全腦照射并存活患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的概率高達(dá)50%～90%，且認(rèn)知障礙的程度往往與照射的劑量有關(guān)[1]，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。放射性認(rèn)知損傷與電離輻射引發(fā)的神經(jīng)發(fā)生障礙密切相關(guān)，促進(jìn)突觸新生和重建藥物的研究和開發(fā)成為防治電離輻射腦損傷醫(yī)學(xué)研究的熱點。

生長相關(guān)蛋白-43(grow th associated protein-43, GAP-43)是一種神經(jīng)生長相關(guān)蛋白，是目前國際公認(rèn)的神經(jīng)元再生突觸重塑的首選分子學(xué)標(biāo)志。腦損傷狀態(tài)下，GAP-43在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達(dá)，位于新生和損傷后再生神經(jīng)元的胞漿和軸突，在引導(dǎo)軸突生長和調(diào)節(jié)軸突形成新的聯(lián)系上起關(guān)鍵作用[2]。

胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)是有絲分裂原活化蛋白激酶(m itogen-activated protein kinases,MAPKs)家族重要組成部分，活化后經(jīng)多級激酶的級聯(lián)反應(yīng)把細(xì)胞外刺激信號向細(xì)胞內(nèi)傳遞，與神經(jīng)可塑性密切相關(guān)[3]。

葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)是一種從葡萄籽中提取出的生物類黃酮物質(zhì)。此類物質(zhì)具有多電子的羥基，均以雙鍵共軛，使得電子在分子中得以穩(wěn)定；采用化學(xué)發(fā)光法和細(xì)胞色素C還原法檢測GSPE清除超氧陰離子和羥基自由基的能力，結(jié)果顯示與維生素E清除超氧陰離子和羥基自由基的能力比較，50mg/L的GSPE清除超氧陰離子和羥基自由基的能力分別達(dá)84%和98%，較維生素C分別高43.9%和57.5%[4]。目前GSPE已逐漸應(yīng)用到高血壓、動脈粥樣硬化及腦血管疾病等防治中，并取得較好的治療效果[5-6]。

本研究建立放射性腦損傷模型，觀察GAP-43及ERK1/2活性變化，初步探討GSPE防治放射性腦損傷認(rèn)知障礙的作用機(jī)制。

2015-08-19

2015-10-15)