李兵奎，曾彬，常巍，王達義，楊棋

骨髓間充質(zhì)干細胞靜脈移植對脊髓損傷大鼠生長相關蛋白-43表達的影響①

李兵奎1，曾彬2，常巍1，王達義1，楊棋1

目的觀察骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)靜脈移植對脊髓損傷(SCI)大鼠生長相關蛋白(GAP)-43基因及蛋白表達的影響，探討B(tài)MSCs靜脈移植治療SCI的作用機制。方法采用SCI打擊器建立大鼠T11脊髓撞擊損傷模型，造模成功后，將大鼠隨機分為對照組(n=18)和觀察組(n=18)。SCI后1周，對照組大鼠自尾靜脈注射無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液0.1m l，觀察組大鼠自尾靜脈注射BMSCs懸液0.1m l。SCI后1、2、4、8周，兩組大鼠均進行BBB后肢運動功能評分；SCI后2、4、8周，采用RT-PCR檢測GAP-43mRNA的表達，采用免疫組化染色檢測GAP-43蛋白的表達。結果與對照組比較，觀察組SCI后2、4、8周BBB評分顯著升高(P＜0.001)，GAP-43陽性表達顯著增強(P＜0.001)，GAP-43mRNA的相對表達量升高(P＜0.05)。結論BMSCs移植能增強SCI大鼠GAP-43在基因及蛋白水平的表達，從而促進SCI的再生修復。

脊髓損傷；骨髓間充質(zhì)干細胞；移植；生長相關蛋白-43；大鼠

[本文著錄格式]李兵奎，曾彬，常巍，等.骨髓間充質(zhì)干細胞靜脈移植對脊髓損傷大鼠生長相關蛋白-43表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2015,21(12):1391-1396.

CITED AS:Li BK,Zeng B,ChangW,etal.Effects of bonemarrow mesenchymal stem cells transplantation on expression of grow th associated protein-43 in ratsafter spinal cord injury[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(12):1391-1396.

脊髓損傷是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，因其致殘率高、發(fā)病機制復雜，成為一個棘手的世界難題。骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植作為一種生物醫(yī)學手段[1]，在臨床及實驗研究中均已被證實能夠促進脊髓損傷的修復，改善神經(jīng)功能障礙[2-5]。生長相關蛋白-43(grow thassociated protein-43,GAP-43)是一種鈣調(diào)蛋白結合的胞膜磷酸蛋白質(zhì)，它可以促進神經(jīng)元的生長發(fā)育、軸突再生及突觸的重構，是公認的反映中樞神經(jīng)再生的標志性蛋白質(zhì)[6-8]。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

4周齡雄性SPF級Sprague-Daw ley大鼠3只，體質(zhì)量82～102 g，用于獲取BMSCs；成年雌性SPF級Sprague-Daw ley大鼠41只，體質(zhì)量210～250 g，用于建立大鼠脊髓損傷動物模型。大鼠由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK(鄂) 2011-0008。

1.1.2主要儀器及試劑

超凈工作臺：K-SYSTEMS L-126MP，丹麥。CO2培養(yǎng)箱：Napco Model304-01，美國。倒置相差顯微鏡：Olympus IX70，日本OLYMPUS公司。流式細胞儀：EPICS XL，美國BECKMAN COULTER公司。脊髓損傷打擊器：MASCIS Impactor ModelⅠ，美國紐約大學。凝膠數(shù)字圖像分析儀：A lpha Imager TM 2200，美國。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件：MEDIA CYBERNETICS公司，美國。

胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司。DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶：美國GIBCO公司?？俁NA提取試劑：RN0101，北京艾德萊生物科技有限公司。PCR試劑盒：PT102-01，上海萊楓生物科技有限公司。逆轉錄試劑盒：#K1621，美國FERMENTAS公司。快捷型酶標羊抗兔IgG抗體：KIT-5005，福州邁新生物技術有限公司。兔抗神經(jīng)GAP-43多克隆抗體：bs-0154R，北京博奧森生物技術有限公司。DAB顯色試劑盒：福州邁新生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及移植前準備[9]

取4周齡大鼠處死后以75%酒精浸泡消毒，隨后將大鼠移入超凈工作臺，以解剖剪剪開大鼠雙后肢皮膚，鈍性剝離雙后肢肌肉組織，取出雙側股骨及脛骨，以DMEM/F12培養(yǎng)液反復漂洗3次，剪去股骨及脛骨干骺端骨面，暴露骨髓腔；用含2%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞懸液，1500 r/m in離心5m in，棄去上清液，取沉淀。將含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液加入，懸浮沉淀的細胞，并反復吹打制成單細胞懸液。取適量的細胞懸液以培養(yǎng)液稀釋至12m l后接種于75 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，于細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每2～3天更換1次培養(yǎng)液，至細胞融合接近90%時，加入0.25%胰蛋白酶消化，隨后將細胞懸液以2×105/m l濃度接種于新的培養(yǎng)瓶中，靜置傳代培養(yǎng)。如此反復傳代擴增，以提高BMSCs純度。

取增殖活躍的第3代BMSCs，制成細胞懸液500 μl，計數(shù)后取含1×106個細胞的液體5份，移入5個EP管中，再分別向其中加入Anti-RatCD29PE、Anti-Rat CD45PE、Anti-RatCD34PE、Anti-RatCD44PE(SANTA CRUZ公司，美國)及陰性對照Hamster IgG Isotype Control PE各20μl，混勻后置于溫箱中避光孵育0.5 h。5個EP管中分別加入PBS溶液500μl，流式細胞儀檢測，再用Coulter分析系統(tǒng)進行結果分析。

移植前取第3代BMSCs，用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)配成1×107/m l的BMSCs細胞懸液備用[10,11]。

1.2.2模型制備[9]

成年大鼠以10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉。麻醉成功后，將大鼠俯臥位固定于解剖板上，術區(qū)備皮消毒鋪巾，定位T11棘突后，取大鼠后背正中手術切口，逐層切開，逐步咬除T11椎板及棘突，充分顯露T11脊髓背側面，暴露大小為3×4mm的打擊區(qū)。將大鼠移入脊髓損傷打擊器載物臺，用棘突夾鉗夾固定大鼠打擊區(qū)上下端椎骨，調(diào)節(jié)打擊桿至2.5 cm高度，啟動脊髓損傷計算機監(jiān)控軟件，隨后釋放打擊桿撞擊脊髓，打擊勢能為25 g·cm。術畢，根據(jù)計算機監(jiān)控記錄剔除不合格脊髓損傷動物。術后每天常規(guī)肌肉注射青霉素10萬單位、慶大霉素0.5萬單位，以預防感染，共3 d。每天行人工排尿2次、排便1次，直至大鼠排尿、排便反射恢復。

1.2.3實驗分組及干預措施

選取建模成功的大鼠，剔除術后第1天BBB評分＞1分、健康狀況不佳的大鼠，剩余36只，采用隨機數(shù)字表法隨機分為對照組和觀察組，每組18只。脊髓損傷后1周，觀察組自大鼠尾靜脈注射移植BMSCs懸液0.1m l，對照組自大鼠尾靜脈注射無血清的DMEM/ F12培養(yǎng)液0.1m l。

1.2.4BBB后肢運動功能評分

脊髓損傷后1、2、4、8周，根據(jù)BBB評分法[12]，分別由兩名獨立觀察者(熟悉評分標準但非本組的實驗人員)對大鼠后肢運動功能進行評分，雙側下肢評分不同時取平均值，每只大鼠的功能得分取兩人評分均值。

1.2.5取材

脊髓損傷后2、4、8周，兩組大鼠進行BBB后肢運動功能評分后，隨機選取6只處死取材。具體方法如下。10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，將大鼠俯臥位固定于解剖板上，取背部正中手術切口，逐層切開，充分顯露椎骨，逐步切除棘突、椎板，暴露損傷區(qū)上下端脊髓。以損傷處為中心，取出長約2 cm的脊髓組織，并將脊髓組織橫斷，一部分用4%多聚甲醛PBS溶液固定24 h以上，用于免疫組化染色，另一部分入液氮保存，用于RT-PCR檢測。

1.2.6RT-PCR檢測GAP-43mRNA表達[13]

設計引物序列如下：β-actin F 5'-TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC-3'，R 5'-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3'，產(chǎn)物擴增長度為265 bp；GAP-43 F 5'-GCTCTGCTACTACCGATGC-3'，R 5'-TTCCTTAGGTTTGGCTTCA-3'，產(chǎn)物擴增長度為371 bp。提取脊髓標本總RNA，逆轉錄為cDNA，再進行PCR擴增。采用25μl反應體系，反應條件設定為：94℃3min，1個循環(huán)；94℃30 s，55.5℃45 s，35個循環(huán)；72℃10m in，1個循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，進行掃描分析，并以β-actin作為內(nèi)參照，計算目的基因與β-actin內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物電泳條帶積分光密度的比值。

1.2.7免疫組化染色[13]

將脊髓標本制成石蠟切片，進行GAP-43免疫組化染色(SP法)，觀察實驗大鼠脊髓組織GAP-43的陽性表達情況，同時每個標本隨機選取2張切片，每張切片隨機選取3個視野，采用Image-Pro Plus6.0進行分析，測量GAP-43陽性產(chǎn)物的積分光密度值(integral opticaldensity,IOD)，每個標本的結果取2張切片及其3個視野的平均值。

1.3統(tǒng)計學分析

2　結果

2.1BMSCs的體外分離培養(yǎng)情況

提取的大鼠骨髓細胞混有大量造血細胞和紅細胞，靜置培養(yǎng)1 d后，可見少量梭形或圓形貼壁細胞，隨著時間延長，貼壁細胞數(shù)量不斷增多，呈集落樣生長，形狀呈梭形或多角形，有突起，原代細胞培養(yǎng)8～10 d后，呈放射狀或旋渦狀排列，生長融合達80%～90%。傳代后細胞增殖速度明顯加快，培養(yǎng)5～7 d完全融合。隨著傳代次數(shù)的增加，細胞純度不斷提高，細胞形態(tài)逐漸一致，大部分呈細長梭形。見圖1。

圖1　第3代BM SCs(倒置相差顯微鏡，100×)

2.2BMSCs的表型鑒定

培養(yǎng)第3代的細胞，經(jīng)流式細胞儀檢測，其BMSCs表面標志抗原CD44陽性率為94.7%、CD29陽性率為99.9%，白細胞表面標志抗原CD45陽性率為3.08%，骨髓造血干細胞表面標志抗原CD34陽性率為1.4%。表明培養(yǎng)的細胞可以穩(wěn)定表達BMSCs特征性的表面抗原CD29和CD44，細胞純度較高。見圖2。

2.3BBB后肢運動功能評分

脊髓損傷后次日兩組大鼠BBB評分均為0分，后肢運動功能均喪失。脊髓損傷后1周，兩組大鼠BBB評分無顯著性差異(P＞0.05)；脊髓損傷后2、4、8周，觀察組BBB評分顯著高于對照組(P＜0.001)。見表1。

表1　脊髓損傷后各時間點兩組BBB后肢運動功能評分

2.4GAP-43mRNA的表達

β-actin的擴增片段為265 bp，GAP-43mRNA的擴增片段為371 bp，其電泳結果與預擴增片段長度吻合。脊髓損傷后2、4、8周，對照組GAP-43mRNA的相對表達量均低于觀察組(P＜0.05)。見表2。

表2　脊髓損傷后各時間點兩組GAP-43mRNA的相對表達量

2.5免疫組化染色

脊髓損傷后各時間點，兩組大鼠脊髓切片內(nèi)均可見GAP-43陽性表達，與對照組比較，觀察組GAP-43陽性表達均顯著增強(P＜0.001)。結果見表3、圖3。

表3　脊 髓損傷后各時間點兩組GAP-43陽性表達(IOD)

圖2　流式細胞檢測波峰圖

圖3　脊髓損傷后兩組脊髓組織GAP-43表達(免疫組化染色，400×)

3　討論

脊髓損傷是脊柱外科一種常見的創(chuàng)傷性疾病，其致殘率和致死率很高，不僅給患者個人帶來痛苦，同時也給家庭帶來沉重的負擔[14-15]。脊髓損傷后大量神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞凋亡或壞死，致使神經(jīng)細胞分泌的營養(yǎng)因子減少，破壞了支持軸突再生的有利微環(huán)境；同時軸突斷裂、髓鞘崩解，使髓鞘相關抑制分子暴露，形成局部抑制性微環(huán)境[16]；此外膠質(zhì)瘢痕及空洞的繼發(fā)形成也阻礙了軸突的生長和正確連接[17]。這些復雜的病理生理過程使脊髓損傷修復成為一個世界性難題。

近年來隨著研究的不斷深入，有關脊髓損傷的治療措施取得了長足進展。目前國內(nèi)外眾多研究表明，BMSCs移植可促進脊髓損傷修復，改善神經(jīng)功能障礙[2-5,18-20]。本研究通過建立標準的Sprague-Daw ley大鼠脊髓撞擊損傷模型，并進行BMSCs靜脈移植治療，最后采用BBB評分法來評價兩組大鼠脊髓損傷后運動功能恢復情況，結果顯示，在脊髓損傷后2、4、8周，觀察組BBB評分均高于對照組，觀察組神經(jīng)功能恢復更理想，表明BMSCs靜脈移植能有效促進脊髓損傷大鼠神經(jīng)功能的恢復，與文獻報道一致。但其具體的作用機制尚不完全明確。

GAP-43是一種神經(jīng)細胞膜上的特異性磷酸蛋白，由神經(jīng)元胞體合成，是一種神經(jīng)內(nèi)源性生長相關蛋白，是神經(jīng)元發(fā)育、軸突生長及再生、突觸形成及重建的標志性蛋白質(zhì)[21-23]。有研究表明，GAP-43的高表達可以增強中樞神經(jīng)元的生長潛能。GAP-43廣泛存在于神經(jīng)組織中，當脊髓損傷發(fā)生后，GAP-43能通過順行性軸漿運輸集中到生長錐，成為生長錐膜的主要成分，從而影響生長錐的生長，誘導軸突延長和突觸重建，最終促進神經(jīng)元生長發(fā)育、軸突再生及突觸重建[24-26]。GAP-43基因高表達被認為是神經(jīng)再生的典型特征，與脊髓再生密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除大鼠的GAP-43基因后，大鼠的感覺、運動和反射功能均發(fā)生障礙，認為GAP-43可促進神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和神經(jīng)上下通路的整合[27]。因此本研究選用GAP-43作為觀察神經(jīng)再生的指標。

本研究采用免疫組化染色檢測GAP-43蛋白的表達，采用RT-PCR檢測GAP-43mRNA的表達。結果顯示，脊髓損傷后2周，兩組大鼠GAP-43mRNA的表達及GAP-43蛋白陽性表達最明顯，隨著時間延長，二者表達逐漸減弱，脊髓損傷后8周，兩組大鼠GAP-43mRNA及蛋白的表達最弱。但在脊髓損傷后各時間點，與對照組比較，觀察組GAP-43mRNA的表達量均增高(P＜0.05)，GAP-43蛋白陽性表達均顯著增強(P＜0.001)，表明觀察組大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生更明顯。從基因及蛋白水平，本研究揭示了BMSCs靜脈移植可以上調(diào)GAP-43 mRNA的表達，增加GAP-43蛋白表達，從而促進脊髓損傷后神經(jīng)再生及突觸重建，并有助于建立更多的神經(jīng)環(huán)路及突觸聯(lián)系，促進神經(jīng)上下通路的整合，從而發(fā)揮促進脊髓損傷修復的作用，這可能是其治療脊髓損傷的機制之一。

實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后隨著時間延長，GAP-43的表達逐漸減弱，尤其是脊髓損傷后8周，兩組大鼠的GAP-43mRNA的表達趨于接近，實驗與臨床研究也發(fā)現(xiàn)單一的BMSCs移植療效有限，因此采取BMSCs移植聯(lián)合其他療法的聯(lián)合治療是否能更好地促進脊髓損傷修復以及其作用機制將有待我們進一步研究。

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Effects of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplantation on Expression of Grow th Associated Protein-43 in Ratsafter SpinalCord Injury

LIBing-kui1,ZENG Bin2,CHANGWei1,WANG Da-yi1,YANG Qi1
1.Departmentof Spinal Surgery,Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei442000,China;2. Department of Internal Medicine,Dongfeng General Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei 442000, China

Objective To observe the effect of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)transplantation on the expression of grow th associated protein-43(GAP-43)in rats after spinal cord injury(SCI).Methods The SCImodelsweremade by impacting at the level of T11segment.Aftermodeling,the ratswere randomly and equally divided into controlgroup(n=18)and observation group(n=18).1week after injury,DMEM/F12medium 0.1m lwas injected into tail vein of rats in the control group,and an equal volume of BMSCs suspension was injected in the observation group.1,2,4,8 weeks after SCI,the hindlimb function was evaluated by the Basso-Beattie-Bresnahan (BBB)score.2,4,8weeksafter SCI,the expression of GAP-43mRNAwasdetected by RT-PCR,and theexpression of GAP-43was detected by the immunohistochem istry.Results 2,4,8 weeks after SCI,compared with the control group,The BBB score increased,the expression of GAP-43mRNA and GAP-43 increased in the observation group(P＜0.05).Conclusion BMSCs transplantation can improve the expression of GAP-43 in gene and protein level,and then promote the repairof SCI.

spinal cord injury;bonemarrow mesenchymalstem cells;transplantation;grow th associated protein-43;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.12.006

R651.2

A

1006-9771(2015)12-1391-06

湖北省教育廳科學技術研究計劃重點項目(No.D20082403)。

1.湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院)脊柱外科，湖北十堰市442000；2.湖北醫(yī)藥學院附屬東風公司總醫(yī)院內(nèi)科，湖北十堰市442000。作者簡介：李兵奎(1979-)，男，漢族，湖北黃岡市人，碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向：脊柱外科。通訊作者：常巍，男，博士，主任醫(yī)師。E-mail:gkyschang@126.com。

本研究旨在通過觀察BMSCs靜脈移植對大鼠脊髓損傷后GAP-43基因及蛋白表達的影響，探討B(tài)MSCs靜脈移植治療脊髓損傷的機制。

2015-08-07

2015-10-10)