宋亞芹付文博盧沐劉洋魏育濤

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.烏魯木齊自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，新疆烏魯木齊 830000；3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科，新疆石河子 832000）

miR-25對(duì)食管癌細(xì)胞系KYSE-150、EC109侵襲轉(zhuǎn)移能力影響差別的比較及意義探討

宋亞芹1付文博2盧沐1劉洋1魏育濤3*

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832000；2.烏魯木齊自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，新疆烏魯木齊 830000；3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心胸外科，新疆石河子 832000）

目的：研究miR-25不同表達(dá)水平對(duì)食管癌細(xì)胞系KYSE-150、EC109侵襲轉(zhuǎn)移能力的不同影響并且探討這種差別對(duì)臨床工作的指導(dǎo)意義。方法：將miR-25模擬物、抑制劑、以及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入食管癌細(xì)胞系KYSE-150及EC109，使miR-25在兩個(gè)細(xì)胞系中過表達(dá)及表達(dá)抑制；qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后不同組miR-25的表達(dá)情況；然后進(jìn)一步通過Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)研究miR-25對(duì)兩個(gè)細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果：miR-25過表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞系KYSE-150及EC109的侵襲轉(zhuǎn)移，抑制miR-25表達(dá)后KYSE-150的侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯被抑制，而EC109的侵襲轉(zhuǎn)移能力變化不明顯。結(jié)論：miR-25促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，抑制miR-25對(duì)不同食管鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力影響不同。

食管癌/食管惡性腫瘤 microRNA25/miR-25 侵襲 轉(zhuǎn)移

一直以來食管癌是威脅世界人民生命健康的一大因素，其在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率分別位于第八位和第六位。而我國處于食管癌高發(fā)區(qū)，發(fā)病率和死亡率居高不下，在國內(nèi)所有食管癌病理類型中90%屬于食管鱗狀細(xì)胞癌［1］，這與早期食管癌難以識(shí)別以致延誤治療有很大關(guān)系。所以發(fā)現(xiàn)識(shí)別早期食管癌的分子機(jī)制及標(biāo)記物是我們面臨的巨大挑戰(zhàn)，并且對(duì)于臨床靶向、個(gè)體化治療以及患者預(yù)后有著重要意義。

MicroRNAs （miRs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度約22個(gè)核苷酸序列的非編碼小分子RNA，它通過促使靶mRNA降解或抑制其翻譯來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞的分化增殖和凋亡，個(gè)體發(fā)育，機(jī)體代謝及免疫調(diào)節(jié)中都具有重要的作用［2］，研究發(fā)現(xiàn)人類腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織內(nèi)miRNA的表達(dá)水平和類型都與正常細(xì)胞和正常組織的miRNA表達(dá)水平明顯不同，并且已發(fā)現(xiàn)的人類miRNA大部分位于已知的腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域內(nèi)或已知的基因脆性位點(diǎn)［3］，這些都提示miRNA可能與腫瘤的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，因此研究與腫瘤相關(guān)的miRNA分子機(jī)制將有助于理解腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，并有可能成為診斷腫瘤的潛在生物分子標(biāo)記用來協(xié)助臨床實(shí)踐。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種miRNA與腫瘤存在密切的聯(lián)系，Calin發(fā)現(xiàn)miR-15和miR-16基因在約68%的慢性淋巴細(xì)胞白血病病例中發(fā)生缺失或下調(diào)［3］，miR-197、miR-346在濾泡性甲狀腺癌，miR-221、miR-222、miR-181b在乳突狀甲狀腺癌中均呈高表達(dá)。MiR-25是miR-106b-25多順反子的一部分，位于染色體7q22.1上MCM7基因的第13個(gè)內(nèi)含子區(qū)，Petrocca等研究發(fā)現(xiàn)miR-106b-25簇（miR-106b、miR-25、miR-93）在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)［3］，Kan等發(fā)現(xiàn)，miR-106b-25多順反子在體外具有潛在的促進(jìn)增殖拮抗凋亡促進(jìn)細(xì)胞周期的作用，在體內(nèi)有致瘤性，在腫瘤形成過程中逐漸上調(diào)，并與MCM7基因擴(kuò)增和過表達(dá)相關(guān)，miR-25通過靶向和抑制Bim，參與食管腫瘤的形成和增殖［4］。然而目前為止對(duì)于miR-25與食管癌侵襲與轉(zhuǎn)移的研究還很少。也鮮有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-25的表達(dá)水平對(duì)不同食管癌細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響差別，由于相同腫瘤不同細(xì)胞系間的細(xì)胞生物學(xué)特性也不盡相同，如增殖、遷移、成瘤，以及基因變化等方面可能存在差異，所以相同的實(shí)驗(yàn)處理可能會(huì)帶來不同的實(shí)驗(yàn)效果。本研究一方面探討miR-25表達(dá)水平對(duì)食管癌細(xì)胞系KYSE-150及EC109侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，一方面比較這種影響在兩種細(xì)胞系間的差別，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

人食管鱗癌細(xì)胞系KYSE150及EC109購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 試劑

細(xì)胞中RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量試劑盒、Mir-25-3p定量檢測引物、U6內(nèi)參定量檢測引物、MicroRNA的模擬物及抑制劑、轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照及陽性對(duì)照、靶基因β-actin內(nèi)參引物均購自新疆貝思汀生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

所有細(xì)胞均為RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco， USA）加10%胎牛血清（Invitrogen，Carlsbad，USA），于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將兩個(gè)細(xì)胞系KYSE-150和EC109分別分為三組（mimic組、inhibitor組及control組）接種于六孔板中，采用新疆貝思汀生物科技有限公司的Hiperfect transfection reagent進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，操作按照說明書進(jìn)行。

1.5 總RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（全過程注意無酶環(huán)境）

按照試劑盒miRNeasy Mini Kit （Qiagen， Germany）說明書操作步驟提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，使A260/A280值在1.8-2.0。根據(jù)試劑盒miScript Ⅱ Reverse Transcription Kit （Qiagen， Germany）說明書操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)試劑盒miScript SYBR Green PCR Kit （Qiagen，Germany）說明書操作步驟采用實(shí)時(shí)熒光定量-PCR（RT-qPCR）檢測miR-25水平，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。選擇miR-U6為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 1）細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前一天將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)，然后分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將分組轉(zhuǎn)染后2 4 h的細(xì)胞消化并調(diào)整細(xì)胞濃度后接種到Transwell小室上室中，下室以胎牛血清作為趨化因子，接種后將24孔板置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育，24h后取出小室，細(xì)胞固定、染色、計(jì)數(shù)，下室中細(xì)胞鏡下觀察分視野計(jì)數(shù)。2）細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)流程相似，不同的是Transwell小室內(nèi)加入Matrigel膠（Coring Matrigel Basement Membrane Matrix）。

2 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩組間的差異比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果p＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 轉(zhuǎn)染后miR-25在兩個(gè)細(xì)胞系中的表達(dá)情況

為了研究miR-25的表達(dá)水平對(duì)食管癌細(xì)胞系生物特性的影響，人為轉(zhuǎn)染mir-25模擬物、抑制劑以及陰性對(duì)照試劑，造成KYSE-150細(xì)胞中miR-25的不同表達(dá)，采用qRT-PCR檢測兩個(gè)細(xì)胞系中三組細(xì)胞的miR-25表達(dá)情況，結(jié)果見圖1A.1B.。KYSE-150細(xì)胞系中mimic組與陰性對(duì)照組表達(dá)有差異，mimic組miR-25的表達(dá)明顯高于陰性對(duì)照組（p=0.001），而inhibitor組miR-25的表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照組（p=0.007）；EC109細(xì)胞系中mimic組與陰性對(duì)照間表達(dá)也有差異，mimic組miR-25的表達(dá)明顯高于陰性對(duì)照組（p=0.027），inhibitor組miR-25的表達(dá)明顯低于陰性對(duì)照組（p=0. 007）。

3.2 miR-25對(duì)食管癌細(xì)胞系KYSE-150及EC109的侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響有差別

Transell細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，KYSE-150細(xì)胞系經(jīng)轉(zhuǎn)染后mimic組穿膜細(xì)胞的數(shù)量明顯多于陰性對(duì)照組，inhibitor組則是相對(duì)陰性對(duì)照組明顯減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；EC109細(xì)胞系經(jīng)轉(zhuǎn)染后mimic組穿膜細(xì)胞的數(shù)量明顯多于陰性對(duì)照組（p＜0.05），而inhibitor組細(xì)胞相對(duì)陰性對(duì)照組無明顯減少，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（遷移實(shí)驗(yàn)p=0.690；侵襲實(shí)驗(yàn)p=0.809）見圖2.A，2.B及圖3.A，3.B。

4 討論

食管鱗狀細(xì)胞癌是起源于食管上皮組織的惡性腫瘤，其在全球的發(fā)病率和死亡率存在地域差別，而且男性患食管癌的風(fēng)險(xiǎn)高于女性［5］，這一致死性的疾病嚴(yán)重影響著人們的生命與生活質(zhì)量。我國是食管鱗癌的高發(fā)國家，雖然隨著醫(yī)療科技的不斷發(fā)展，其死亡率有所下降，但在我國食管鱗癌的診斷與治療仍然形勢嚴(yán)峻，患者在接受傳統(tǒng)治療（外科手術(shù)、放射治療、化學(xué)抗癌藥物治療）后癌癥病情仍會(huì)惡化。這與早期食管鱗癌難以識(shí)別以致延誤治療有很大關(guān)系，另外，癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力也是影響患者預(yù)后的重要因素。侵襲與轉(zhuǎn)移是多步驟的生物學(xué)過程，包括：細(xì)胞粘附、遷移、血管發(fā)生、免疫逃逸和靶器官定植。所以發(fā)現(xiàn)辨識(shí)早期食管癌的分子標(biāo)志并在此基礎(chǔ)上研究出更加精準(zhǔn)的治療方法是醫(yī)學(xué)科研工作者的當(dāng)務(wù)之急。

有研究表明miR-106b-25多順反子具有致癌性，其在腫瘤形成的過程中表達(dá)升高［6］，另有研究發(fā)現(xiàn)miR-25， miR-106b， miR-21，miR-203和miR-145在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯不同于正常組織［7］，KimBH等人證實(shí)了miR-25與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［3］。既然miR-25在食管鱗狀細(xì)胞癌中也是高表達(dá)，那么我們推測其在食管鱗狀細(xì)胞癌的形成發(fā)展過程中也起到至關(guān)重要的作用，本研究就miR-25在不同食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150和EC109中的不同表達(dá)水平對(duì)食管鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響做了進(jìn)一步的探討。我們通過轉(zhuǎn)染miRNA模擬物、抑制劑及陰性對(duì)照成功使miR-25在兩個(gè)細(xì)胞系的三組細(xì)胞中表達(dá)有差異，然后對(duì)不同組細(xì)胞檢測食管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果顯示miR-25的過表達(dá)及抑制對(duì)食管鱗癌細(xì)胞系KYSE-150的侵襲轉(zhuǎn)移都具有明顯影響，過表達(dá)后可明顯促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，抑制后則顯著降低細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力；然而EC109的結(jié)果卻與此有所不同，過表達(dá)miR-25后同樣可以促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，抑制miR-25后EC109細(xì)胞系沒有表現(xiàn)出明顯變化，其侵襲轉(zhuǎn)移能力沒有受到明顯影響，說明miR-25確實(shí)可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，但就不同分化程度的癌細(xì)胞而言其作用效果不同。這對(duì)于以后的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)具有一定的指導(dǎo)意義。

體外培養(yǎng)的細(xì)胞是一種在特定條件下生長的細(xì)胞群體，它們保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，具有相應(yīng)理化和生物因素刺激的應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)研究人類相關(guān)的組織器官的生物學(xué)性狀及相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制有重要意義。本研究中使用的KYSE-150屬于低分化食管鱗狀細(xì)胞癌，而EC109屬于高分化食管鱗狀細(xì)胞癌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們miR-25對(duì)低分化食管癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移力的影響有可能高于高分化食管癌細(xì)胞。眾所周知，分化程度越低的癌細(xì)胞越可能具有較強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，如果miR-25是影響其侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子，就為我們將來針對(duì)每一位患者的精準(zhǔn)醫(yī)療提供了有意義的治療靶向。雖然說miR-25在食管鱗狀細(xì)胞癌中起到致癌基因的作用，且實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能促進(jìn)食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移，但是抑制其表達(dá)后對(duì)高分化食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移影響不大，這就提醒我們，miR-25在診斷食管癌、判斷病情的進(jìn)展程度和患者預(yù)后中具有一定的意義，但如果涉及未來的靶向治療或精準(zhǔn)醫(yī)療治療食管癌的話，就要另當(dāng)別論，個(gè)體化對(duì)待了。

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Objective： To investigate the different roles miR-25 play in invasion and metastasis of EC109 and KYSE150. Methods： To inhibit and overexpress miR-25 by transfecting miRNA inhibitor and miRNA mimic into human esophageal carcinoma cells KYSE150 and EC109， then study the function miR-25 plays in different groups of cells through Transwell migration assay and Transwell invasion assay， finally analyse the data of different groups. Results：Overexpressing miR-25 by miRNA mimic led to increased cell migration and invasion in both KYSE150 and EC109； supressing miR-25 resulted in decreased cell migration and invasion in KYSE150， whereas the difference wasn't obvious in EC109. Conclusion： miR-25 promotes invasion and metastasis of esophageal squmous cancer， inhibitting miR-25 may have different influence in different kind of cells.

esophageal； cancer/carcinoma； invasion； migration

國家自然科學(xué)基金（81460059）；兵團(tuán)衛(wèi)生科技-兵團(tuán)博士基金（2014BB019）

?通訊作者：魏育濤（1976- ），男，漢族，新疆石河子人，副主任醫(yī)師，博士，主要從事食管癌及心臟瓣膜疾病的研究。作者簡介：宋亞芹（1989-），女，漢族，山東濟(jì)寧人，碩士在讀，主要從事食管癌的研究。