朱文慧馮欣桐孫唯秀李述楊磊張冰兵侯毅鞠

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林吉林 132013；2. 吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院血液檢驗(yàn)教研室，吉林吉林 132013）

花色素對白血病K562細(xì)胞增殖和凋亡影響的研究

朱文慧1馮欣桐1孫唯秀1李述1楊磊1張冰兵1侯毅鞠2*

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林吉林 132013；2. 吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院血液檢驗(yàn)教研室，吉林吉林 132013）

目的：研究花色素對K562細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法：采用細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，臺盼藍(lán)拒染、MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率；顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；AnnexinV/PI雙標(biāo)記流式檢測細(xì)胞凋亡的特征。結(jié)果：臺盼藍(lán)拒染、MTT檢測顯示花色素對K562細(xì)胞具有增殖抑制作用，并且與時(shí)間、濃度呈正相關(guān)；顯微鏡下直接觀察到花色素高濃度組細(xì)胞分散，胞體減小，凋亡細(xì)胞明顯增多；流式細(xì)胞儀檢測到高濃度花色素組K562細(xì)胞凋亡率高于對照組。結(jié)論：花色素對K562細(xì)胞具有增殖抑制作用，并且能夠促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡。

花色素 K562細(xì)胞 增殖 凋亡

白血病是一種造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，我國白血病發(fā)病率約為2.76/ 10萬。白血病的發(fā)生是由于血細(xì)胞增殖失控，分化成熟受阻，正常凋亡程序失調(diào)，導(dǎo)致異常分化細(xì)胞大量增殖所引起［1］?；ㄉ厥侵参镏袕V泛存在的多酚類化合物的總稱，是一種天然食用色素，安全無毒，而且具有一定營養(yǎng)和藥理作用，有研究表明花色素對人乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞具有生長抑制作用［2-4］，且對機(jī)體無明顯不良反應(yīng)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)花色素能抑制白血病細(xì)胞增殖、促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡，能增加化療藥物的敏感性和逆轉(zhuǎn)耐藥等［5］。K562細(xì)胞是一種分化極差、惡性程度較高的人紅白血病細(xì)胞株，在體外可被多種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)發(fā)生凋亡、分化和增殖抑制［6-8］，是臨床和基礎(chǔ)領(lǐng)域中篩選新的抗腫瘤藥物的常用模型。在此研究背景下，本課題采用不同濃度的花色素對K562細(xì)胞作用，分別檢測其對K562細(xì)胞增殖、凋亡的作用，為臨床應(yīng)用花色素抗白血病治療提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料限公司；臺盼藍(lán)染液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MTT試劑盒購于武漢博士生物工程有限公司；annexin V/PI試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SM-3型酶標(biāo)分析儀（北京天石天力醫(yī)療器械技術(shù)開發(fā)中心）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司）；流式細(xì)胞儀EPICS XL（美國Beckman Coulter公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱

表1 花色素作用48h后臺盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（n=4）

圖1 不同濃度的花色素對K562細(xì)胞的抑制率

圖2 K562細(xì)胞生長狀態(tài)

圖3 對照組與高濃度藥物組K562細(xì)胞各期細(xì)胞數(shù)

花色素購于長春德爾塔生物技術(shù)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司；新生牛血清購于杭州四季青生物工程材料有（美國 Forma Scientific公司）； K562細(xì)胞為吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院凍存細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 臺盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，以每孔9×108/L密度接種于24孔板中，將其分成5組，每組平行設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，分別加入不同濃度的花色素，終濃度分別為0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL（后續(xù)試驗(yàn)藥物處理均依照此濃度分組），培養(yǎng)48h后采用臺盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。

1.2.2 MTT法檢測

取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，以每孔9×108/L密度接種于24孔板中，分別在加藥24h、48h、72h后加入MTT溶液10μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，離心1000 r/min，5 min，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100μL Formazan 溶解液，振蕩10 min，用酶標(biāo)分析儀在570nm波長下測各孔吸光度，按下列公式計(jì)算抑制率，IR% = （1－試驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值）×100%。

1.2.3 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化

取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，以每孔9×108/L密度接種于24孔板中，將其分成5組，每組平行設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，藥物處理48h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照。

1.2.4 用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，以每孔9×108/L密度接種于24孔板中，藥物處理48h后，經(jīng)PBS洗滌，收集細(xì)胞。加人FITC標(biāo)記的AnnexinV室溫避光30 min，再加入PI，避光反應(yīng)5 min，加入適量Bufer處理細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測（具體步驟參照試劑盒說明書）。

2 結(jié)果

2.1 臺盼藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)

隨著花色素濃度的增高，細(xì)胞生長抑制率也逐漸增加，提示花色素在體外對K562細(xì)胞有明確的增殖抑制作用（見表1）。

2.2 MTT法檢測

MTT結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，花色素能夠抑制K562細(xì)胞生長，隨著濃度從25μg/mL增加到200μg/mL，細(xì)胞生長抑制率也逐漸增加（見圖1）。

2.3 顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)

對照組：細(xì)胞胞體大，呈圓形，聚集成團(tuán)如葡萄串樣，胞漿內(nèi)未見顆粒。藥物組：細(xì)胞分散，胞體皺縮，體積減小，凋亡細(xì)胞增多且明顯，提示花色素對K562細(xì)胞有增殖抑制和促進(jìn)凋亡的作用（見圖2）。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

流式結(jié)果顯示，藥物處理后的細(xì)胞表現(xiàn)為隨著藥物濃度的增加，凋亡細(xì)胞也有相應(yīng)增多，其中與對照組比較，差異最為顯著的是200μg/mL花色素組。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了花色素對K562細(xì)胞促進(jìn)凋亡的作用（見圖3）。

3 討論

白血病是源自多能造血干細(xì)胞水平的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類生命健康。根據(jù)各種類型白血病的分子學(xué)特點(diǎn)，白血病治療的有效方法在于抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)異常細(xì)胞凋亡［9］。因此，尋找既能抑制白血病細(xì)胞增殖又能促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的藥物已成為白血病研究的熱點(diǎn)之一。

研究表明花色素具有抗腫瘤作用，在抗血液腫瘤治療中的作用也逐漸引起人們重視［10-11］。本實(shí)驗(yàn)作者用不同濃度的花色素誘導(dǎo)

K562細(xì)胞，對其增殖抑制情況、形態(tài)學(xué)、誘導(dǎo)凋亡等方面進(jìn)行了初步研究。所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：臺盼藍(lán)拒染和MTT比色實(shí)驗(yàn)表明，花色素對 K562細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，且隨著加入花色素濃度的增高和培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制越明顯；顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示，花色素高濃度組細(xì)胞分散，胞體減小，凋亡細(xì)胞明顯增多；在流式細(xì)胞儀上采用AnnexinV/PI雙標(biāo)記法檢測到花色素高濃度組K562細(xì)胞凋亡率高于對照組，結(jié)果提示花色素可以在體外促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡。在以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們認(rèn)為花色素可以成為抑制白血病細(xì)胞異常增殖和促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的新藥物。綜上，花色素通過抑制K562細(xì)胞生長，促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡而改變白血病細(xì)胞異常增殖的腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，具備多項(xiàng)調(diào)控功能。隨著花色素在抗血液腫瘤治療中的深入研究，花色素將成為既能抑制白血病細(xì)胞增殖，并能促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡的新藥物，成為臨床理想的非殺傷性治療血液腫瘤的藥物，為白血病治療方案提供更多、更新的選擇。

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吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No. 2012489）；2013年吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目

朱文慧（1991—），女（漢族），江蘇徐州人，在讀本科。

?通訊作者：侯毅鞠（1974—），女（漢族），吉林吉林人，副教授，碩士學(xué)位，主要從事血液腫瘤相關(guān)的研究工作。