李日輝

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000）

生長期RNAi抑制POD基因表達(dá)對心里美蘿卜花青素含量的影響

李日輝

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000）

前期結(jié)果表明，在生長期通過RNAi可有效地抑制其POD基因的長期表達(dá)，但對72h內(nèi)的變化無從了解。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M心里美蘿卜自然生長條件，在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)行RNAi干擾POD基因表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)POD活性被抑制的時間可以提前到RNAi干擾質(zhì)粒作用后的4h，而花青素的含量隨POD活性被抑制而逐漸增加。同時植物的生長狀態(tài)可以影響到干擾強(qiáng)弱，對干擾趨勢影響不明顯。

POD rsprx1基因 RNAi 花青素

心里美蘿卜（Raphanus sativus L）屬十字花科、兩年生草本植物，是我國著名的蘿卜品種，其肉質(zhì)根的木質(zhì)部中含有豐富的過氧化物酶和花青素。過氧化物酶（Peroxidase，POD）是廣泛存在于植物體內(nèi)的一類能利用H2O2氧化供氫體的酶，它對H2O2具有高度專一性，而對供氫體的要求則較為廣泛，它催化如下反應(yīng)：A H+ H2O2=A+2H2O［1］。由于POD成分和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，同功酶的多樣性，以及多基因編碼特點(diǎn)，造成對其功能的認(rèn)識尚不全面。POD一方面與植物正常的形態(tài)發(fā)生和形態(tài)建成有關(guān)，在植物的生長、發(fā)育過程中起作用；另一方面與植物的抗逆性有關(guān)，包括抗旱、抗寒、抗鹽和抗病等，是植物重要的保護(hù)酶。

花青素（Anthocyanidin），又稱花色素，是苯并吡喃衍生物，常與一個以上葡萄糖、鼠李糖等通過糖苷鍵形成花青苷（Anthocyanin）?；ㄇ嗨刂饕嬖谟谥参镆号葜校?、蔬菜、花卉等五彩繽紛的顏色大部分與之有關(guān)，也是樹木葉片的主要呈色物質(zhì)?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸?、消除自由基、抗變異、抗腫瘤、降低血清和肝臟中脂肪含量以及防止人體內(nèi)過氧化的作用。植物花青素代謝途徑研究已較為成熟，苯丙氨酸是花青素合成的直接前體，由苯丙氨酸到花青素經(jīng)歷3個階段：第1階段由苯丙氨酸到香豆酰CoA；第2階段是由4-香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氫黃酮醇，是類黃酮代謝的關(guān)鍵反應(yīng)；第3階段是花青素的合成 。通過外源結(jié)構(gòu)基因的導(dǎo)入，利用共抑制原理等技術(shù)調(diào)控花青素等類黃酮物質(zhì)的合成，以改變植物花色、果色和葉色已經(jīng)取得了許多成果。RNAi技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用到通過抑制花青素合成基因來改變花的顏色，創(chuàng)造出新的植物品種這一領(lǐng)域上來。

1 材料與方法

1.1 材料

心里美蘿卜品種為京研牌“滿堂紅”菌株：含有pART-rsprx1i干擾載體的農(nóng)桿菌菌株和含有空載體pART-27的農(nóng)桿菌菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

圖1 抑制rsprx1基因?qū)OD活性的影響

圖2 抑制rsprx1基因?qū)ㄇ嗨睾康挠绊?/p>

圖3 各組花青苷相對含量比例示意圖

1.2 方法

（1）浸染。將含有干擾載體pART-rsprx1i和空質(zhì)粒pART-27的農(nóng)桿菌在含有50mg/L卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基上分別劃線培養(yǎng)，長出菌落后，挑取單菌落接種于附加50mg/L卡那霉素（Kan）的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h左右，使OD達(dá)到0.8。用含有10mmol/L MES和2%蔗糖、pH為5.6的1/2MS液體培養(yǎng)基做為細(xì)胞重懸液，重懸菌液至OD為2.4。取生長至65天、79天和93天的心里美蘿卜去皮，滅菌后切成0.5cm3，用含有pART-rsprx1i的菌液浸泡10min，并以含有pART27的農(nóng)桿菌及清水做對照，浸泡時置于搖床。浸泡后置于培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的光照強(qiáng)度為12000LX，溫度為24°C。培養(yǎng)4h、8h、24h、48h和72h后測定各指標(biāo)。

（2）POD活性的檢測。稱0.9g肉質(zhì)根，加入適量石英砂及0.9 ml PB ［50mmol/L （pH7.0）］，低溫下勻漿，12000r/min離心20 min。參照張龍翔等方法［3］，取上清10μl，加入2.9 ml 0.01mol/L PB，并加入50μl 0.02mol/L愈創(chuàng)木酚，最后加入10μl 0.04mol/L新配制的H2O2后470nm處比色，每隔30秒測定OD，連續(xù)記錄3min，以光吸收每分鐘增加0.001為一個酶活性單位（U），酶活性用U/g·FW表示。

（3）花青素含量的測定取0.3g肉質(zhì)根，加少量石英砂和0.9 ml提取液（含1%濃鹽酸的無水乙醇），研磨至勻漿，在4°C冰箱避光浸提24h，加等體積蒸餾水1.8 ml，12000 r/min，4°C離心10 min，于520nm處測定吸光值，含量單位用A520/g·FW表示。

（4）花青素高效液相色譜分析。取培養(yǎng)48h的蘿卜肉質(zhì)根，切碎后稱取1g蘿卜肉質(zhì)根，加入2ml的5%甲酸充分研磨，浸提12h后，8000r/m，離心15min，收集上清。HPLC使用C18柱，柱溫40°C，流動相A為5%甲酸，流動相B為5%乙腈/甲酸，流速0.4 ml/min，進(jìn)樣量為20μl，檢測波長為520nm，采用梯度洗脫。

2 結(jié)果

（1）生長期抑制rsprx1基因?qū)OD活性的影響在不同生長期，其肉質(zhì)根經(jīng)含有pART-rsprx1i干擾載體的農(nóng)桿菌浸染10 min，并以含有空質(zhì)粒pART-27的農(nóng)桿菌及清水做對照，培養(yǎng)至48h，POD活性均達(dá)到組內(nèi)最低值，以48h為組間比較時間點(diǎn)，如圖1：在播種后的第65、79和93天，肉質(zhì)根經(jīng)含有干擾載體的菌液浸染10 min，培養(yǎng)至48h，POD活性均達(dá)到最低且與對照組有極顯著差異（p＜0.01）；播種后第79天，處理后48h，抑制組POD活性14.2×103U/g·FW，為組內(nèi)組間最低值。

（2）生長期抑制rsprx1基因?qū)ㄇ嗨睾康挠绊懸?8h為組間比較時間點(diǎn)，花青素含量測定如圖2：在播種后的第79天，其肉質(zhì)根小塊經(jīng)含有pART-rsprx1i干擾載體的農(nóng)桿菌浸染10 min，培養(yǎng)至48h后，花青素含量達(dá)到最高且與對照組有極顯著差異（p＜0.01）；第65天時抑制組花青素含量與清水組有極顯著差異（p＜0.01），與轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組有一般顯著差異（p＜0.05）；第93天時抑制組花青素含量與清水組有一般顯著差異（p＜0.05）；播種后第79天，處理后48h，抑制組花青素含量為12.3 A520/g·FW，為組內(nèi)組間最大值。

（3）花青素高效液相分析對上述花青素進(jìn)行HPLC，從蘿卜肉質(zhì)根中共分離出了26種花青苷，它們主要為天竺葵素的衍生物，抑制組各花青苷的含量和表達(dá)量高于兩個對照組，有極顯著差異（P＜0.01）。其中第14、16、18、25號所代表的花青苷在抑制組中的相對表達(dá)量要低于對照組；而抑制組中的第3、13、15、17號所代表的花青苷相對表達(dá)量則要高于對照組；從花青苷的種類來說，抑制組和與對照組的花青苷成分有明顯差異，其中，抑制組檢測出花青苷26種，轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組檢測出23種，而在清水組檢測出24種，如圖3所示。

3 結(jié)語

在心里美蘿卜生長的不同時期，采取對肉質(zhì)根進(jìn)行轉(zhuǎn)染，POD活性的抑制作用最強(qiáng)效果是在蘿卜播種后生長至第79天的時期。浸染后培養(yǎng)48h POD活性達(dá)到最底點(diǎn)，至72h時抑制作用有減低趨勢。

浸染法會對植物組織造成一定程度的損傷，同時農(nóng)桿菌本身也會對植物組織造成病害。在本實(shí)驗(yàn)中沒有進(jìn)行愈傷培養(yǎng)，但從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，無論那種處理，清水對照組的POD活性和花青苷含量在研究中變化不明顯，同時以清水對照的數(shù)據(jù)作為參考，可以排除機(jī)械損傷對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響［5］。

在蘿卜營養(yǎng)生長期肉質(zhì)根POD活性有一個先升高后下降的過程，而花青素含量變化則是逐漸升高然后相對穩(wěn)定。心里美蘿卜肉質(zhì)根花青素的合成主要是在其營養(yǎng)生長早期，而后期主要是花青素的積累.在富含花青素的植物器官伴隨有高活性的POD，POD在體外可以降解花青素，抑制POD可延緩花青素降解。在本實(shí)驗(yàn)中過氧化物酶的活性減低和花青素含量的增高位于同一時間點(diǎn)，進(jìn)一步證明過氧化物酶在花青素代謝中的作用。抑制rsprx1基因的表達(dá)，降低POD含量和活性，可以增加轉(zhuǎn)錄因子TT8表達(dá)，進(jìn)而增加CHS，CHI，DFR和LDOX基因的表達(dá)，從而使花青素合成增加。參與花青素合成途徑的基因很多，干擾rsprx1并不能影響所有花青素合成基因，只是選擇性影響部分基因表達(dá)［6］。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出初步推論：過氧化物酶對花青素的作用不僅體現(xiàn)在影響花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，還能在花青苷修飾方面影響其酰基化。

［1］Penel C.The peroxidase system in higher plants.In： Greppin H， Penel C， Integrated Plant Systems ［J］.University of Geneva，Switzerland，2000，pp：359-367.

［2］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)［M］.第2版.北京：高等教育出版社，1997，188-189.

［3］Sharp P A. RAN interference［J］.Genes Dev，2001，15（5）：485-490.

［4］楊少華.轉(zhuǎn)蘿卜過氧化物酶RsPrx1基因影響擬南芥花青素代謝機(jī)理［D］.河南：河南師范大學(xué)，2010.

［5］Holton T A，Cornish E C. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis ［J］.Plant Cell，1995，7：1071-1083.