錢明媚，肖永良，彭文濤，曹 慧（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

免耕水稻土固定CO2自養(yǎng)微生物多樣性

錢明媚，肖永良，彭文濤，曹 慧*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

使用13CO2為標(biāo)記物，采用穩(wěn)定性同位素核酸探針（DNA-SIP）技術(shù)和微宇宙模擬的方法，對(duì)兩種南方免耕水稻土中的固定CO2自養(yǎng)微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了研究.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)80d的培養(yǎng)后，從13CO2標(biāo)記處理的土樣提取的DNA經(jīng)氯化銫密度梯度離心后其浮力密度顯著區(qū)分于12CO2對(duì)照組，表明土壤樣品中的固定CO2自養(yǎng)微生物對(duì)CO2具有同化利用.RT-PCR結(jié)果表明兩種標(biāo)記土樣DNA密度梯度離心分層的cbbLR基因的拷貝數(shù)最高分別為1.36×105拷貝/g干土和2.21×105拷貝/g干土.克隆文庫分析和系統(tǒng)發(fā)育分析表明兩種土壤中的固定CO2自養(yǎng)微生物群落結(jié)構(gòu)具有一定差異.Bradyrhizobium和Rubrivivax是為FG土壤中的主要類群， 占全部克隆數(shù)的60.40%和13.86%.而TF土壤的主要類群是Rhodopseudomonas、Rhodospirillum、Methylibium和Variovorax，分別占全部克隆數(shù)的20.90%、11.94%、16.42%和10.45%.兩種13CO2標(biāo)記土樣的cbbLR基因文庫OTU類型、多樣性指數(shù)均高于12CO2對(duì)照文庫，其群落結(jié)構(gòu)也有明顯的變化.因此，免耕水稻土存在高度多樣性的二氧化碳固定自養(yǎng)微生物，在農(nóng)田土壤碳素循環(huán)方面具有重要作用.

固碳微生物；免耕水稻土；cbbLR基因；DNA-SIP；PCR-RFLP分析

溫室氣體排放導(dǎo)致氣候變暖和海平面上升，引起了全球的廣泛關(guān)注.大氣中的溫室氣體主要是由CO2、CH4、N2O三種氣體組成［1］，其中CO2對(duì)溫室效應(yīng)影響最大，占總效應(yīng)的50%左右［2］.土壤是溫室氣體的主要排放源之一，大氣中約有5%～20%的CO2來自土壤［3-4］；同時(shí)土壤中廣泛存在不同種類的自養(yǎng)微生物，它們能夠通過不同的代謝途徑固定二氧化碳［5］.土壤生態(tài)系統(tǒng)是二氧化碳的源或匯，在很大的程度取決于土壤呼吸和二氧化碳固定的對(duì)比關(guān)系，與土壤微生物的數(shù)量、種類和活性等密切相關(guān)，并受氣候條件、植被類型、耕作方式和土壤理化性質(zhì)的綜合影響［6-10］.

自養(yǎng)微生物包括光能自養(yǎng)微生物和化能自養(yǎng)微生物兩種類型，它們具有環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、種類多、數(shù)量大、分布廣的特點(diǎn)，能夠直接固定二氧化碳.Miltner等［11］應(yīng)用同位素示蹤技術(shù)室內(nèi)模擬培養(yǎng)試驗(yàn)研究結(jié)果表明，農(nóng)田土壤微生物對(duì)CO2的固定量最高可達(dá)呼吸排放量的3%～5%. Yuan等［12］研究表明，農(nóng)田土壤自養(yǎng)微生物能將CO2轉(zhuǎn)化成有機(jī)物質(zhì)，其同化速率約為 0.0134～0.103g/（cm2·d）.由于不同類群的自養(yǎng)微生物進(jìn)化出不同的 CO2固定途徑，通過CO2固定關(guān)鍵酶基因設(shè)計(jì)保守性引物研究自養(yǎng)微生物多樣性成為可能.Calvin循環(huán)是自養(yǎng)微生物固定CO2的主要途徑，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RubisCO）是Calvin循環(huán)中的關(guān)鍵酶，能夠利用環(huán)境中的CO2合成有機(jī)質(zhì)［13］，對(duì)大氣中CO2濃度調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用［14-15］.Watson等［16］將固定CO2細(xì)菌分為 “Green-like”和“Red-like” 兩大類群，RubisCO的部分編碼基因cbbLR和cbbLG分別是它們的指示基因.由于cbbLR基因具有高度保守性，可以采用保守性引物分析環(huán)境樣品中cbbLR功能基因的多樣性，進(jìn)而闡明二氧化碳固定自養(yǎng)微生物的分子生態(tài)學(xué)機(jī)制［17-18］.

穩(wěn)定性同位素核酸探針技術(shù)是利用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記底物培養(yǎng)環(huán)境樣品，通過提取微生物基因組DNA或者RNA借助于其它分子手段來分析環(huán)境樣品中同化了標(biāo)記底物的微生物，從而揭示環(huán)境中微生物重要代謝過程的分子機(jī)制.Fan等［19］采用13C-DNA-SIP技術(shù)，發(fā)現(xiàn)我國東北黑土中能夠利用秸桿有機(jī)碳的微生物分屬3個(gè)門、19個(gè)屬；Zhang等［20］用13C-CO2培養(yǎng)酸性土壤與12C-CO2對(duì)比，培養(yǎng)30d后，結(jié)合SIP技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)酸性土壤中Thaumarchaeota中的氨氧化古菌（AOA）具有CO2同化功能.免耕是可持續(xù)農(nóng)業(yè)的重要發(fā)展方向，可以極大地減少對(duì)土壤的擾動(dòng)，提高土壤有機(jī)碳含量［21-22］，提高土壤微生物的活性和數(shù)量［23］.但免耕過程中由于土壤有機(jī)碳含量提高，參與碳素代謝的微生物有何變化，尤其是二氧化碳固定自養(yǎng)微生物多樣性有何變化，直接影響到農(nóng)田土壤的生態(tài)功能和環(huán)境效應(yīng).本研究采用微宇宙培養(yǎng)方法，選擇兩種免耕水稻土并設(shè)置13CO2標(biāo)記與12CO2對(duì)照處理，直接示蹤分析二氧化碳固定微生物多樣性，為深入理解稻田土壤固碳過程提供一條新的思路，為調(diào)控土壤固碳能力提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況和土壤樣品采集

實(shí)驗(yàn)樣品于2013年12月采自安徽廣德免耕稻田，該區(qū)屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年均溫為15.4℃，年均降水量1328mm.采集2種土壤類型樣品，分別為鐵滲潛育水耕人為土（FG）（119o12′54.17″E，30o55′53.75″N）和普通鐵滲水耕人為土（TF）（119o18′53.57″E，30o53′52.28″N），兩種類型土壤主要分布在低地勢(shì)的沖田地形、耕作歷史悠久的水稻田中，在皖南地區(qū)分布面積較大，有較好的代表性.用自制管式原狀土采樣器（直徑25mm，高35mm）采集0～20cm表層土壤，去除石塊和根系，帶回實(shí)驗(yàn)室于4℃和-20℃分別儲(chǔ)存?zhèn)溆?2種供試土壤的理化性質(zhì)見表1.

表1 兩種土壤樣品的理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of the soils

1.2 CO2固定模擬試驗(yàn)

13CO2固定微生物模擬實(shí)驗(yàn)共設(shè)四組處理（FG-13CO2、FG-12CO2、TF-13CO2、TF-12CO2），每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù).將采集的新鮮原狀土均勻放置于密封透光的培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)含水量至最大持水量的40%.培養(yǎng)箱密封后，在30℃條件下預(yù)培養(yǎng)14d，目的是為了減少土壤呼吸排出的CO2量，避免4%13CO2被稀釋.正式培養(yǎng)周期為80d，每7d用壓縮空氣（20% O2，80% N2）換氣2～3min，以維持好氧環(huán)境，換氣結(jié)束后重新注入13CO2和12CO2氣體，確保培養(yǎng)箱的CO2濃度為4%，30℃培養(yǎng).80d取樣，部分用于土壤總DNA提取，部分于-20℃保存?zhèn)溆?

1.3 土壤總DNA提取與密度梯度離心

1.4 自養(yǎng)固碳細(xì)菌關(guān)鍵酶基因cbbLR多樣性分析

選取13CO2標(biāo)記分層后熒光定量結(jié)果拷貝數(shù)較高的7，8兩層（13C-7、13C-8）DNA樣品為模板，選取對(duì)應(yīng)的12CO2標(biāo)記層（12C-7、12C-8）作為對(duì)照，擴(kuò)增cbbLR基因，建立cbbLR基因文庫.cbbLR-PCR產(chǎn)物用Hha I限制性四堿基內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，基因型對(duì)應(yīng)測(cè)序結(jié)果去載體序列處理后，與NCBI網(wǎng)站中的Blast比對(duì)分析.

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用EXCEL和SPSS19.0進(jìn)行相關(guān)的數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)后進(jìn)行歸類.

2 結(jié)果與分析

2.113CO2標(biāo)記處理下二氧化碳固定細(xì)菌基因拷貝數(shù)量

從不同密度梯度分層樣品中固碳細(xì)菌cbbLR基因的相對(duì)豐度（圖1）可以看出，13CO2標(biāo)記的兩種土壤微生物cbbLR基因拷貝數(shù)最高均出現(xiàn)在第8層，而12CO2對(duì)照的cbbLR基因拷貝數(shù)最高出現(xiàn)在第10層，兩個(gè)層級(jí)密度差約為0.008mg/mL.

圖1 不同密度梯度分層樣品中固碳細(xì)菌cbbLR基因的相對(duì)豐度Fig.1 Quantitative distribution of bacterial cbbLR gene copy numbers across the entire buoyant density gradient of the fractionated DNA from the soil

熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明， FG13C-7基因拷貝數(shù)為5.69×104拷貝/g干土拷貝/g干土，而FG12C-7基因拷貝數(shù)為2.07×102拷貝/g干土；TF13C-7基因拷貝數(shù)為4.35×104拷貝/g干土，而TF12C-7基因拷貝數(shù)為1.47×102拷貝/g干土.FG和TF樣品13CO2標(biāo)記處理重浮力密度層DNA中cbbLR基因的拷貝數(shù)都高于12CO2處理兩個(gè)數(shù)量級(jí)，表明13CO2標(biāo)記處理樣品的固定CO2細(xì)菌基因組DNA已被部分標(biāo)記.兩種土壤13C標(biāo)記基因拷貝數(shù)最高都出現(xiàn)在第8層，其中FG13C-8基因拷貝數(shù)為1.36×105拷貝/g干土，而TF13C-8基因拷貝數(shù)為2.21×105拷貝/g干土.對(duì)于13C處理來說，重層基因拷貝數(shù)顯著高于12C對(duì)照處理，且從第8層開始，拷貝數(shù)隨著浮力密度的減小而降低，表明超高速離心將13C-DNA分離到重層.

2.2 二氧化碳固定細(xì)菌cbbLR基因多樣性

選取13CO2標(biāo)記超高速密度梯度離心分層后熒光定量結(jié)果拷貝數(shù)較高的兩層（7，8層）DNA樣品為模板，對(duì)應(yīng)的12CO2標(biāo)記層作為對(duì)照，使用cbbLR基因特異性引物從兩種土壤共8個(gè)分層樣本中均擴(kuò)增出了cbbLR基因條帶，PCR目的產(chǎn)物片段長(zhǎng)度約為820bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hha I酶切，酶切產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，分類后測(cè)序.

表2 8個(gè)分層樣品cbbLR基因文庫的群落多樣性結(jié)構(gòu)指數(shù)Table 2 Community diversity structural indices of the cbbLR gene libraries in the eight layered samples

圖2 8個(gè)分層樣品中固碳細(xì)菌cbbLR基因文庫豐度曲線Fig.2 Rarefaction curves of the cbbLR gene clone libraries in the eight layered sample

構(gòu)建了8個(gè)分層樣品的cbbLR基因文庫，包含672個(gè)陽性克隆.將測(cè)序結(jié)果相似性大于98%的序列歸為同一種可操作分類單元（OTU） ，共得到30個(gè)OTU.8個(gè)基因文庫的庫容值在86.57%～97.39%之間（如表2），同時(shí)從各分層樣品cbbLR基因文庫的種系豐度曲線（圖2）也可看出，建立的8個(gè)基因文庫趨勢(shì)線均趨于緩和，表明建立的基因文庫能夠較為完整地反映各分層樣品中固碳細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu).

從文庫群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)（表2）可以看出，8個(gè)基因文庫的各類多樣性指數(shù)數(shù)值存在一定的差異，Shannon-Wiener指數(shù)的數(shù)值范圍為1.35～2.77.13C標(biāo)記的重層Shannon-Wiener指數(shù)均高于對(duì)應(yīng)12C對(duì)照樣品，且兩種土壤13C標(biāo)記的第8層多樣性也都高于第7層.從均勻度和豐富度指數(shù)來看，8個(gè)cbbLR基因文庫的均勻度都較高，TF土樣的豐富度略高于FG，而且兩種土壤13C標(biāo)記的重層均勻度和豐度度都高于12C對(duì)照樣品.

2.3 二氧化碳固定細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)發(fā)育

為了比較cbbLR基因文庫OTU類型差別，繪制了兩種土壤13C標(biāo)記和12C對(duì)照7～8層cbbLR基因OTU類型文氏圖（圖3）.由圖3可看出，F(xiàn)G和TF均有27個(gè)OTU類型，其中FG和TF共有類型有24個(gè)OTU，占總OTUs的比例為80%.13C標(biāo)記處理80d后，土壤FG出現(xiàn)了7個(gè)新的OTU類型，而土壤TF出現(xiàn)了4個(gè)新的OTU類型，并且缺少12C對(duì)照處理的部分OTUs類型，可見兩種土壤在13CO2標(biāo)記培養(yǎng)過程中，二氧化碳固定自養(yǎng)微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化.

將30個(gè)OTU類型的測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI比對(duì)后進(jìn)行歸類（表3），并計(jì)算出不同類群固碳細(xì)菌所占的百分比（圖4）.兩種土壤30個(gè)OTU序列之間的同源性為77.25%～98.21%之間，主要分布在5個(gè)目、9個(gè)科和12個(gè)已知屬，即Rhodopseudomonas、Bradyrhizobium、Alcaligenes、Burkholderia、Rhodospirillum、Acidiphilium、Rubrivivax、Rhizobium、Cupriavidus、Azoarcus、Variovorax和Methylibium屬.此外，還有1個(gè)unssigned和1個(gè)uncultured OTU類群.

圖3 13CO2標(biāo)記和12CO2對(duì)照的兩種土壤cbbLR基因OTUs類型文氏圖Fig.3 Venn diagram showing relationships between the two soils incubated with13CO2or12CO2in RFLP pattern based on cbbLR gene OTUs

圖4 固碳細(xì)菌cbbLR基因基因文庫所含類群百分比Fig.4 Percentage of each phylum contained in the cbbLR gene clone libraries

13C標(biāo)記與12C對(duì)照處理土壤樣品相比，不同浮力密度層固碳細(xì)菌種屬分布和相對(duì)豐度不同，不同土壤類型固碳細(xì)菌種屬分布和相對(duì)豐度也不同.土壤FG和TF分別有11和12個(gè)菌屬，通過比較13C標(biāo)記處理樣品和12C對(duì)照處理樣品第8層的固碳菌，發(fā)現(xiàn)Rhodopseudomonas、 Methylibium和Bradyrhizobium為兩種土壤13C標(biāo)記的共有優(yōu)勢(shì)菌屬，土壤FG中相對(duì)豐度分別為8.91%、5.94%和60.40%，而土壤TF中的相對(duì)豐度分別為20.90%、16.42%和7.46%；Rubrivivax是土壤FG特有優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度為13.86%，而土壤TF特有優(yōu)勢(shì)菌屬為Burkholderia、Azoarcus、Rhodospirillum和Variovorax，相對(duì)豐度7.46%、7.46%、11.94%和10.45%，可見兩種水稻土中的二氧化碳自養(yǎng)微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異.將兩種土樣13C標(biāo)記與12C對(duì)照處理比較，F(xiàn)G13C標(biāo)記土壤中Bradyrhizobium、Methylibium和 Rubrivivax豐富度高于12C對(duì)照處理，而TF13C標(biāo)記土壤中Rhizobium、Acidiphilium、Burkholderia、Variovorax、Alcaligenes、Methylibium和Azoarcus豐富度高于12C對(duì)照處理，表明13CO2標(biāo)記處理土壤中自養(yǎng)微生物基因組DNA有更多被同位素標(biāo)記.

表3 與測(cè)序克隆cbbLR序列最相似的NCBI基因庫中微生物種類Table 3 Species of bacteria of cbbLR sequences in the NCBI GenBank database most similar to the clones of soil sample

3 討論

采用DNA-SIP技術(shù)，結(jié)合PCR-RFLP方法，研究了免耕水稻土中二氧化碳固定自養(yǎng)微生物的多樣性.土壤總DNA經(jīng)超速離心分層后，發(fā)現(xiàn)13CO2標(biāo)記處理7～9層中cbbLR基因的拷貝數(shù)均高于12CO2對(duì)照處理，且有差異明顯，說明13CO2標(biāo)記處理土壤中的CO2固定細(xì)菌基因組DNA被標(biāo)記.13CO2標(biāo)記處理樣品中第8層cbbLR基因的拷貝數(shù)最高，而12CO2標(biāo)記處理中cbbLR基因的拷貝數(shù)第10層最高，兩者浮力密度相差約0.008mg/ml，表明13CO2對(duì)固碳微生物標(biāo)記還不夠充分.原因可能是自然界中固碳微生物多為兼性自養(yǎng)微生物，而嚴(yán)格自養(yǎng)微生物所占的比例較少，兼性自養(yǎng)微生物能夠從環(huán)境中攝取小分子有機(jī)物作為碳源，導(dǎo)致13C標(biāo)記只能部分摻入固碳微生物的DNA［26］.

通過對(duì)8個(gè)cbbLR基因文庫分析發(fā)現(xiàn)，13CO2標(biāo)記處理的7，8層的OTUs類型數(shù)均大于12CO2對(duì)照層，香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)和豐富度呈現(xiàn)同樣的分布規(guī)律.13CO2標(biāo)記處理土壤中cbbLR基因的拷貝數(shù)、OTU類型和多樣性指數(shù)的增加，可能是由于較高濃度CO2（4000×10-6）有利于不同類型的自養(yǎng)微生物生長(zhǎng)和繁殖，因而自養(yǎng)微生物數(shù)量和種類都明顯增加.同時(shí)也提示在全球CO2升高后，土壤作為CO2重要的源和匯，對(duì)大氣CO2有的一定負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，有固定大氣CO2并減輕溫室氣體效應(yīng)的潛力.Cannon等［27］指出，水體/海洋中自養(yǎng)微生物同化的CO2占水體/海洋吸收大氣CO2總量的40%，自養(yǎng)微生物在水體/海洋碳同化過程中起著不可忽視的作用.另外，Yuan等［28］的研究顯示，土壤中含有cbbL基因微生物的豐度與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正比，且施肥和秸稈還田能增加該類群微生物的數(shù)量.這表明通過積極的農(nóng)藝措施，可能在一定程度上實(shí)現(xiàn)耕地的碳截流的增加.

本研究分析了30個(gè)cbbLR基因序列的同源性，發(fā)現(xiàn)它們之間的同源性不高（77%～98%），這些序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中cbbLR相似性更低（75%～89%），這表明免耕水稻土特殊環(huán)境條件對(duì)微生物種群有較大的選擇，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成與其環(huán)境條件相適應(yīng)的微生物群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)暗示免耕水稻土可能存在較多的新的自養(yǎng)固碳微生物類群.本研究中2種土壤中含有30個(gè)OTU類型，分屬12個(gè)已知屬和2個(gè)未知屬，以兼性自養(yǎng)微生物為主.Wu等［29］對(duì)3種具有代表性輪作制度的農(nóng)田土壤進(jìn)行固碳微生物多樣性研究，結(jié)果表明3種土壤固碳菌種類存在較大差異，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦存在較大差異.袁紅朝等［30］研究長(zhǎng)期施肥對(duì)稻田土壤固碳菌群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量的影響，發(fā)現(xiàn)3種施肥處理土壤中165個(gè)cbbL基因型分布在14個(gè)細(xì)菌屬.雖然細(xì)菌種屬數(shù)量相近，但種屬組成有很大差別，除Bradyrhizobium、Rhodopseudomonas和Alcaligenes屬外，其它種屬都不相同.此外，F(xiàn)G水稻土中Bradyrhizobium占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而TF稻田土壤中各菌屬則分布相對(duì)均勻，二者優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度存在明顯差異，而這種差異在已報(bào)道自養(yǎng)微生物多樣性研究方面普遍存在，遺傳特性和土壤性質(zhì)是造成這種差異的主要原因［6］.

二氧化碳固定自養(yǎng)微生物有光能型和化能型兩種類型.Wu等［31］最新研究表明，農(nóng)田土壤中RubisCO活性、cbbL基因豐度在0～1cm表層較高，并且認(rèn)為光照是光能自養(yǎng)型固碳微生物重要的影響因素.本研究表明，兩種土壤中Bradyrhizobium、Azoarcus和Methylibium屬均為化能自養(yǎng)型固碳微生物，這些固碳菌占全部克隆的41.07%、12.65%和8.04%，是免耕水稻土中的優(yōu)勢(shì)微生物類群.化能自養(yǎng)微生物能夠利用還原態(tài)的無機(jī)物，如銨鹽、亞硝酸、硫、硫化氫、氫和亞鐵化合物作為能源，在非表層土壤中由于光照難以到達(dá)，它們成為固碳微生物的主要能源物質(zhì).因此，對(duì)不同土壤環(huán)境中還原態(tài)無機(jī)物與化能自養(yǎng)微生物之間關(guān)系的研究，對(duì)于理解化能自養(yǎng)微生物的地理分布、生態(tài)功能和環(huán)境效應(yīng)有重要的理論價(jià)值.

4 結(jié)論

采用13C-DNA-SIP技術(shù)，結(jié)合PCR-RFLP方法，以cbbLR為標(biāo)記基因研究了我國南方免耕水稻土中自養(yǎng)固碳微生物的豐度和多樣性.研究表明，免耕水稻土中存在高度多樣性的自養(yǎng)固碳微生物，化能營(yíng)養(yǎng)型Bradyrhizobium、Azoarcus和Methylibium是該土壤環(huán)境的主要固碳微生物類群；添加較高濃度的CO2能夠提高免耕水稻土中二氧化碳固定自養(yǎng)微生物的多樣性，表明在CO2升高環(huán)境條件下土壤中固定CO2微生物對(duì)大氣CO2濃度具有一定的調(diào)節(jié)功能，有減緩CO2溫室氣體效應(yīng)的潛力.

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Diversities of autotrophic CO2-fixing microbes in no-tillage paddy soils.

QI
AN Ming-mei， XIAO Yong-liang， PENG Wen-tao， CAO Hui*（Key Laboratory of Microbiological Engineering of Agricultural Environment， Ministry of Agriculture， College of Life Sciences， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）. China Environmental Science， 2015，35（12）：3754～3761

The aim of the study was to investigate the diversity and community structure of autotrophic carbon dioxide-fixing bacteria by DNA-based stable isotope probing （DNA-SIP） technology and microcosm model method in no-till paddy soil in South China. The total DNAs by CsCl density-gradient centrifugation were separated on the basis of the buoyant density distinguishing after an 80-day incubation as templates， it showed that the carbon dioxide-fixing autotrophic microbes can assimilate and utilize carbon dioxide in soil. The RFLP-PCR showed that the highest copies of the cbbLR gene from two kinds of soil samples were 1.36×105copies/g dry soil and 2.21×105copies/g dry soil，respectively. The structure of carbon dioxide-fixing autotrophic microbial communities were significantly different from each other by clone library and phylogenesis analysis. Bradyrhizobium and Rubrivivax were the main microorganisms in soil FG and accounted for 60.40% and 13.86% of all clones， respectively. The community composition of carbon dioxide-fixing bacteria in soil TF was relatively uniform， and Rhodopseudomonas， Bradyrhizobium， Methylibium and Variovorax accounted for 20.92%， 11.94%， 16.42% and 10.45% of the total clones， respectively. The number of OTUs and diversity index of13C-carbon dioxide stable isotope labeled cbbLR library were higher than these of the12C-carbon dioxide labelled control library， and the community structure also showed significant differences. Together， we conclude that there are diverse autotrophic bacteria capable of fixing carbon dioxide in the no-tillage paddy soil， and they have an important role in the carbon cycling for farmland soils.

carbon dioxide-fixing microbes；no-tillage paddy soil；cbbLR gene；DNA-SIP；PCR-RFLP analysis

X172，Q938

A

1000-6923（2015）12-3754-08

錢明媚（1989-），女，江蘇連云港人，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物研究.

2015-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41371262，40871125）

* 責(zé)任作者， 教授， hcao@njau.edu.cn