何 芝，趙天濤，2*，邢志林，2，袁建華（.重慶理工大學化學化工學院，重慶 400054；2.重慶大學城市建設(shè)與環(huán)境工程學院，重慶 400030）

典型生活垃圾填埋場覆蓋土微生物群落分析

何 芝1，趙天濤1，2*，邢志林1，2，袁建華1（1.重慶理工大學化學化工學院，重慶 400054；2.重慶大學城市建設(shè)與環(huán)境工程學院，重慶 400030）

采用第二代高通量測序技術(shù)Illumina MiSeq對典型生活垃圾填埋場覆蓋土樣（山東萊蕪，SD；廣東深圳，GD；上海老港，SH；重慶長生橋，CQ）進行16S rDNA V3～V4區(qū)高通量測序，并分析了Alpha多樣性、物種組成和豐度、菌群結(jié)構(gòu)及環(huán)境因子對群落結(jié)構(gòu)的影響.結(jié)果表明:取自垃圾填埋場GD土樣的物種種類多于其他土樣，GD、SD、SH、CQ土樣的Shannon指數(shù)分別為5.52±0.026、4.76±0.030、4.89±0.037、3.43±0.027；所有覆蓋土樣的優(yōu)勢菌為Alphaproteobacteria（α-變形桿菌綱）和Betaproteobacteria（β-變形桿菌綱），所占比例范圍分別為12.67%～25.54%，14.35%～18.88%；SD、GD和SH三種覆蓋土樣的優(yōu)勢菌為Sphingomonas（鞘氨醇單胞菌屬），分別占7.25%、10.67%、11.30%；Deltaproteobacteria（德耳塔變形桿菌綱）和Gammaproteobacteria（γ-變形菌桿綱）的相對豐度分別與TN（r=1.00，P＜0.001）和TP（r=1.00，P＜0.001）呈正相關(guān)關(guān)系，且結(jié)合RDA圖，TN、TP和OM含量可能是SD土樣區(qū)別于其他土樣群落組成的主要因素.

Illumina MiSeq測序；垃圾填埋場覆蓋土；微生物多樣性；群落結(jié)構(gòu)；環(huán)境因子

垃圾填埋氣由200多種揮發(fā)性有機化合物組成，包括甲烷、二氧化碳、硫化氫以及痕量氣體如C2-C10烷烴、C2-C4烯烴、芳香族和鹵代烴類等有機化合物，排放于大氣中會造成臭氧層空洞、溫室效應等環(huán)境問題的加重.覆蓋土微生物經(jīng)填埋氣長期馴化，對填埋氣中有毒有害物質(zhì)具有較高的耐受性，并且具備了能夠降解烷烴、烯烴、芳香族等有害物質(zhì)的能力［1］，極大地降低了填埋氣中污染物的濃度.Lakhouit等［2］模擬覆蓋土層對垃圾填埋氣中BTEX（苯、甲苯、乙苯、二甲苯同分異構(gòu)體）揮發(fā)性有機物和OVOC （其他揮發(fā)性有機物）排放的影響，研究表明覆蓋層對BTEX和OVOC的降解效率范圍分別在67%～100%之間和96%～97%之間.張云茹等［3］對覆蓋土中甲烷氧化菌氯代烴降解能力進行研究，結(jié)果表明三氯乙烯初始濃度為15.64μmol/L，反應時間為5d時，甲基孢囊菌Methylocystis sp. JTC3對TCE的降解率為93.79%.

微生物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性是微生物生態(tài)學和環(huán)境科學研究的重點內(nèi)容，對于開發(fā)生物資源，闡明微生物群落與其生境的關(guān)系，揭示群落結(jié)構(gòu)與功能的聯(lián)系，從而指導微生物群落結(jié)構(gòu)功能的定向調(diào)控具有重要價值.由于覆蓋土中絕大多數(shù)的微生物是不可培養(yǎng)或非活性狀態(tài)存在，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法并不能代表該生境內(nèi)真正的微生物多樣性.而熒光原位雜交（FISH）、末端限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（T-RFLP）、變形梯度凝膠電泳（DGGE）、基因芯片技術(shù)等［4］分子生物學技術(shù)雖能夠繞開分離和培養(yǎng)，但受到樣品大小、采集等因素的影響，且許多微生物需在分離培養(yǎng)后才能透徹的對其研究，進而阻礙了覆蓋土微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的研究［5］.近年來，以測序通量高、成本低、定量準為特點的高通量測序技術(shù)（如Roche 454測序技術(shù)、IIumina的MiSeq和HiSeq測序技術(shù)）的出現(xiàn)，使得微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)的研究更深入、更全面.Kim等［6］模擬垃圾填埋場覆蓋層甲烷降解，通過基于DNA和RNA的核糖體標簽焦磷酸測序?qū)毦郝溥M行分析研究，研究表明甲烷氧化菌活躍區(qū)域RNA占80%，而DNA占20%.大部分研究利用分子生態(tài)學方法（FISH、T-RFLP等）對垃圾填埋場覆蓋土微生物進行研究.Su等［7］研究了甲烷和甲苯、甲烷、甲苯3種體系對垃圾填埋場覆蓋土甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)及活性的影響，研究表明在3種體系中Proteobacteria和Bacteroidetes為優(yōu)勢菌，且甲烷和甲苯共代謝體系對甲烷氧化菌和甲苯降解細菌具有較大影響.多數(shù)關(guān)于填埋場覆蓋土的研究都是基于覆蓋土具有良好的甲烷生物氧化能力［8］，而忽視了其他微生物在污染降解中的作用，他們既可降解其他非甲烷有機污染物，同時也能通過共代謝等作用影響甲烷氧化菌的活性.此外，不同土壤因氮磷含量、酸堿度、有機質(zhì)含量及水分含量等的不同，其微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性具有一定差異.Zhang等［9］研究NH4+-N含量對覆蓋土中微生物甲烷菌的影響，研究表明NH4+-N含量的增加會促進Methylobacter的生長.Liu等［10］研究表明pH值是土壤微生物群落變化的因素之一，然而大部分未測量的變化因素還未被解釋到.據(jù)此，本文考察了國內(nèi)華東、華南和西南地區(qū)的典型生活垃圾填埋場，基于不同地區(qū)垃圾填埋場覆蓋土理化性質(zhì)的不同，對微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性進行初步研究，分析細菌微生物群落結(jié)構(gòu)在自然條件下覆蓋土層中的演變規(guī)律，了解理化性質(zhì)與微生物群落組成之間的關(guān)系，為功能菌篩選及填埋場覆蓋層微生物降解優(yōu)化工藝提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 垃圾填埋場描述

圖1 填埋場地理位置Fig.1 Location of study landfills

選取了4個國內(nèi)規(guī)模較大、填埋較規(guī)范的衛(wèi)生填埋場進行采樣分析，填埋場所處的地理位置不同、氣候環(huán)境各有差異，具有一定的地域代表性.4個生活垃圾填埋場的地理分布情況如圖1所示，山東萊蕪（36°02′N， 117°19′E）生活垃圾填埋場位于山東省中部，泰山東麓，占地面積為20×104m2，日處理量400t，使用期限超過20年［11］；廣東深圳（22°27′N， 113°46′E）下坪生活垃圾填埋場位于深圳市羅湖區(qū)和布吉鎮(zhèn)交接處，庫容量為46.93×106m3，使用期限可達30年以上［12］；上海南匯區(qū)（31°2′N， 121°4′E）老港生活垃圾填埋場占地面積為33.6×105m2，每天消納城市生活垃圾6000～8000t［13］；重慶南岸區(qū)（29°35′N， 106°33′E）長生橋生活垃圾填埋場，占地69.14×104m2，庫容12×106m3，使用期限超過20年［14］.

1.2 土樣的采集和處理

土樣的采集于2013年8月進行，均采集垃圾填埋場覆蓋層10cm以下的土壤.山東萊蕪、廣東深圳下坪、上海老港和重慶長生橋城市生活垃圾填埋場覆蓋土樣分別編號為SD、GD、SH、CQ.用網(wǎng)孔為2mm的篩子將廢物、石頭等物質(zhì)濾去，留下粒徑較小的土樣.每種土樣取部分于50mL的離心管中，置于-20℃冰箱中以備DNA提取和土壤理化性質(zhì)檢測.

1.3 土壤DNA提取

用Mobio PowerSoil? DNA Isolation Kit提取土壤樣品中微生物總基因組DNA.并利用Mobio PowerClean? DNA Clean-Up Kit完成對DNA的純化.純化后的DNA產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.

1.4 PCR擴增

以部分純化后的DNA為擴增模板，用細菌16S rDNA V3～V4區(qū)通用引物（338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'及806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA聚合酶，使用ABI GeneAmp? 9700型PCR儀進行擴增.20μL PCR反應體系中包括各0.8μL的引物，10μL的DNA模板，dNTPs（2.5mmol/L）4μL，0.4μL FastPfu聚合酶，4μL 5×PCR buffer.PCR擴增升溫程序為:94℃預變性5min；94℃變性35s、59℃退火30s、72℃延伸35s，30個循環(huán)，最后于72℃延伸5min，4℃保存.每個樣品3個重復，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測.

1.5 上機測序

樣本定量、DNA序列修飾及驗證和混合文庫后，將其定量稀釋至4～5pmol/L后放于Illumina MiSeq測序儀中測序，使用合成測序法，測定長度2×250bp.

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 原始數(shù)據(jù)處理與樣品序列數(shù)目統(tǒng)計 對16S rDNA高變區(qū)序列采用雙峰（pair-end）測序，測序區(qū)域為V3～V4區(qū).首先將原數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，除去低質(zhì)量序列（50個連續(xù)堿基平均質(zhì)量值低于20）.利用Flash軟件對質(zhì)量控制序列進行對應兩端序列的連接，將連接上的序列進行過濾（連續(xù)相同堿基＜10，最大錯配比率為0.2），最終獲得可分析的序列.

1.6.2 OTU列表生成 應用Qiime，在Usearch軟件平臺中使用uparse方法將序列按照彼此相似性為97%分歸為許多小組，一個小組為一個操作分類單元（OTU），從而得到OTU的代表序列.然后，使用uchime檢測PCR擴增中產(chǎn)生的嵌合體序列并從OTU中去除，再用usearch_global方法將優(yōu)化序列map比對回OTU代表序列，最終得到OTU各樣品序列豐度統(tǒng)計表.

1.6.3 稀釋曲線及多樣性指數(shù) 根據(jù)獲得的OTU數(shù)據(jù)，并利用R軟件以個體數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建稀釋曲線，以該曲線表明樣品的取樣深度.多樣性指數(shù)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，其計算公式如下:

Chao-the chao1estimator:

式中:Schaol為估計的OTU數(shù)；Sobs為實際觀測到的OTU數(shù)；n1為只含有一條序列的OTU數(shù)目；n2為只含有兩條序列的OTU數(shù)目.

式中:ni為含有i條序列的OTU數(shù)目；Srare為含有“abund”條序列或者少于“abund”的OTU數(shù)目；Sabund為多于“abund”條序列的OTU數(shù)目；abund為“OTU”閾值，默認為10.

Shannon-the Shannon index:

式中:Sobs為實際觀測到的OTU數(shù)目；ni為含有i條序列的OTU數(shù)目；N為所有的序列數(shù).

Simpson-the Simpson index:

式中:Sobs為實際測量出的OTU數(shù)目； ni為含有i條序列的OTU數(shù)目；N為所有的序列數(shù).

1.6.4 群落結(jié)構(gòu)分析 對OTU列表中獲得的分類信息與豐度進行整理，在綱和屬分類水平下對各樣品進行物種豐度統(tǒng)計、聚類分析及RDA分析，可得到樣品中群落組成結(jié)構(gòu)、相似性以及群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系.其中RDA（基于線性模型）分析圖是一種基于對應發(fā)展的排序方法，將對應分析與多元回歸分析相結(jié)合，每一步計算均與環(huán)境因子進行回歸，又稱多元直接梯度分析，可以反映群落組成與環(huán)境因子之間的關(guān)系.

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤理化性質(zhì)

表1 土樣理化性質(zhì)Table 1 Soil physical and chemical properties used for this study

土樣SD、GD、SH和CQ理化性質(zhì)分析，如表1所示.TN含量范圍在0.7487～2.119g/kg之間，小于中國東北農(nóng)田黑土TN含量范圍（0.99～4.25g/kg）［10］；TP含量范圍在0.3245～0.9626g/kg之間；有機質(zhì)（OM）含量范圍在9.346～29.09g/kg之間；硝態(tài)氮（N-N）含量和銨態(tài)氮（N-N）含量范圍分別在10.03～45.2mg/kg和5.8～264.8mg/kg之間，顯著高于甘肅某地區(qū)森林土壤N-N含量和N-N含量，分別在0.62～5.89mg/kg和5.71～7.80mg/kg之間［15］；pH值變化范圍在6.87～7.82之間，且波動較小，高于桑椹根際土壤及黑土pH值范圍（5.00～6.60）［10，16］，說明覆蓋土微生物適于中性偏堿性環(huán)境.SD土樣中TN、TP、OM和N-N含量顯著高于其他土樣，而N-N含量明顯低于其他土樣.CQ土樣中TN、N-N和N-N含量顯著高于其他土樣，分別為2.1g/kg，45.1mg/kg，256.2mg/kg，是SH土樣的2.73倍、4.29倍、26.97倍.重慶（CQ）長生橋垃圾填埋場占用農(nóng)田較多，且覆蓋土取自填埋場附近土壤，這可能是其TN、N-N和N-N含量較高的原因之一.而SH土樣中TN和TP含量分別為0.77g/kg和0.848g/kg，均低于我國標準TN和TP含量的一般水平（1g/kg），與先前關(guān)于上海垃圾填埋場覆蓋土理化性質(zhì)的研究結(jié)果一致［17］.此外，從表中還可發(fā)現(xiàn)，土樣中N-N含量普遍高于N-N的含量，從前3個土樣的N--N和N-N含量可看出隨著N-N的增加兩種理化性質(zhì)含量差值減少.這可能是土壤中N-N較高，從而促進了硝化過程，被硝化細菌吸收轉(zhuǎn)化為NN而積累下來［18］.

2.2 Alpha多樣性分析結(jié)果

利用MiSeq平臺對SD、GD、SH和CQ 4種樣品通過邊測序邊合成的方法進行高通量測序，其測序結(jié)果如表2所示.4種樣品分別獲得有效序列數(shù)為12956、15786、8618、21856，樣品的平均覆蓋率為98.92%，且稀釋曲線趨于平臺期，表明該測序效果理想.土壤中微生物種類豐富，4種樣品物種豐富度順序為GD＞SH＞SD＞CQ，表明GD土樣需更多序列來評估它的物種豐富度.CQ土樣測序序列數(shù)量明顯多于其他土樣，但其OTU豐度顯著低于其他樣品，這可能是由于重慶長生橋垃圾填埋場覆蓋土多為周邊黏土［19］，土壤中微生物種類較少.

表2 序列統(tǒng)計及多樣性指數(shù)Table 2 Sequence statistics and diversity index

2.3 群落結(jié)構(gòu)組成分析

總土樣中共檢測到80多種綱分類水平上的微生物，如圖2a所示.在所考察的4種土樣中，Alphaproteobacteria（α-變形桿菌綱）和Betaproteobacteria（β-變形桿菌綱）均為優(yōu)勢菌，所占比例范為分別為12.67%～25.54%，14.35%～18.88%，同時也是黑土中的優(yōu)勢菌群，約占20%［10］. Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria是土壤中重要的2-甲基-4-氯苯氧乙酸（MCPA）降解菌群［20］，且參與了農(nóng)業(yè)土壤中2，4-二氯苯酚的轉(zhuǎn)化［21］.據(jù)此，4個城市的填埋垃圾中可能含有大量的農(nóng)藥和醫(yī)藥物質(zhì)（含有大量MCPA），從而使2種微生物菌群豐度較高.而Gammaproteobacteria（γ-變形菌桿綱）為SD和SH土樣的優(yōu)勢菌，所占比例分別為18.25%，11.91%，可能是因為SD和SH填埋垃圾中含有較多的油脂物質(zhì)［22］.此外，圖2a中Actinobacteria（放線菌綱）為GD和SH土樣的優(yōu)勢菌，所占比例約為16%；Sphingobacteria（鞘脂桿菌綱）為CQ土樣的優(yōu)勢菌，所占比例約為19.02%.在根際土壤中，Actinobacteria所占比例范圍在15%～27%之間，而Sphingobacteria只約占2%［23］.

屬分類水平上共檢測到460多種微生物，如圖2b所示.Sphingomonas（鞘氨醇單包菌屬）為SD、GD和SH 3種土樣的優(yōu)勢菌，分別占7.25%、10.67%、11.30%.它是清理土壤中有毒物質(zhì)最有效的微生物群類之一，能夠降解芳香化合物（如萘、聯(lián)苯、甲苯、二甲苯、甲酚、氧芴等）和聚乙烯醇等［24］，且芳香族化合物是土壤氣體中主要的揮發(fā)性有機物，占71.5%［25］.有許多研究者從土壤中分離出不同種類的Sphingomonas.Srinivasan等［26］于2011年從位于韓國科技技術(shù)學院的池塘附近土壤中分離出了Sphingomonas屬的兩株菌PB196T和PB62T，但在垃圾填埋場覆蓋土中分離得到Sphingomonas尚未見報道.

由于城市生活垃圾分類不均等原因，填埋場中垃圾組成十分復雜，主要含有裝飾品、食物殘渣、塑料、紡織品、玻璃等，其中纖維素物質(zhì)占總垃圾量的40%～70%［27］.在填埋過程中，生活垃圾會放出大量惡臭物質(zhì)，嚴重污染周邊環(huán)境.其中H2S最普遍，且最典型，占微量填埋氣污染物的90%以上［28-29］.有研究表明硫氧化細菌（SOB）如Thiobacillus（硫桿菌屬）、Halothiobacillus（鹽硫桿菌屬）和Bradyrhizobium（慢生根瘤菌屬）為中國亞熱帶地區(qū)垃圾填埋覆蓋土中的優(yōu)勢菌群，且土壤中的有機含量對這些微生物活性具有較大影響［30］.從圖2b中也可發(fā)現(xiàn)，SD土樣中含有11.38%的Thiobacillus，為主要優(yōu)勢菌，且在表3中，OM與Alphaproteobacteria （r=-1.00， P＜0.001）具有明顯的負相關(guān)性，與Betaproteobacteria （r=0.8，P=0.2）具有顯著的相關(guān)性，這可能是因為山東萊蕪城市供熱和天然氣的逐漸推廣和使用，生活垃圾組成成分中的有機物含量增多，致使生物氣中含有大量的硫化物.從圖2b中還可知， Oxalobacter （草酸桿菌屬）和Sandaracinus（橙色菌屬）為CQ土樣的優(yōu)勢菌，分別占12.77%、18.11%，但相關(guān)的文獻報道還較少.從屬分類水平上的微生物群落組成圖可知，甲烷氧化菌并不是4種覆蓋土樣的優(yōu)勢菌，這與Alphaproteobacteria中的甲烷氧化菌為主要優(yōu)勢菌的結(jié)論具有差異［31］.

圖2 綱和屬分類水平下的微生物群落組成Fig.2 Composition of bacterial community at class and genera levels

2.4 環(huán)境因素對微生物群落的影響

圖3 OTU分類水平下的heatmapFig.3 Rainbow color percentage heatmap for OTU level

2.4.1 群落組成的相似性分析 樣品中前100個OTU豐度比例，如圖3所示.從圖3可看出，不同地區(qū)OTU相對豐度明顯不同，其中OTU1017和OTU2028在CQ土樣中相對豐度明顯高于其他土樣，分別為13.52%、19.76%；OTU1124和OTU101在SD土樣中相對豐度高于其他土樣，分別為9.11%、15.69%；OTU813在GD土樣中相對豐度最高，為9.57%；OTU59和OTU1906在SH土樣中相對豐度高于其他土樣，分別為11.62%、10.11%.從圖中樣品間聚類關(guān)系樹可知GD和SH土樣間序列的進化關(guān)系相近，而CQ土樣與其他土樣間的序列進化關(guān)系較遠.這可能是由于兩地區(qū)的TN含量相似，有研究表明垃圾填埋土中TN與土壤中微生物酶的活性具有明顯的相關(guān)性，而酶的活性與微生物數(shù)量具有顯著的相關(guān)性（r=0.98302，P＜0.001）［1］.

2.4.2 環(huán)境因子與優(yōu)勢菌群的相關(guān)性分析 土壤中的各種物質(zhì)會抑制或促進相應微生物的生長，使優(yōu)勢菌群發(fā)生相應變化.Im等［31］研究表明N含量的增加會減少甲烷氧化菌群的多樣性，特別是I型甲烷氧化菌，而NH4Cl和KNO3的加入會顯著增加甲烷氧化菌群豐度.此外，土壤中有機磷和無機磷的加入也能增加微生物的活性［32］.相關(guān)性分析能夠初步的反應理化性質(zhì)等環(huán)境因素對菌群豐度的影響，如表3所示.從表中發(fā)現(xiàn)TN和TP含量與3種優(yōu)勢菌群的相對豐度具有密切關(guān)系，Deltaproteobacteria和Gammaproteobacteria相對豐度分別與TN（r=1.00，P＜0.001）和TP（r= 1.00， P＜0.001）具有明顯的正相關(guān)性，而Gemmatimonadetes相對豐度與TN（r=-1.00，P＜0.001）具有明顯的負相關(guān)性，但其相對豐度與TP（r=-0.40，P=0.6）關(guān)聯(lián).同樣地，土樣中OM、N-N、N-N含量與一些優(yōu)勢菌群的相對豐度也有密切關(guān)系.Actinobacteria、Alphaproteobacteria、Anaerolineae相對豐度分別與N-N（r=1.00，P＜0.001）、OM（r=1.00，P＜0.001）和N-N（r=1.00，P＜0.001）含量呈正相關(guān).對于N-N，相關(guān)研究表明N-N含量對Betaproteobacteria中的Burkholderia（伯克氏菌屬）、Azospiril（固氮螺菌屬）等固氮微生物有顯著的影響［33］，表3中也發(fā)現(xiàn)Betaproteobacteria相對豐度與N-N（r=1.00，P＜0.001）密切正相關(guān)，且Sphingobacteria（鞘氨醇桿菌綱）相對豐度與N-N（r=1.00，P＜0.001）也具有密切的正相關(guān)性.而主要的-N匯為自養(yǎng)硝化細菌［34］，Nitrosomonas（亞硝化單胞菌屬）、Nitrosospira（亞硝化螺菌屬）等屬于Betaproteobacteria的硝化細菌與N-N具有一定的相關(guān)性，而在本研究中發(fā)現(xiàn)Betaproteobacteria（r=0.20，P=0.80）與N-N無明顯相關(guān)性.

表3 細菌種群與理化性質(zhì)全氮（TN）、全磷（TP）、有機質(zhì)（MO）、銨態(tài)氮（N-N）和硝態(tài)氮（N-N）含量的相關(guān)性分析Table 3 The correlation （r） and significance （P） values of linear regressions between relative abundances of bacterial groups and soil total nitrogen （TN）， total phosphorus （TP）， organic matter （OM）， ammonium nitrogen （N-N） and nitrate nitrogen （N-N）

表3 細菌種群與理化性質(zhì)全氮（TN）、全磷（TP）、有機質(zhì)（MO）、銨態(tài)氮（N-N）和硝態(tài)氮（N-N）含量的相關(guān)性分析Table 3 The correlation （r） and significance （P） values of linear regressions between relative abundances of bacterial groups and soil total nitrogen （TN）， total phosphorus （TP）， organic matter （OM）， ammonium nitrogen （N-N） and nitrate nitrogen （N-N）

種群 TN TP OM NH4+-N NO3--N r P r P r P r P r P Acidobacteria -0.8 0.2-0.2 0.80 1-0.8 0.2-0.4 0.6 Actinobacteria -0.8 0.2 0 1 -0.8 0.2 -0.2 0.8 -1 ＜0.001 Alphaproteobacteria -0.6 0.4 -0.4 0.6 -1 ＜0.001 0.4 0.6 -0.8 0.2 Anaerolineae -0.4 0.6 0.4 0.6 0.4 0.6 -1 ＜0.001 -0.2 0.8 Betaproteobacteria 0.8 0.2 0 1 0.8 0.2 0.2 0.8 1 ＜0.001 Cytophagia 0.4 0.6 0.4 0.6 -0.4 0.6 0.6 0.4 -0.2 0.8 Deinococci -0.2 0.8 0.8 0.2 0.2 0.8 -0.8 0.2 -0.4 0.6 Deltaproteobacteria 1 ＜0.001 0.4 0.6 0.6 0.4 0.4 0.6 0.8 0.2 Gammaproteobacteria 0.4 0.6 1 ＜0.001 0.4 0.6 -0.4 0.6 0 1 Gemmatimonadetes -1 ＜0.001 -0.4 0.6 -0.6 0.4 -0.4 0.6 -0.8 0.2 Spartobacteria 0.8 0.2 0.2 0.8 0 1 0.8 0.2 0.4 0.6 Sphingobacteria 0.8 0.2 0 1 0.8 0.2 0.2 0.8 1 ＜0.001

2.4.3 環(huán)境因子與樣品之間的相關(guān)性分析 4種樣品因環(huán)境因素的不同而聚類或分離的情況，如圖4所示.從圖4中可看出，SD和CQ與SH、GD土樣的微生物組成差異較大，土樣都分散于第一、二、四象限內(nèi).這可能是因為CQ土樣N-N含量顯著的高于其他土樣，且N-N含量顯著高于SH和GD土樣.而對于SD樣，TN、TP和OM含量是造成該土樣與其他土樣分離的主要因素，其TN、TP和OM含量明顯高于其他土樣.Xiong等［35］研究表明土壤參數(shù)（TN、TC和水分）對土壤細菌群落組成的變化為37.52%. SH、GD土樣的微生物組成比較相似，主要聚集在第一象限中，主要原因可能是SH、GD土樣TN、TP、OM和N-N的含量適中，N-N含量明顯少于其他2種土樣.不同理化性質(zhì)對不同覆蓋土微生物群落組成的影響不同.有研究表明環(huán)境的異質(zhì)性和擴散限制是決定微生物地理分布格局的兩個主要的因素［36］，上述結(jié)果突出了覆蓋土中的環(huán)境異質(zhì)性對微生物地理分布的影響.

圖4 基于土樣和環(huán)境因子的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis（RDA）based on binary data and environmental factors of the soil samples

3 結(jié)論

3.1 利用高通量測序技術(shù)分析樣品，平均覆蓋率為98.92%，測序結(jié)果能夠全面的反映樣品組成及結(jié)構(gòu). 多樣性指數(shù)可得4種樣品的物種豐富度順序為GD＞SH＞SD＞CQ.

3.2 垃圾填埋場覆蓋土中優(yōu)勢菌綱為Alphaproteobacteria（α-變形桿菌綱）和Betaproteobacteria（β-變形桿菌綱），所占比例范圍分別為12.67%～25.54%，14.35%～18.88%. Sphingomonas（鞘氨醇單包菌屬）為SD、GD和SH 3個城市覆蓋土中的優(yōu)勢菌屬，分別占7.25%、10.67%、11.30%.

3.3 覆蓋土中Deltaproteobacteria（德耳塔變形桿菌綱）和Gammaproteobacteria（γ-變形菌桿綱）相對豐度分別與TN（r=1.00，P＜0.001）和TP（r= 1.00， P＜0.001）呈正相關(guān)關(guān)系，且TN、TP和OM含量可能為SD土樣區(qū)別于其他土樣群落組成的主要因素.

李 俊，舒為群，陳濟安，等.垃圾填埋場土壤酶活性與化學性質(zhì)和微生物數(shù)量的關(guān)系研究 ［J］. 生態(tài)學雜志， 2005，24（9）: 1043-1047.

Lakhouit A， Schirmer W N， Johnson T R， et al. Evaluation of the efficiency of an experimental biocover to reduce BTEX emissions from landfill biogas ［J］. Chemosphere， 2014，97:98-101.

張云茹，邢志林，趙天濤，等.可降解TCE的甲烷氧化菌16S rDNA與pmoCAB基因簇序列分析 ［J］. 生物工程學報， 2014，30（12）:1-12.

韓 睿，陳來生，李 莉，等.PCR-DGGE研究青海農(nóng)村戶用沼氣池微生物群落結(jié)構(gòu) ［J］. 中國環(huán)境科學， 2015，35（6）:1794-1804.

薛圓圓，孫寶盛，杜 江，等.貧營養(yǎng)條件下IAMBR污泥微生物群落結(jié)構(gòu)的演變 ［J］. 中國環(huán)境科學， 2015，35（3）:839-845.

Kim T G， Moon K E， Yun J， et al. Comparison of RNA- and DNA-based bacterial communities in a lab-scale methane degrading biocover ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（7）:3171-3181.

Su Y， Xia F F， Tian B H， et al. Microbial community and function of enrichment cultures with methane and toluene ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2014，98（7）:3121-3131.

Zhao T T， Zhang L J， Zhang Y R， et al. Characterization of methylocystis strain JTA1isolated from aged refuse and its tolerance to chloroform ［J］. Journal of Environmental Sciences， 2013，25（4）:770-775.

Zhang X， Xia F F， Su Y， et al. Effects of ammonium on the activity and community of methanotrophs in landfill biocover soils ［J］. Systematic and Applied Microbiology， 2014，37:296- 304.

Liu J J， Sui Y Y， Yu Z H， et al. High throughput sequencing analysis of biogeographical distribution of bacterial communities in the black soils of northeast China ［J］. Soil Biology and Biochemistry，2014，70:113-122.

鄭憲忠，盧 華，魏春玲.生活垃圾填埋場滲瀝液收集系統(tǒng)的設(shè)計思路探討-以萊蕪市銅山生活垃圾衛(wèi)生填埋場為例 ［J］. 中國建設(shè)信息， 2010，（2）:68-69.

胡志毅.深圳下坪垃圾填埋場滑坡成因分析及綜合治理 ［J］. 有色冶金設(shè)計與研究， 2002，23（4）:68-74.

Ding Z H， Tang Q H， Liu C E， et al. Distribution and ecological effect of mercury in Laogang landfill， Shanghai， China ［J］. Journal of Environmental Suences， 2007，19:200-204.

王渝昆，劉勝初.重慶長生橋垃圾衛(wèi)生填埋場雨污分流系統(tǒng)工程研究［J］. 環(huán)境衛(wèi)生工程， 2008，16（3）:53-58.

張彩霞.新一代高通量測序技術(shù)研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對環(huán)境條件的響應 ［D］. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學， 2012.

Yu C， Hu X M， Deng W， et al. Changes in soil microbial community structure and functional diversity in the rhizosphere surrounding mulberry subjected to long-term fertilization ［J］. Applied Soil Ecology， 2015，86:30-40.

梁 晶，王肖剛，張慶費，等.上海市垃圾填埋場土壤特性研究 ［J］. 南京林業(yè)大學學報， 2013，37（1）:147-152.

鄭林雪，李 軍，胡家瑋，等.同步硝化反硝化系統(tǒng)中反硝化細菌多樣性研究 ［J］. 中國環(huán)境科學， 2015，35（1）:116-121.

楊運華，郭緒元.重慶主城區(qū)生活垃圾處理及長生橋衛(wèi)生填埋場設(shè)計小結(jié) ［J］. 有色金屬， 2003，55:99-103.

Liu Y J， Liu H J， Drake Arold L. Alphaproteobacteria dominate active 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid herbicide degraders in agricultural soil and drilosphere ［J］. Environmental Microbiology，2011，13（4）:991-1009.

Anja D，Marcus A.Agricultural soil and drilosphere as reservoirs of new and unusual assimilators of 2，4-dichlorophenol carbon ［J］. Environmental Microbiology， 2014，16（1）:84-100.

韓亞飛，伊文慧，王文波，等.基于高通量測序技術(shù)的連作楊樹人工林土壤細菌多樣性研究 ［J］. 山東大學學報， 2014，49（5）:1-6.

Gao Y C，Wang J N，Guo S H，et al.Effects of salinization and crude oil contamination on soil bacterial community structure in the Yellow River Delta region， China ［J］. Applied Soil Ecology，2015，86:165-173.

胡 杰，何曉紅，李大平，等.鞘氨醇單胞菌研究進展 ［J］. 應用與環(huán)境生物學報， 2007，13（3）:431-437.

Tassi F， Montegross G， Vaselli O， et al. Degradation of C2-C15volatile organic compounds in a landfill cover soil ［J］. Science of TheTotal Environment， 2009，407（15）:4513-4525.

Srinivasan S， Lee J J， Kim M K. Sphingomonas rosea sp. nov. and Sphingomonas swuensis sp. nov.， rosy colored betaglucosidase-producing bacteria isolated from soil ［J］. The Journal of Microbiology， 2011，49（4）:610-616.

Borjesson G， Sarnuelsson J， Chanton J. Methane oxidation in Swedish landfills quantified with the stable carbon isotope technique in combination with an optical method for emitted methane ［J］. Environmental Scienee and Teehnology， 2007，41（19）:6684-6690.

Kim K H， Choi Y J， Jeon E C， et al. Characterization of malodorous sulfur compounds in landfill gas ［J］. Atmospheric Environment，2005，39:1103-1112.

Sorokin D Y， Tourova T P， Panteleeva A N， et al. Desulfonatronobacter acidivorans gen. nov.， sp. nov. and Desulfobulbus alkaliphilus sp. nov.， haloalkaliphilic heterotrophic sulfate-reducing bacteria from soda lakes ［J］. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2012，62（9）: 2107-2113.

Xia F F， Su Y， Wei X M， et al. Diversity and activity of sulphur-oxidizing bacteria and sulphate-reducing bacteria in landfill cover soils ［J］. Letters in Applied Microbiology， 2014，59（1）:26-34.

Im J， Lee S W， Bodrossy L， et al. Field application of nitrogen and phenylacetylene to mitigate greenhouse gas emissions from landfill cover soils: effects on microbial community structure ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2010，89（1）:189-200.

Koutika L S， Crews T E， Ayaga G， et al. Microbial biomass P dynamics and sequential P fractionation in high and low P fixing Kenyan soils ［J］. European Journal of Soil Biology，2013，59:54-59.

李玉潔，李 剛，王麗娟.呼倫貝爾沙地不同植被恢復模式對土壤固氮微生物多樣性的影響 ［J］. 應用生態(tài)學報， 2013，24（6）: 1639-1646.

Boyle S A， Yarwood R R， Bottomley P J， et al. Bacterial and fungal contributions to soil nitrogen cycling under Douglas fir and red alder at two sites in Oregon ［J］. Soil Biology and Biochemistry，2008，40（2）:443-451.

Xiong J B， Liu Y Q， Lin X G， et al. Geographic distance and pH drive bacterial distribution in alkaline lake sediments across Tibetan Plateau ［J］. Environmental Microbiology， 2012，14:2457- 2466.

Lozupone C， Knight R. UniFrac: a new phylogenetic method for comparing microbial communities ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2005，71:8228-8235.

Analysis of bacterial community composition in landfill cover soil.

HE Zhi1， ZHAO Tian-tao1，2*， XING Zhi-lin1，2，YUAN Jiang-hua1（1.School of Chemical Engineering， Chongqing University of Technology， Chongqing 400054， China；2.School of City Construction and Environment Engineering， Chongqing University， Chongqing 400030， China）. China Environmental Science， 2015，35（12）：3744～3753

In this study， the bacterial community composition in 4geographically different location （Shandong Laiwu， SD； Guangdong Shenzhen， GD； Shanghai Laogang， SH； Chongqing Changshengqiao， CQ） was investigated by Illumina MiSeq sequencing targeting V3～V4region of 16S rDNA gene and the link between the bacterial community composition and environmental parameters was analyzed. Results showed that representatives of Alphaproteobacteria and Betaproteobacteria dominated at all 4cover soils， ranging from 12.67%～25.54% and 14.35%～18.88% of the total abundance， respectively. Cover soil of GD had higher bacterial diversity than the others， which suggested by Shannon index （5.52±0.026 Vs 4.76±0.030 of SD， 4.89±0.037 of SH， and 3.43±0.027 of CQ）. Genus Sphingomonas dominated at cover soils of SD、GD and SH， accounting for 7.25%、10.67%、11.30% of the total abundance， respectively. Person correlation suggested that groups of Deltaproteobacteria and Gammaproteobacteria highly correlated to total nitrogen（TN） （r=1.00， P＜0.001） and total phosphorus （TP） （r=1.00， P＜0.001）. Redundancy analysis （RDA） further indicated that TN、TP and organic matter （OM） are the important factors in shaping the bacterial community structure.

Illumina MiSeq sequencing；landfill cover soil；bacterial diversity；bacterial community structure； environmental factors

X505

A

1000-6923（2015）12-3744-10

何 芝（1991-），女，重慶大足人，碩士，主要從事環(huán)境微生物多樣性分析及污染控制研究.

2015-04-16

國家自然科學基金項目（51378522，41502328）；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究項目（cstc2014jcyjA20007）

* 責任作者， 教授， zhaott@cqut.edu.cn